血细胞计数板相关知识及练习.doc

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血细胞计数板

一、血细胞计数板的构造

血细胞计数板被用以对人体内红、白血细胞进行显微计数之用，也常用于计算一些细菌、真菌、酵母等微生物的数量，是一种常见的生物学工具。

血细胞计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的。

玻片中有四条下凹的槽,构成三个平台。

中间的平台较宽,其中间又被一短横槽隔为两半,每半边上面,刻有一个方格网。

方格网上刻有9个大方格,其中只有中间的一个大方格为计数室,供微生物计数用。

这一大方格的长和宽各为1mm,深度为0.1mm,其体积为0.1mm3。

计数室通常有两种规格.一种是大方格内分为16中格,每一中格又分为25小格；另一种是大方格内分为25中格,每一中格又分为16小格。

但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同的特点,即每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成,见图：

  血细胞计数板（25格×16格）

二、血细胞计数板的使用

以计数酵母菌为例

1.使用

（1）用血细胞计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数。

（2）样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小方格内含有4-5个酵母细胞为宜,一般稀释10倍即可。

（3）将血细胞计数板用擦镜纸擦净,在中央的计数室上加盖专用的厚玻片。

（4）将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘,使菌液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取,捎待片刻,使酵母菌全部沉降到血细胞计数室内。

（5）计数时,如果使用16格×25格规格的计数室,要按对角线位,取左上,右上,左下,右下4个中格（即100个小格）的酵母菌数.如果规格为25格×16格的计数板,除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格（即80个小方格）的酵母菌数。

（6）当遇到位于大格线上的酵母菌,一般只计数大方格的上方和右方线上的酵母细胞（或只计数下方和左方线上的酵母细胞）。

（7）对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计算每1ml菌液中所含的酵母菌个数。

２、计算公式：

（1）16格×25格的血细胞计数板计算公式:

　　酵母细胞数/ml=100小格内酵母细胞个数/100×400×10四次方×稀释倍数

（2）25格x16格的血细胞计数板计算公式:

　　酵母细胞数/ml=80小格内酵母细胞个数/80×400×10四次方×稀释倍数

３.血细胞计数板的清洁：

血细胞汁数板使用后,用自来水冲洗,切勿用硬物洗刷,洗后自行晾干或用吹风机吹干,或用95%的乙醇,无水乙醇,丙酮等有机溶剂脱水使其干燥.通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物.若不干净,则必须重复清洗直到干净为止.

三、不足之处

血细胞计数板在显微镜下直接进行测定。

它观察在一定的容积中的微生物的个体数目，然后推算出含菌数，简便快捷。

但是在计数时包括死活细胞均被计算在内，还有微小杂物也被计算在内。

这样得出结果往往偏高，因此适用于对形态个体较大的菌体或孢子进行计数。

四、相关练习：

1．在一定量的酵母菌培养液中放人活酵母菌若干，抽样镜检，视野下如图甲所示（图中小点代表酵母菌）。

将容器放在适宜温度下恒温培养5小时后，稀释100倍，再抽样镜检，视野下如乙图所示。

根据实验结果判断，以下叙述正确的是（）

A．培养5小时后，酵母菌种群密度增加200倍左右

B．探究酵母菌的种群数量变化可以用标志重捕法

C．用血细胞计数板计数酵母菌数量时只统计方格内菌体

D．培养5小时后，酵母菌种群数量已经达到K值

解析：

比较甲、乙两图中央两格酵母菌数，乙是甲的两倍，乙是稀释100倍后的镜检结果，故培养5小时后，酵母菌种群密度增加200倍左右。

标志重捕法适用于活动能力强、体型较大的动物，酵母菌的种群数量计数不能用标志重捕法。

用血细胞计数板计数酵母菌数量时应统计方格内和压在相邻两边上的菌体。

培养5小时后，酵母菌种群数量并不能确定是否已经达到K值。

答案：

A

2．某研究性学习小组探究酵母菌种群在不同的培养液浓度和温度条件下种群密度的动态变化，进行了如下实验，实验操作步骤如下：

第一步：

配制无菌马铃薯葡萄糖培养液和活化酵母菌液。

第二步：

利用相同多套装置，按下表步骤操作。

第三步：

用血细胞计数板计数装置中起始酵母菌数目，做好记录。

第四步：

将各装置放在其他条件相同且适宜的条件下培养

第五步：

连续7天，每天随机抽时间取样计数，做好记录。

回答下列问题：

（1）改正实验操作步骤中的一处错误：

。

（2）某同学第5天在使用血细胞计数板计数时做法如下：

①振荡摇匀试管，取1mL培养液并适当稀释（稀释样液的无菌水中加入了几滴台盼蓝染液）。

②先将放在计数室上，用吸管吸取稀释后的培养液滴于其边缘，让培养液自行渗入，多余培养液，制作好临时装片。

③显微镜下观察计数：

在观察计数时只记（填“被”或“不被”）染成蓝色的酵母菌。

（3）如所使用的血细胞计数板有16个中方格，每1个中方格中有25个小方格，每1个大方格容积为0．1mm3（1mL=1000mm3）。

请推导出1毫升培养液中酵母菌细胞的计算公式：

酵母细胞个数／mI=。

解析：

（1）实验中要注意遵循单一变量和对照原则，该实验中要注意在每天同一时间取样，否则由于时间不同而影响结果的准确性。

（2）计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。

但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400个小方格。

每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm3。

在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1mL菌液中的总菌数。

（3）计数时，如果使用16格×25格规格的计数室，要按对角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格（即100个小格）的酵母菌数。

