糖的薄层色谱Word文件下载.docx

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如对已分开的斑点显色，而将与它位置相当的另一个未显色的斑点从薄层上与硅胶G一起刮下，以适当的溶液将糖从硅胶G上洗脱下来，就可用糖的定量测定方法测出样品中各组分的糖含量。

薄层层析的展层方式有上行、下行和近水平等。

一般常采用上行法，即在具有密闭盖子的玻璃缸（即层析缸）中进行，将适量的展层溶液倒于缸底，把点有样品的薄层板放入缸中即可（如图1所示）。

保证层析缸内有充分展层溶剂的饱和蒸气是实验成功的关键。

与纸层析、柱层析等方法比较，薄层层析有明显的优点：

操作方便，层析时间短，可分离各种化合物，样品用量少（0.1至几十向微克的样品均可分离），比纸层析灵敏度高10～100倍，显色和观察结果方便，如薄层由无机物制成，可用浓硫酸、浓盐酸等腐蚀性显色剂。

因此，薄层层析是一项实验常用的分离技术，其应用范围主要在生物化学、医药卫生、化学工业、家业生产、食品和毒理分析等领域，对于天然化合物的分离和鉴定也已广泛应用。

【操作方法】

1.硅胶G薄层板的制备

将制备薄层用的玻璃板预先用洗液洗干净并烘干，玻璃板要求表面光滑。

称取硅胶G粉6g，加入12mL0.1mol/L硼酸溶液，用玻棒在烧杯中慢慢搅拌至硅胶浆液分散均匀、黏稠度适中，然后倾倒在干净、干燥的坡璃板上，倾斜玻璃或用玻棒将硅胶G由一端向另一端推动，使硅胶G铺成厚薄均匀的薄层。

待薄板表面水分开干燥后置于烘箱内，待温度升至110℃后活化30min。

冷却至室温后取出，置于干燥器中备用（注意：

避免薄板骤热、骤冷使薄层断裂或在展层过程中脱落）。

制成的薄层板，要求表面平整，厚薄均匀。

手工涂布薄板的方法：

（1）玻棒涂布：

选用一根直径为1～1.2cm的玻璃棒或玻璃管在两端绕几圈胶布，胶布的圈数视薄层的厚度而定，常用厚度为0.56～1.0mm，把吸附剂倒在玻璃板上，用这根玻璃棒在玻璃上将吸附剂向一个方向推动，即成薄板。

（2）倾斜涂布：

将吸附剂浆液倒在玻璃上，然后倾斜使吸附剂漫布于玻板上面成薄层。

2.点样

取制备好的薄板一块，在距底边1.5cm处划一条直线，在直线上每隔1.5～2㎝作为一记号（用铅笔轻点一下，不可将薄层刺破），共4个点。

用0.5mm直径的毛细管吸取取糖样品量约5～50μg，点样体积约1－1.5μL，可分次滴加，控制点样斑点直径不超过2mm。

在点样过程中可用吹风机冷热风交替吹干样品，也可以让样自然干燥。

3.展层

将已点样的薄板点样一端放入盛有展层溶剂的层析缸中，展层液面不得超过点样线，层析缸密闭，自下向上展层，当展层溶剂到达距薄析顶端约1cm处时取出薄板，前沿用铅笔或小针作一记号。

60℃烘箱内烘干或晾干。

4.将苯胺-二苯胺磷酸显色剂均匀喷雾在薄层上，置85℃烘箱内加热至层析斑点显现（如图2所示），此显色剂可使各种糖显现出不同的颜色，如表1所示。

表1

糖的种类

木糖

葡萄糖

蔗糖

显色

黄绿

灰蓝色绿

蓝褐

5.样品中糖定性鉴定

薄层显色后，根据各显色斑点的颜色相对位置，测算Rf值

将混合样品图谱与标准样品图谱相比较或通过混合样品与标准样品Rf值的比较，确定混合样品中所分离的各个斑点分别为何种糖。

【影响Rf值的因素如下】

①展层溶剂的样品组分的性质：

样品组分若在固定相中溶解度较大，在流动相中溶解度小，则Rf值小；

反之，Rf值大。

②吸附剂的性质和质量：

不同批号和厂家的产品，其性质和质量不尽相同。

③吸附剂的活度。

④薄层的厚度。

⑤层析槽的形状、大小和饱各度。

⑥展层方式。

⑦杂质的存在和量的多少。

⑧展层的距离。

⑨样品量。

⑩温度。

由于影响Rf值因的因素很多，故不能仅根据Rf值来鉴定未知样品组分。

一般采用几种薄层层析法来确证样品的未知组分，如一种用吸附薄层层析，另一咱用聚酰胺薄层层析等。

实践中，也可把未知样品与标准品混合点样，然后进行薄层层析。

如果在几个不同类型的薄层层析中，两者都不发生分离，则可证明这两个化全物是相同的。

【注意事项】

1.制备薄板时，薄板的厚度及均一性对样品的分离效果和Rf值的重复性影响很大，普通薄层厚度以250μm为宜。

若用薄层层析法制备少量的纯物质时，薄厚度可稍大些，常见为500～700μm，甚至1～2㎜。

2.活化后的薄层析在空气中不能放置太久，否则会因吸潮降低活性。

3.用于薄层层析的样品溶液的质量要求非常高，样品中必须不含盐，若含有盐分则会引起不严重的拖尾现象，甚至有时得不到正确的分离效果。

4.样品溶液应具有一定的浓度，一般为1～5g/L，若样品太稀，点样次数太多，就会影响分离效果，所以必须进行浓缩处理。

5.样品的溶剂最好使用挥发性的有机溶液（如乙醇、氯仿等），不宜用水溶液，因为水分子与吸附剂的相互作用力较弱，当它点据了吸附表面上的活性位置时，就使吸附剂的活性降低，从而使斑点扩散。

