铅离子与牛血清蛋白相互作用光谱分析大学课程设计方案Word文档下载推荐.docx
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Inthispaper，TheinteractionofPb2+andbovineserumalbumin（BSA>
wasstudiedbyfluorescence，UVSpectrum，andinfraredspectroscopy.Itisexploredtheimpactofdifferentexperimentalconditions:
pH，theconcentrationofthebovineserumalbumin，theconcentrationoftheleadion.UVSpectrumshowsthatPb2+fromsacompoundwithBSA.TheresultsrevealedthatPb2+causedthefluorescencequenchingofBSA.InfraredspectroscopyshowstheinteractionbetweenPb2+andBSAcouldresultinthechangeofconformationofBSA.ThushelixstructureinBSAwasdecreasedtheβ-sheetwasincreased.
Keywords：
leadion；
bovineserumalbumin。
fluorescencespectrometry；
UVSpectrum；
infraredspectroscopy
1.引言………………………………………………………………………..4
1.1紫外光谱……………………………………………........................5
1.2荧光光谱……………………………………………........................5
1.3红外光谱法…………………………………………………………..8
2.实验部分…………………………………………………………………...10
2.1实验试剂与仪器…………………………………………………….10
2.1.1实验试剂……………………………………………………….10
2.1.2实验仪器………………………………………………………10
2.2实验试剂的配制………………………………………..………...…10
2.2.1缓冲液的配制………………………………………………....10
2.2.2BSA溶液的配制……………………………………………….10
2.2.3铅离子溶液的配制…………………………………………....10
3.结果与讨论…………………………………………………….................13
3.1紫外光谱图……………………………………………………….....13
3.1.1不同pH条件下体系的紫外光谱图…………..…………..13
3.1.2不同浓度BSA下体系的紫外光谱图……………………..14
3.1.3不同浓度硝酸铅条件下的紫外光谱图……………………13
3.1.4离子强度对体系紫外光谱的影响………………………....15
3.2荧光光谱图……………………………………………………........16
3.3红外光谱图…………………………………………………………………………………………………17
3.3.1铅离子存在的红外光谱图…………………………………..19
3.3.2体系的红外二阶导数图……………………………………...19
4.结论……………………………………………………............................21
参考文献…………………………………………………………...................21
致谢………………………………………………........................................22
1.引言
在生物体中，蛋白质是极为重要的生命物质，在生命的运动和发展中起着关键的作用。
有关蛋白质的组成、构象及与小分子相互作用机理的研究，是目前从事化学、化学生物学、生命科学、药学和临床医学科技工作者共同关注和感兴趣的课题【1】。
