寄生虫免疫Word格式.docx
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弱毒活疫苗：
一般是活虫经过放射性因素照射后制成的，另一类是由异种寄生虫制备
免疫应答的体外实验：
体外试验虽不能提供体内免疫反映的直接依据，但可以了解机体的免疫状态以及对分析体内免疫反映所参加的成分提供有价值的数据。
1、淋巴细胞转化实验2、溶血斑试验3、体外杀伤实验
溶血斑试验：
是体外检测单个抗体形成细胞的一种方法，即将绵羊红细胞（SRBC）免疫过的家兔淋巴结或小鼠脾脏制成细胞悬液。
与一定量的SRBC结合，于37℃作用下，免疫活性淋巴细胞能释放出溶血素，在补体的参与下，使抗体形成细胞周围肉眼可见的溶血空斑。
体外杀伤实验：
1、CD56,2、CD16，3、杀伤细胞活化受体（KAR）；
识别靶细胞表面的糖类配基4、杀伤细胞抑制受体（KIR）；
识别子自身的MHC分子，介导抑制信号
Ⅰ类MHC分子的晶体结构只有一种构象，即α1和α2相互作用形成一个8条反平行的β折叠片层构成的平台，支撑着两个平行α螺旋，其中4条反平行β片层和一个α螺旋是由α1的氨基酸折叠形成的。
Ⅱ类MHC分子都是由两条非共价结合的多肽链组成的。
α链和β链必须同时合成，随后在内质网中以非共价键方式连接在一起。
只有α和β链的非共价作用才能结合在细胞膜上。
抗原递呈细胞（APC）：
能够摄取、加工、处理抗原并将抗原信息递呈给抗原特异性淋巴细胞（T细胞）的一类免疫细胞。
包括巨噬细胞、树突状细胞、成熟B细胞等。
抗原加工：
指蛋白质抗原在细胞内被降解成能与MHC结合的肽的过程。
抗原递呈：
指MHC分子与抗原肽结合，将其展示于细胞表面供T细胞识别的过程。
独特型（idiotype）。
：
每一形成抗体的克隆细胞所产生的抗体上，都具有自身独特的抗原专一性。
抗体依赖的细胞介导的细胞（ADCC）：
具有杀伤活力的细胞如NK细胞通过其表面表达的Fc受体识别结合于靶抗原上的抗体Fc段，直接杀伤靶抗原。
细胞的杀虫效应：
A.活化粘附作用B.细胞杀灭过程
目前发现的细胞杀伤寄生虫有以下五种ADCC表现形式：
IgG-嗜酸性粒细胞机理；
IgE-巨噬细胞机理；
IgG-中性粒细胞机理；
IgG-肥大细胞机理；
IgE-中性粒细胞-组织胺释放机理
低亲和力抗体：
LAAB高亲和力抗体：
HAAB
细胞因子（Cytokine）：
是由机体的多种细胞（免疫细胞、非免疫细胞）合成、分泌的，通过结合细胞表面的相应受体而发挥生物学作用的小分子蛋白质。
细胞因子合成、分泌特性：
（1）产生细胞的多源性:
一种细胞因子由多种细胞产生，如：
单核-巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞等à
IL-1；
（2）产生因子的多向性:
一种细胞分泌多种细胞因子，如：
T细胞à
IL-2、IL-13、GM-CSF等；
（3）短时自限性分泌；
（4）主要为自分泌、旁分泌效应。
环卵沉淀反应试验：
是以血吸血整卵为抗原的特异免疫血清学试验。
卵内毛蚴或胚胎分泌排泄的抗原物质经卵壳微孔渗出与试样血清中的特异抗体结合，可在虫卵周围形成特殊的复合物沉淀，在光镜下判读反应强度并计数反应卵的百分率称环沉率。
环卵沉淀反应试验原理：
带虫免疫：
人体感染寄生虫后，产生一定程度的免疫力：
1、可杀伤体内原有的寄生虫，使其数量明显下降，维持在一个低水平上，临床症状消失呈带虫状态，但不能完全消除体内的寄生虫。
2、可抵抗同种寄生虫的在感染。
3、体内无寄生虫时此免疫力即消失，这种免疫状态叫带虫免疫
伴随免疫：
人感染寄生虫后可获得部分免疫力，动物体内仍有成虫寄生和产卵，但宿主对再感染有一定免疫力，而无损于体内的成虫
变态反应分类：
