冈田酸诱导SH文档格式.docx
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关键词:
肿瘤抑制蛋白质类;
岗田酸;
tau蛋白质类;
磷酸化;
细胞系;
阿尔茨海默病
ABSTRACT:
ObjectiveTostudythechangeofPTEN(phosphataseandtensinhomologuedeletedfromchromosome10)proteinintheokadaicacid(OA)inducedoftauproteinhyperphosphorylationinSHSY5Ycells.MethodsSHSY5Ycellsweretreatedwith40nmol/LOAfor0,3,6,12,18,24,36,48h,andthenobservedbyinvertedmicroscope.WesternBlottingwasusedtodetectthelevelsofphosphorylatedtauproteinatsiteSer396andthechangeofPTENinSHSY5Ycells.ResultsCellschangedgraduallyaftertreatedwith40nmol/LOAandappearedtypicalmorphologyofAlzheimer'
sdisease(AD).ThelevelsofphosphorylatedtauatsiteSer396wasincreasedafterexposureof3handreachedthemaximumlevelafter18h,thendeclinedtothelevelbelownormalafter48levelsofPTENwasincreasedafterexposureof3handreachedthemaximumlevelafter6h,thendecreasedtothelevelbelownormalafter18h.ConclusionIntheOAinducedoftauproteinhyperphosphorylationinSHSY5Ycells,thelevelsofPTENprotein,showingatrendofdramaticincreaseandthendecreasealso.
KEYWORDS:
tumorsuppressorproteins;
okadaicacid;
tauproteins;
phosphorylation;
cellline;
Alzhermer'
sdisease
阿尔茨海默病(AD)是一种慢性、进行性神经变性疾病。
AD的病因和发病机制尚未完全说明,目前普遍以为tau蛋白的过度磷酸化在增进AD患者神经细胞退行性变性中起着关键作用。
PTEN(phosphataseandtensinhomologuedeletedfromchromosome10)是一种抑癌基因表达的蛋白,是细胞信号转导的重要调控分子,可负调控PI3K/Akt介导的信号转导通路[1]。
PTEN在神经系统中的作用正日趋受到关注[23],但其在AD发生进展中的作用尚不明了。
有报导,通过抑制PI3K/Akt通路可增进AD病变,而激活PI3K/Akt通路那么有对抗β淀粉样蛋白致AD样作用[45]。
PTEN通过降低PIP3水平,拮抗了PI3K/Akt活性[1],因此推测PTEN在AD发生进展中可能存在转变。
新近有报导,AD患者尸身脑内PTEN表达减弱或缺失[67],这与上述相关研究和推测不相吻合。
笔者采纳冈田酸(okadaicacid,OA)诱导SHSY5Y细胞为AD样细胞研究模型,观看实验性AD发生进展进程中SHSY5Y细胞形态、tau蛋白磷酸化及PTEN蛋白水平的动态转变。
1材料与方式
材料
细胞株
人神经母细胞瘤细胞SHSY5Y(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所)。
试剂
OA(美国Sigma公司);
DMEM/F12培育液(美国Gibco公司);
βactin多克隆抗体、tau[pS396]多克隆抗体、PTEN单克隆抗体、WesternBlot化学发光检测试剂盒(美国SantaCruze公司)。
要紧仪器
CO2培育箱(美国FormaScientific公司);
倒置显微镜(CK40型,日本Olympus公司)。
方式
细胞培育
SHSY5Y细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培育液于37℃、体积分数为的CO2培育箱中培育,用%胰蛋白酶消化单层培育细胞,待细胞间隙变得比较明显、细胞突起有所回收时中止消化,DMEM/F12培育液吹打成单个细胞悬浮液,隔3~4d传代1次。
分组
未加OA的SHSY5Y细胞(0,3,6,12,18,24,36,48h)为对照组,OA(40nmol/L)作用SHSY5Y细胞(0,3,6,12,18,24,36,48h)为模型组。
细胞形态观看
SHSY5Y细胞通过处置后,倒置显微镜下观看细胞形态。
蛋白免疫印迹
SHSY5Y细胞通过处置后,弃培育液,用预冷的PBS清洗2次,加入细胞裂解液在冰面上裂解20min,用小刮匙刮下细胞,置于Appendorf管中,12000r/min、4℃离心10min,吸取上清。
Bradford法进行蛋白定量。
10%SDSPAGE电泳(浓缩胶:
恒压80V,电泳约30min;