血清白蛋白是血浆中含量最丰富的载体蛋白，它能与许多内源性物质和外源性药物等有效结合，形成结构更为复杂的复合物，直接或间接地发挥着调控蛋白质的作用【2-4】，影响蛋白质的生理作用。
因此关于小分子与蛋白质等生物大分子相互作用的研究引起了人们的极大关注。
蛋白质种类繁多，目前已经发现的蛋白质数量已达几百万种，但是各种蛋白质均是含有多个配位原子<
如：
N、O、S，有些蛋白质还含有P等）的大分子多齿配体，因此能够很容易地与金属离子或其小分子配合物相互作用，并且对应不同的光谱特征。
蛋白质的功能与其结构构象密切相关，有什么样的结构就有什么样的功能，反之同样成立。
蛋白质某种生物功能的激活或维持往往与一些生命元素或有益元素的作用密切相关；
同时，蛋白质某种生物功能或活性的减弱或消失也往往是受某种沾染元素或有害元素的影响，这些元素大多数是金属元素，它们通过与相关蛋白质的作用来稳定或改变蛋白质的结构构象，从而达到控制或影响蛋白质功能的目的。
因此可以说，研究金属元素同蛋白质的相互作用特别是多种不同金属元素在近生理环境条件下同蛋白质的相互作用及作用前后蛋白质结构构象的变化，阐明某种金属元素的作用机理，从而为从分子水平上研究微量元素对人体健康的影响、预防中毒及环境污染治理等有重要意义。
牛血清蛋白（bovineserumalbumins，BSA>
是常用的研究蛋白，因为它是血浆中含量最丰富的载体蛋白，能与体内许多内源性物质及外源性物质作用，且这类蛋白的结构己用X光测定【5-6】牛血清蛋白和人血清蛋白十分相近，两者氨基酸的排列顺序也极其相似，牛血清蛋白是一种含多个配位基团的生物有机大分子，可以与金属离子配位。
所以对牛血清蛋白的分析具有十分重要的理论和现实意义。
金属离子同蛋白质的相互作用除受蛋白质本身刚性和柔性结构影响外，还受金属离子电荷、半径、配位构型等因素影响，如Zn常与Cys、His以配位键形成四面体结构。
另外，反应温度、反应时间、离子浓度<
强度）、酸度、缓冲液等均影响蛋白质与金属离子的相互作用。
特别值得注意的是离子浓度对反应的影响，浓度过高或过低都不会达到理想的实验目的，因为无论是对人体有益的还是有害的元素，它们在体内都有一个相当恒定的浓度范围，任何一种元素浓度过高或过低都将对人体产生不良影响，而且蛋白质本身还存在盐析作用，因此在实验过程当中应该选择一适当的离子浓度范围。
铅在自然界中分布极广，几乎所有的矿物中都含有铅。
生活中常见的是铅离子，铅是进行工业生产、科学研究不可缺少的物质之一，在人类的生产生活中起着重要的作用。
但是铅又是对人类和高等生物中最具危害的有毒元素之一，铅污染问题己给人类造成了多种灾害。
铅在自然界中以多种形式存在。
铅的形态不同，产生的毒性也不同。
研究表明，无机铅可通过生物甲基化、乙基化等反应生成相应的有机铅，而有机铅可被动植物吸收，并通过食物链富集，最终危害人类健康。
铅即可造福人类，又会造成环境的污染。
因此，寻求高灵敏度和高选择性的检测方法对其进行检验，具有理论和实际的意义。
蛋白质与金属离子相互作用的研究早在50年代就已开始进行。
自从60年代以来，许多科学工作者采用晶体结构分析和配位化学方法研究了一些金属蛋白和金属酶的结构，配合生物活性研究推测了它们的作用机理，这些研究共同构成了生物无机化学的主要研究方面。
自从80年代以来，各种检测技术及计算机技术的发展为人们研究蛋白质同金属离子的相互作用打开了一个新的局面，这方面我国的生物无机化学家王夔、申泮文等已作了大量的研究工作，并有多部相关的专著介绍具体的实验。
常用到的检测方法如下：
1.1.紫外光谱法
紫外吸收光谱分析是了解溶液中蛋白质分子构象的一种常规方法。
牛血清蛋白分子大概在280nm左右有一强吸收峰。
由于蛋白质不同区域有特异性的结合，结合药物后会导致上述特征吸收峰的位移，因而在牛血清蛋白溶液中加入很少量的络合物，观察牛血清蛋白的特征吸收峰是否发生位移或者峰值变化可粗略知道络合物是否与BSA发生了作用。
血清蛋白可以吸收紫外光，当与小分子物质发生作用时就会相应的出现吸收峰位移或者谱峰宽度的变化。
杜娜娜等结合紫外吸收光谱和荧光光谱的方法，研究了异烟肼<