6.样品点样量不宜太多，若点样量超载（即超过该吸附剂负载能力），则会降低Rf值，层析斑点的形状被破坏。

点样量一般为几到几十μg，体积为1～20μL。

7.展层必须在装闭的器皿中进行，器皿事先应用展层溶液剂饱和，把薄板的点样端浸入展层剂中，深度约为0.5～1.0cm。

千万勿使点样斑点浸入展层溶剂中。

8.展层溶剂的选择：

（1）根据溶剂的结构、性质的不同而定，主要以溶液剂的极性大小为依据。

在同一吸附剂上，溶剂极性越大，对同一性质的化合物的洗脱能力也越大，即在薄层板上把这一化合物推进得越远，Rf值也越大。

如果发现用一种溶液支展开某一化合物，其Rf值太小，则可考虑换用另一种极性较大的溶剂，或在原来的溶剂中加入一定量极性较大的溶液进行展层。

溶液极性极大小次序如下：

水>

甲醇>

正丙醇>

丙酮>

乙酸甲酯>

乙酸乙酯>

乙醚>

氯仿>

三氯甲烷>

苯>

三氯乙烯>

四氯化碳>

二硫化碳>

石油醚。

（2）根据被分离物质的极性和吸附剂的性质而定。

在同一吸附剂上，不同化合物的吸附规律是：

①饱和碳氢化合物不易吸附或吸附不牢。

②不饱和碳氢化合物被吸附，含双键越多，吸附得越牢。

③碳氢化合物被一个功能基取代后，其吸附性增大。

各功能基使吸附性增大的递增顺序是：

在薄层上，对于吸附较大合物，一般需用极性较大的溶剂（展层剂）才能推动它。

表2列出一些物质的展层溶液系统。

（3）若样品组分具有酸碱性，则可将展层的pH值作适当调整。

若样品组分为碱性，则调节展层溶剂pH为碱性，以增加展层溶液的分辨率，使样品在薄板上展层后，斑点圆而集中，避免拖尾现象。

当样品组分具有酸性时，调节展层溶剂pH为酸性，可得到圆而集中的斑点。

9.在薄层层析时，层析缸溶剂饱和度对分离效果影响较大，在不饱和层和析缸中，展层易引起边缘较应，因为极性较弱的溶液和沸点较低的溶剂在边缘挥发得快，从而使样品组分在边缘的Rf值高于中部的Rf值，用饱和的层析缸可以消除边缘效应。

10.为了获得更好的薄层层析的效果，也可采用双向展层、多次展层和连续展层。

多次展层是指选用一种溶剂展开至一定距离后，将薄层板取出，待溶剂挥发后再按同一方向用第二种溶液展开。

11.薄层层析展开后，对被分离的样品组分进行定性或定量分析，都要用不同的显色方法先确定它们的位置。

有的物质在紫外灯下可显示出荧光斑点，如核苷酸等；

对于在紫处光下不显荧光的样品，可用荧光薄层检出，该薄层的制法是将荧光物质（1.5%硅酸镉粉）加入吸附剂中，或在薄板上喷0.04%荧光钠水溶液、0.5%硫酸奎宁醇溶液及1%磺基水杨酸的丙酮溶液；

有的有色物质在展层后可显示有颜色的斑点；

对无色化合物的显色，主要采用两种方法，即物理方法和化学方法。

物理方法如用紫外灯照射，属非破坏性显色方法。

化学方法如用茚三酮显色剂喷雾显色可使氨基酸类化合物显色；

对于无机吸附剂制成的薄层，可用强腐蚀性显色剂如硫酸、硝酸或其他混合溶液，因为这些显色剂几乎可使所有机化合物转变成碳，为破坏性显色方法，此类显色剂称为万能显色剂，但它们不适用于定量测定或制备用的薄层上。

【材料与试剂】

1.实验材料：

木糖（或棉子糖）、葡萄糖、蔗糖、混合样品、硅胶G

2.实验试剂

（1）1%糖标准溶液：

取木糖（或棉子糖）、葡萄糖、蔗糖各1g，分别用75%乙醇溶解并定容到100mL.