分离胶:
恒压120V,约1h),用湿式转移法转至NC膜,用含5%脱脂奶粉的TBST4℃封锁留宿。
加入用TBST稀释的PTEN单克隆抗体(1∶1000稀释),室温孵育6h。
TBST漂洗后加入抗鼠二抗(1∶2000稀释),室温孵育1h。
化学发光显色,X射线胶片曝光。
抗体洗脱液洗脱抗体(50℃,30min)。
继续用含5%脱脂奶粉的TBST4℃封锁留宿。
加tau[pS396]多克隆抗体(1∶1000稀释),室温孵育6h,TBST漂洗后加入抗兔二抗(1∶4000稀释),室温孵育1h。
以βactin作为内参照,实验重复4次。
半定量分析
采纳条带密度分析法,将模型组各时刻点蛋白条带密度值除以对应的βactin蛋白条带密度值,获各蛋白条带相对密度值,该值除以相应的0h值,获各自的蛋白相对量。
统计学处置
测定值以x±
s表示,采纳SPSS统计分析软件包分析。
2结果
OA对SHSY5Y细胞形态的阻碍
OA未孵育时(0h)细胞铺展良好,突起多而粗大,胞体呈多角形或不规那么形。
OA孵育6h后,少量细胞胞体开始变圆,突起回缩;
18h后,大部份细胞胞体变圆,突起回缩乃至消失;
48h后,多数细胞呈悬浮生长,胞体变圆,突起消失,部份细胞死亡(图1)。
随OA孵育时刻增加,SHSY5Y细胞呈进行性损伤变性。
OA对SHSY5Y细胞tau蛋白磷酸化的阻碍
对照组Ser396位点磷酸化tau蛋白水平在观测时刻点未见转变,模型组Ser396位点磷酸化tau蛋白水平与所得比值见图2。
40nmol/LOA作用于细胞,Ser396位点磷酸化tau蛋白在3h开始升高,18h达顶峰,以后下降,48h低于基础水平,βactin蛋白水平维持不变。
OA可诱导SHSY5Y细胞后tau蛋白磷酸化程度先升高后降低。
PTEN蛋白水平在OA诱导SHSY5Y细胞tau蛋白过度磷酸化中的转变
对照组PTEN蛋白和Ser396位点磷酸化tau蛋白在观测时刻点未见转变;
模型组PTEN和Ser396位点磷酸化tau蛋白的转变及所得比值见图2。
40nmol/LOA孵育细胞,Ser396位点磷酸化tau蛋白在3h开始升高,18h达顶峰,以后下降,48h低于基础水平;
而PTEN蛋白于3h开始升高,6h达顶峰,以后下降,18h后低于基础水平。
在OA诱导SHSY5Y细胞进程中,PTEN蛋白水平存在着转变,呈急剧上升随后降低的趋势。
3讨论
AD样细胞研究模型的选择
OA是一种蛋白磷酸酶抑制剂,可抑制磷酸酶的活性,使tau蛋白高度磷酸化[8]。
SHSY5Y细胞具有神经元的形态特点,且tau蛋白含量较高,调剂tau蛋白磷酸化的蛋白激酶和蛋白磷酸酶的含量也较高[9]。
体内外实验说明,OA能诱导tau蛋白发生磷酸化,可用于成立研究AD的细胞模型[1012]。
笔者采纳40nmol/LOA作用于SHSY5Y细胞可引发细胞形态的改变,并可诱导tau蛋白磷酸化,与文献报导相吻合[10,13]。
AD样细胞研究模型的发生进展
为便于分析AD发生进展中PTEN蛋白水平的转变,依照细胞形态及磷酸化tau蛋白的改变,笔者试将OA诱导的AD样发生进展进程进行分期。
OA处置SHSY5Y细胞6h形态未见明显改变,但磷酸化tau蛋白于3h开始升高,6h进一步升高,试将此6h时刻点作为反映本实验性AD诱导期;
OA处置SHSY5Y细胞18h形态明显改变,且磷酸化tau蛋白达顶峰,现在刻点作为反映实验性AD形成期;
OA处置SHSY5Y细胞48h显现明显死亡现象,现在刻点反映实验性AD终末期。
AD样细胞研究模型发生进展中PTEN的转变及其可能机制
PTEN可特异性裂解PI3K的产物PtdIns(3,4,5)P3的D3磷酸基,使其转变成PIP2,从而降低PIP3的水平,对抗PI3K的作用[1]。
PIP3水平的升高可激活丝/苏氨酸激酶Akt,而GSK3β是Akt重要的效应分子。
Akt可磷酸化GSK3βSer9,从而抑制其活性。
GSK3β那么是引发tau蛋白磷酸化重要的蛋白激酶。
由此可见,tau蛋白的磷酸化与PI3K/Akt信号通路抑制有关。
据报导,抑制PI3K/Akt通路可增进AD病变[4],而激活PI3K/Akt通路那么有对抗β淀粉样蛋白致AD样作用[5]。
本研究说明,OA孵育SHSY5Y细胞6h,PTEN显著升高并达顶峰,磷酸化tau蛋白处于上升时期但未达顶峰,推测PTEN蛋白水平升高可能通过抑制PI3K/Akt,增强GSK3β,从而增进tau蛋白过度磷酸化,提示PTEN在AD诱导产生中可能发挥作用。
Griffin等报导,AD患者尸身大脑皮层、海马中PTEN蛋白水平下降[6];
Rickle等报导,AD患者尸身大脑内侧颞叶皮质PTEN水平未见显著转变,而PTEN免疫阳性反映锥体细胞数那么显著下降[7]。
笔者观看到,OA孵育细胞18h,即AD形成期,PTEN低于基础水平,而磷酸化tau蛋白显著升高达顶峰,与上述文献报导吻合。
可是,在AD形成期PTEN与磷酸化tau蛋白如何关联,有待进一步探讨。
至于OA孵育细胞48h,即AD终末期,PTEN和tau蛋白磷酸化均低于基础水平,笔者以为与细胞严峻损伤变性有关。
在OA诱导SHSY5Y细胞tau蛋白发生过度磷酸化进程中,PTEN蛋白存在转变,在诱导期急剧上升,提示PTEN在AD诱导产生中可能发挥作用。
可是,PTEN与tau蛋白过度磷酸化的详细关联规律,PTEN在AD发生进展中的作用及其意义有待于进一步探讨。
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