INH）与BSA之间的相互作用，讨论了INH对BSA的荧光猝灭机制【7】。
吕桂英等采用紫外一可见分子吸收光谱法研究了吐温2O存在下牛血清白蛋白与镉试剂1B的相互作用并建立了蛋白质检测的分析方法且将之应用于牛血清白蛋白产品的检验【8】。
张红梅等利用紫外光谱研究了不同pH值下微乳体系中稀土Nd3+离子与牛血清白蛋白（BSA>
的作用，初步探讨了微乳体系中Nd3+与牛血清白蛋白作用的机理【9】。
1.2荧光光度法
荧光光谱法具有灵敏度高、选择性好、用量少等优点。
利用荧光光谱法测定药物、稀土金属和牛血清蛋白作用的报道比较多【10-15】。
罗红斌等人应用荧光光谱研究了岩白菜素与牛血清白蛋白（BSA>
分子间的相互作用，研究表明岩白菜素与BSA反应的结合常数为2.083xl04，结合位点数为1【16】。
李丹等采用荧光和紫外吸收光谱法，研究了利尿脱水药山梨醇（Sorbito1>
与牛血清白蛋白（BSA>
的相互作用，求出了在不同温度下反应的结合常数分别7.4×
10-5（25oC>
和1.7×
10-4（37℃>
，结合位点数为1【17】。
吴刚坷等在模拟人体生理环境下，用荧光分光光度法及紫外一可见分光光度法研究了解热镇痛药对乙酰氨基酚（简写作PTL>
与牛血清蛋白（（BSA>
之间的相互反应，实验结果发现:
由于非辐射能量转移引起的荧光猝灭，BSA的荧光强度因与PTL相互之间的结合反应而明显降低。
按Stern-Volmer方程和Lineweaver-Burk方程对所得实际数据进行了处理，求得此结合反应的静态平衡常数（KLB>
为2.592X103molL-1（297K>
，其结合位位置距212位色氨酸1.94nm，根据结合反应的热力学参数，推断PTL与BSA之间的结合力为硫水作用力【1】。
荧光光谱研究的内容与方法如下:
（1>
结合部位的确定
血清白蛋白的三维晶体结构已探明，有3个类似的结构域[18]:
Sitel，Sitell和Site1H.每个结构域又含有A与BZ个亚结构域，以槽口相对的方式形成圆筒状结构。
大多数药物在血清白蛋白上的结合部位为Sitel及Sitdl。
用荧光法确定药物分子在血清白蛋白上的结合部位常用以下方法。
（2>
用具有已知特定部位的探针来做代替[4-7]
某些荧光探针对蛋白质不同区域有特异性的结合，根据药物加入后对荧光探针的影响可以确定药物结合部位.已知Sitel的探针有:
华法令（Warfarin>
，苯基保泰松（Phnylbutazone>
，丹磺酞胺（dansy-lamide>
等。
Site11的探针有:
布洛芬（ibuprofen>
，氟灭酸（flufenamicacid>
（3>
通过Forster能量转移理论来求药物与色氨酸残基之间的距离[19-22]
蛋白质的内源荧光主要是色氨酸发出的。
利用Forster能量转移理论，可以求出和蛋白质作用的药物与色氨酸残基之间的距离，由此推测药物与蛋白质结合的空间部位。
能量转移作用可以发生在药物一蛋白质复合物内部，也可以发生在药物与蛋白质分子之间。
在后一种情况时，求得的药物与色氨酸残基之间的距离表示分子扩散过程中药物分子与色氨酸残基的最近距离[22]。
（4>
结合位点数与结合常数的测定
Scatchard作图法是研究生物大分子与有机小分子结合反应的经典方法。
此法在应用时须知道反应体系中游离态药物的浓度，这一点用荧光法测定时常不易做到，而且Scatchard作图法所得结果往往不理想。
因此，在研究药物分子与蛋白质的结合反应中，Scatchard作图法应用不多。
张保林等曾用此法研究了蒽醌及黄酮类化合物与人血清白蛋白的结合反应[11]。
蛋白质与药物分子发生反应时，可引起体系荧光性质的改变，有2种情况:
（l>
药物分子无荧光，在蛋白质溶液中加人药物后，蛋白质的内源荧光被猝灭。
药物分子有荧光，蛋白质与药物混合后，其内源荧光被猝灭，同时药物分子的荧光被敏化增强。
从荧光猝灭机理上来看，药物分子对蛋白质荧光的猝灭可分为动态猝灭和静态猝灭。
动态猝灭是药物和蛋白质的激发态分子之间的相互作用而导致的荧光猝灭，遵循Stern一Volmer方程[9-10]:
Fo/F=l+KsvCQ……………………….（1>
式中Fo为未加药物（猝灭剂>