（2）1%糖标准混合溶剂：

取上述各种糖各1g，混合后用75%乙醇溶解并定容至100mL。

（3）0.1mol/L硼酸（H3BO3）溶液。

（4）展层溶剂：

氯仿：

甲醇=60：

40（V/V）。

（5）苯胺-二苯胺-磷酸显色剂：

1g二苯胺溶于由1mL苯胺、5mL85%磷酸、50mL丙酮组成的混合溶液中。

【实验器材】

①烧杯；

②玻璃板（8cm×

12cm）；

③层析缸（ø

15cm×

30cm）；

④毛细管（ø

0.5mm）；

⑤玻棒；

⑥喷雾器；

⑦烘箱；

⑧尺、铅笔；

⑨干燥器。

【思考题】

1.本实验在操作过程中有哪些方面是实验成功的关键？

2.分析本实验的层析图谱。

可溶性糖的硅胶G薄层层析

一、试验目的

1了解薄层层析测定可溶性糖的原理。

2.掌握硅胶G薄层层析的操作方法。

二、实验原理

薄层层析（简称TLC）是一种微量而快速的层析方法，是在吸附剂或支持剂均匀涂布的薄层上进行的，故称薄层层析。

为了使所要分析的样品各组分得到分离，必须选择合适的吸附剂。

硅胶、氧化铝和聚酰胺是广泛采用的吸附剂，硅藻土和纤维素是分配层析中常用的支持剂，在吸附剂或支持剂中添加合适的粘合剂后再涂布，可使薄层紧贴在玻璃板上。

硅胶G是一种添加了粘合剂的硅胶粉，约含12％~13％的石膏（CaS04），它可以把一些物质从溶液中吸附于自身表面。

利用它对各种物质吸附能力的不同，再用适当的溶剂系统展层，使不同的物质得以分离。

例如，糖在硅胶G薄层上的移动速度与糖的相对分子质量和羟基数有关，经过适当的溶剂展开后，糖在薄板上的移动速度是戊糖＞己糖＞双糖＞三糖。

对已分开的斑点显色，而将与它位置相当的另一个末显色的斑点从薄层上与硅胶G一起刮下，以适当的溶剂将糖从硅胶G上洗脱下来，就可用糖的定量测定方法测出各组分的含糖量。

薄层层析与其他方法比有明显的优点：

层析时间短、样品用量范围大（1μg~0.5g）、观察结果方便、可以分离多种化合物等，其灵敏度比纸层析高10~100倍，显色方法甚至可以用腐蚀性显色剂。

而且薄层层析法操作方便，设备简单，所以薄层层析法目前应用范围相当广泛。

三、仪器和试剂

仪器

烘箱、吹风机、薄层玻板（20cm×

20cm）、分光光度计。

试剂

1.1％糖标准溶液：

取木糖、葡萄糖、果糖和蔗糖各l00mg，分别用75%的乙醇定容10mL

，使其浓度均为10mg/mL。

2.0.1mol/L硼酸（H3BO3）溶液。

3.层析溶剂：

甲醇＝60:

40（体积比）。

4.苯胺—二苯胺—磷酸显色剂：

取1g二苯胺、1mL苯胺和5mL85％磷酸溶于50mL丙酮中。

5.蒽酮试剂：

称取0.2g蒽酮和1g硫脲于烧杯中，缓缓加入100mL浓硫酸，边加边搅拌，溶解后呈黄

色透明溶液．将其贮存于棕色瓶中，最好现配现用，置冰箱中可存放2周

四、操作步骤

（一）硅胶G薄层板的制备

取硅胶G粉30g，加入75mL0.1mol/L硼酸溶液中，调匀后铺于洁净、平整的玻板上，

将铺层

后的薄板于100℃烘箱中烘干。

取出后即可使用，亦可贮于干燥器中备用。

薄层

表面要求平整，厚薄均匀。

（二）糖在硅胶G薄层上的分离<

BR>

选取制备好的薄板一块，在距底边1.5cm的直线上选4个点，各点间距2cm。

用毛细管分别点上不同的糖样品于4个点，样品量控制在5~10μg，斑点直径不超过2mm，待薄层上样品自然干操后，将薄板置于盛有层析溶剂的层折缸中，自下向上展层，当展层溶剂到达离薄板顶端约1cm处时取出薄板，前沿作一记号，于60℃下烘干2～3h（或在空气中晾干），除尽溶剂后均匀地喷上一层苯胺—二苯胺—磷酸显色剂，于85℃下烘干10min，则各种糖分别显出不同的颜色。

（三）糖的定量测定<

分别取5块干硅胶G板，在每块板上间隔均匀地点上同样的5个样，即每块薄板上分别点上1μL、2μL、3μL、4μL、5μL的糖标准液5点，操作方法同上，待溶液前沿到达薄板顶端lcm处时取出，挥发尽溶剂后，将每块板中间3个样品层析部位用玻璃盖住，左右面边层折部位用显色剂进行定位。

根据已显色斑点的位置，用刀片刮下中间3个相应部位的硅胶G并放入试管中。

在上述各试管中加1mL蒸馏水，于室温下浸提1小时，取1mL滤液加2mL蒽酮试剂，于沸水浴中加热10min，冷却后用空白试样调零，在波长620nm处测出各糖的消光值A620。

（四）结果分析<

1．记下各斑点的位置、颜色，计算Rf值，绘出层析图谱。