如果规格为25格×16格的计数板，除了取其4个对角方位外，还需再数中央的一个中格（即80个小方格）的酵母菌数。

对每个样品计数三次，取其平均值，按下列公式计算每1毫升菌液中所含的酵母菌个数。

①16格×25格的血细胞计数板计算公式：

酵母细胞数/mL=（100个小格内酵母细胞个数/100）×400×104×稀释倍数。

②25格×16格的血细胞计数板计算公式：

酵母细胞数/mL=（80小格内酵母细胞个数／80）×400×104×稀释倍数。

答案：

（1）第五步中应每天同一时间（定时）取样

（2）②盖玻片用滤纸（吸水纸）吸去③不被

（3）平均每个小方格的酵母菌数×400×104×稀释倍数

3．蓝藻、绿藻和硅藻是湖泊中常见藻类。

某课题组研究了不同pH对3种藻类的生长及光合作用的影响，实验结果见图1、图2。

请回答下列问题：

（1）根据图1和图2分析：

3种藻类中pH适应范围最广的是；在pH=8．0时，3种藻类中利用C02能力最强的是。

（2）在培养液中需加入缓冲剂以稳定pH，其原因是。

（3）在实验中需每天定时对藻细胞进行取样计数，请回答以下问题：

①取出的样液中需立即加入固定液，其目的是。

②在计数前通常需要将样液稀释，这是因为。

③将样液稀释100倍，采用血细胞计数板（规格为1mmxlmmx0.1mm）计数，观察到的计数室中细胞分布见图3，则培养液中藻细胞的密度是个/mL。

答案

（1）绿藻蓝藻

（2）藻类生长代谢会改变培养液pH（3）①维持藻细胞数量不变②藻细胞密度过大③1×l08

解析

（1）比较图1和图2中的三条曲线，代表绿藻的曲线最平缓，变化幅度最小，说明pH对绿藻的生长和光合作用速的影响最小，绿藻对pH适应范围最广。

比较图2的三条曲线，pH为8.0时，蓝藻的光合速率为4.0umol．mg-1．mln-1，为三种藻类中最大，C02是光合作用的原料之一，因此其吸收利用C02的能力也就最强。

（2）由于三种藻类呼吸作用过程中会产生C02，光合作用过程中需要吸收C02，而C02会导致培养液的pH改变，从而影响三种藻类的生长速率和光合速率，影响实验结果。

因此，实验前需要在培养液中加入pH缓冲液以维持反应溶液的pH稳定。

（3）①由于上述藻类繁殖周期短，在取样后到计数这段时间内有些个体很可能完成了增殖，从而影响计数结果，所以取样后应立即进行杀死固定。

②利用血细胞计数板进行计数时，每个中格中的细胞数目不能太多，一般不超过5个，否则细胞可能有相互遮盖现象。

如果发现细胞数目过多，应对培养液进行以10倍为单位的稀释。

③从图3知道，血细胞计数板的计数室体积为1mmxlmmx0.1mm=0.l（mm）3=104mL。

每个计数室包括25个中格，每个中格包括16个小格。

这种规格的计数板在计数时，除了取其4个对角处的中格（左上、右上、左下、右下）外，还需再取中央的一个中格，即80个小方格。

如果使用计数室为16中格×25小格规格的计数板，计数时只要取4个对角处的中格（即100个小格）。

当遇到位于中格线上的细胞，一般只计数中格的上方和左方线上以及左角处的细胞，也可以只计数中格的下方和右方线上以及右角处的细胞，只要满足两线夹一角就行了。

对每个样品应计数三次，取其平均值。

计数结果为：

左上中格为5个（左线3+内部2），右上中格为4个（全部在内部），中央中格为3个（左线1+内部2），左下中格为4个（全在内部），右下中格为4个（上线2+内部2），共20个，平均每个中格为4个，则每个计数室为25x4=100个。

每毫升培养液中的细胞数为100÷10－4=1×l06个。

由于计数时培养液稀释了100倍，所以原培养液中藻细胞的密度应为100xl×l06=1×l08个。

本题在设计时考虑到了有人计数中格的下方和右方线上以及右角处的细胞这种情况，结果一样。

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