时蛋白质的荧光强度，F表示加入药物浓度为CQ时蛋白质的荧光强度，Ksv称为猝灭常数。
静态猝灭是药物和蛋白质在基态时生成复合物，从而导致蛋白质荧光强度降低。
对于1:
1结合的情况，可推导出公式:
Fo/F=l+K[Q]…………………（2>
式中K为复合物的稳定常数，[Q]为游离药物分子的浓度。
根据此式作Fo/F-[Q]图，可由回归直线斜率求得K值。
用式（2>
作图，发现所得回归直线往往线性关系不好，为此，将式（2>
变形为双倒数公式[12]，该式是目前国内作者引用最多的一个公式。
（Fo-F>
-1=Fo-1+K-1Fo-1[Q]-1…（3>
比较式（1>
和式（2>
可以看到,无论是静态猝灭还是动态猝灭,Fo/F与CQ之间均存在着线性关系,因而,仅仅通过测量荧光强度所得到的荧光猝灭数据,无法判断猝灭现象究竟是属于动态还是静态的.区分动态猝灭与静态猝灭可以通过以下几个方面来确定:
①动态猝灭与温度有关,温度升高将增大扩散系数，从而增大双分子猝灭常数；
而温度升高可能引起配合物的稳定性下降,从而减小静态猝灭的程度。
②由于动态猝灭只影响到荧光分子的激发态,因而并不改变荧光物质的吸收光谱。
而静态猝灭中,基态配合物的生成往往会导致荧光物质吸收光谱的改变。
③静态猝灭,猝灭剂的存在并不改变荧光分子激发态的寿命,τo/τ=1；
而动态猝灭,猝灭剂的存在使荧光寿命缩短,τo/τ=Fo/F这是区分静态猝灭与动态猝灭最确切的方法。
1.3红外光谱法
红外光谱各种实验技术的发展为研究蛋白质及多肽的结构与功能的关系提供了有力手段。
蛋白质的二级结构与其分子内形成的不同氢键类型密切相关，红外光谱法是研究蛋白质二级结构和动力学特性的有效工具【23】，通过研究蛋白质的二级结构可以探讨结构和功能的关系。
刘会洲等应用红外光谱仪研究了表面活性剂水溶液中的溶菌酶的乳化和二级结构的影响，提出离子型表面活性剂与蛋白质作用，能够破坏蛋白质分子中有序的螺旋结构，增加无规卷曲结构的含量[19]。
红外光谱是研究蛋白质二级结构的主要手段之一，它既可以对蛋白质的二级结构进行定性分析，也可以进行定量分析。
1950年Elliott和Ambrose根据模型多肽提出的红外酰胺I带1660~1650cm-1的峰属α螺旋结构、1640~1630cm-1的峰属β折叠构象的假设是定性估计蛋白质二级结构的基础[87-88]。
70年代中期发展了若干半定量计算蛋白质构象的方法，这些方法的局限性在于要求很多参数，而实际工作的难度恰在于此。
1983年Susi和Byler首先将二阶导数理论应用于研究二级结构，1986年他们又将卷积方法应用于二级结构分析[89]，使得红外分析蛋白质二级结构进入定量化阶段。
蛋白质在红外区域表现为9个特征振动模式或基团频率，其中最常用于二级结构分析的是位于1700~1600cm-1范围的酰胺I带。
由于蛋白质含有多种不同的二级结构单元，这些构象对应的振动吸收峰重叠在一起形成宽峰，各子峰固有的宽度大于仪器分辨率，利用普通光谱技术难以将各子峰分开，而傅里叶变换红外的高分辨率、高灵敏度、高信噪比及准确的频率精度等特点，使得二阶导数、去卷积技术可以应用于FTIR上，因而可把原来酰胺I带中未能分辨的峰分开，并指出各子峰的峰位值，然后通过曲线拟合，定量分析蛋白质二级结构的各个组分。
目前，研究小分子、离子与白蛋白的相互作用的方法除了光谱法之外，常见的方法还有平衡渗析法、核磁共振法、离心超过滤法和量热法等【24】。
一直走在生物无机化学前列的王夔等人，他们通过一系列的研究发现了金属离子与血清白蛋白配位的平衡条件、pH效应、以及金属离子（包括稀土金属离子在内>
与蛋白质的主要的配位基团及位置等【25】
以上各种方法中，应用较多的是紫外-可见光谱法和荧光光度法，而其中又以荧光光度法为最多，通过荧光法可以发现牛血清蛋白会发生非辐射能量转移引起的荧光静态猝灭，并且可以测定计算平衡常数，结合位点，作用力的类型，以及相关的热力学常数，从而确定其他物质的加入对牛血清蛋白构象的影响；
研究体系则以药物、稀土金属与牛血清蛋白的作用为多，而铅离子对牛血清蛋白构象的影响以及两者间作用的机理研究尚未见报道，因此，开展这方面的研究以寻求高灵敏度和高选择性的检测方法，具有理论和实际的意义。
2.实验部分
2.1实验试剂与仪器
2.1.1实验仪器
970CRT型荧光分光光度计<
上海分析仪器总厂）
UV-7502PC型紫外-可见分光光度计（日本岛津>
电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司>
10-1000μL移液枪
（5>
Nicolet6700红外光谱仪（美国热电公司>
2.1.2实验试剂
名称
纯度及规格
试剂来源
牛血清白蛋白
生化试剂
国药集团化学试剂有限公司
硝酸铅
国药集团化学试剂有限公司
磷酸氢二钠
分析纯
磷酸二氢钾
二次蒸馏水
氯化钠
2.2溶液的配制
2.2.1缓冲液的配制
用分析天平准确称量KH2PO4、Na2HPO4分别为0.9073g和2.3852g，用100ml容量瓶配制成1/15mol/L的溶液，用酸度计调节配制pH为：
6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的缓冲液。
2.2.2BSA溶液的配制
取50ml容量瓶，称量0.3400g牛血清蛋白，用二次蒸馏水配置成1×
10-4mol/L的牛血清蛋白溶液，并稀释成10-5mol/L，作为储备液放入冰箱中在低于5摄氏度条件下保存。
2.2.3铅离子浓度的配制
用分析天平准确称取0.3312g的硝酸铅，用100ml容量瓶配制成0.01mol/L的溶液。
并且用二次蒸馏水依次稀释为1×
10-3mol/L、5×
10-4mol/L、1×
10-5mol/L、5×
10-5mol/L、1×
10-6mol/L。
<
1）实验过程不同浓度的硝酸铅溶液的配制
取若干10ml干净的比色皿，加入2mlBSA溶液，2mlpH=7.1的缓冲液，加入硝酸铅体积<
ml）如下，并用二次蒸馏水稀释至10ml。
步骤浓度mol/L
10-3
5×
10-4
10-5
10-5
1×
10-6
1
2.0
0.0
2
4.0
3
1.0
4
2..0
5
6
7
8
9
10
11
12
2）不同pH溶液配制
取若干个比色管，加入2mlBSA溶液，并依次加入2mlpH为6.0、6.5、7.0、7.5、8、8.5的缓冲液，并用二次蒸馏水稀释至10ml。
3）不同浓度的BSA浓度的配制
在十一个干净的10ml的比色管中加入2mlpH=7.1的缓冲液，2mL4×
10-4mol/L加入如下表所示的BSA溶液，用二次蒸馏水稀释至10mL
步骤
10-5mol/L（mL>
10-4mol/L
4×
3.0
4..0
4）测定步骤：
荧光：
发射波长设定为350nm，测量200-600nm处的荧光光谱。
所有测量均在室温（15±
2℃>
下进行。
激发和发射单色器狭缝均为5nm。
紫外：
均用二次蒸馏水建立基线，扫描范围200-600nm。
红外：
灵敏度设定为2cm-1，测定4000-400cm-1处的光谱图
3.结果和讨论
3.1紫外光谱图
3.1.1不同pH条件下体系的紫外光谱图
1-6:
pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5
由于蛋白质中含有芳香族氨基酸侧链，主要是酪氨酸<
Tyr）、色氨酸<
Trp），其次是苯丙氨酸<
Phe）[27]，它们在285nm附近产生吸收，因此可利用紫外-可见光谱研究蛋白质的结构。
从图中可以看出在pH=7.5时峰强度最弱。
pH＞7.5后，随着pH值的增大峰强度减小，pH＜7.5时随着pH的增加，吸收峰逐渐增加。
蛋白质具有羧基和氨基这些酸碱功能团，因此对pH的变化非常敏感，过酸过碱都会导致蛋白质变性失活。
血清白蛋白280nm附近的吸收峰是其肽链上2个色氨酸和19个酪氨酸残基的芳杂环的π-π*跃迁引起的，而240nm附近的吸收则主要是肽键C=O基的n-π*跃迁引起，与蛋白质分子的α-螺旋结构含量有关。
在BSA等电点之后，随着体系中pH的降低，使得BSA分子间作用增强，有利于分子间和分子内的团聚作用，使蛋白质分子的构象改变，α-螺旋含量减少，使240nm附近的吸收峰发生红移。
同时由于体系pH值的降低，出现
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