Gell与Coombs按变态反应发生发展的近代知识，首先提出四型分型法，即I型——速发型，Ⅱ型——细胞毒型，Ⅲ型——免疫复合物型，Ⅳ型——迟发型或细胞免疫型
活性介质包括：
组胺、5-羟色胺、肝素、类胰蛋白酶等。
免疫逃避：
某些寄生虫能逃避宿主的免疫效应而发育、繁殖、生存。
分子模拟：
某些寄生虫体表达与宿主组合抗原相似的成分，妨碍宿主免疫系统的识别、
抗原伪装：
某些寄生虫能将宿主的抗原分子镶嵌在虫体体表，或用宿主抗原包被自己。
封闭抗体：
多克隆B细胞激活后，高IG血症，其中有一种抗体它结合于虫体表面，但无保护性，并阻止了保护性抗体与虫体结合，这种抗体为封闭抗体。
血清灭活后反应减弱，保存3天以上的血清需加补体，目前认为此反应是部分依赖补体的抗原抗体反应
免疫酶染色实验基本原理：
将寄生虫各期制成冰冻切片后用于检测，当切片抗原加上寄生虫感染者血清，特异性抗体即与相应的抗原结合，再加上酶标记二抗，以相应的底物进行显色反应。
五大寄生虫感染：
疟疾、血吸虫、利氏曼原虫、丝虫、锥虫
兽医寄生虫疫苗的获得手段：
1通过特护动物传代或在体外培养使毒力降低2、筛选缺少某一生活阶段的虫株3、筛选生活周期缩短的虫株
影响寄生虫疫苗推广和应用的主要因素有：
1、安全性问题2、免疫保护效果3、经济效益
对寄生虫疫苗研究成功的关键：
1、包括选择免疫应答难以作用的寄生部位。
2、寄生虫在宿主体内不同发育阶段表现抗原特异性改变，从而使获得性免疫力有严格的阶段特异性。
各阶段因其不同表面抗原而避开了前一阶段引起的宿主免疫效应机制的伤害。
寄生虫表面抗原变异的锥虫、疟原虫、巴倍虫等致病性原虫表现更明显3寄生虫在抗原变异，抗原模拟和寄生虫摄入宿主DNA和获得宿主蛋白或以宿主抗原伪装自己方面也表现出非常复杂而有效地免疫逃避机制。
但是，任何一种寄生虫在宿主体内长期存活的免疫逃避机制均未能完全标清楚。
DNA疫苗的免疫机理：
1、DNA疫苗在非淋巴系统的组织细胞，如肌细胞内表达抗原，再被分泌或被损伤的细胞释放组织间隙最终被抗原提呈细胞捕获、加工、提呈给T细胞，诱生免疫应答。
2、抗原提呈细胞直接摄取DNA疫苗，表达抗原和提呈给T细胞，触发免疫应答。
以任何途径接种DNA疫苗，抗原提呈细胞都可能直接摄取质粒DNA，表达外源蛋白以内源性抗原的加工、提呈的方式诱导细胞和体液免疫应答，尤其的诱导强的细胞免疫应答。
3、质粒DNA能刺激抗原提呈细胞分泌多种细胞因子，从而调节T、B淋巴细胞功能，发挥强大的免疫制剂作用。
树突状细胞苗（DC）机理：
病原体感染机体后，不成熟的DC经模式识别受体识别病原体抗原并成熟，虽吞噬活性降低，但细胞表面分子、共刺激分子、粘附分子以及细胞因子表达增强，能有效的刺激即始性T细胞的增殖作用，因此在启动机体免疫应答中发挥重大作用。
多克隆活化因子：
寄生虫感染后往往能够活化或抑制某一类型的免疫细胞。
这些由寄生虫分泌的物质为多克隆活化因子。
有些胞内寄生虫在进化过程中获得了其感染细胞凋亡的能力，其抑制机理主要有两方面：
1、人感染时诱导机体产生热休克蛋白从而干扰细胞凋亡途径Ⅲ。
2、激活NF-KB，使抗凋亡分子获得转录。
集结淋巴样组织（organizedlymphoidtissue）包括扁桃体、盲肠、派氏淋巴集结（Peyer‘sPatch，PP）和分布在粘膜系统各处的淋巴滤泡，淋巴滤泡中通常都渗透着不同数量的T淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞。
粘膜免疫的主要免疫球蛋白是分泌型IgA，主要由肠道固有层中的浆细胞产生粘膜分泌型IgA（slgA）的形成主要在粘膜区域而不是血浆中含量甚微的IgA渗透出来的。
sIgA抗球虫的可能作用机制：
①黏附在虫体的表面通过中和以及调理吞噬等空间阻碍作用降低虫体的活力；
②诱导宿主细胞受体分子构型的改变；
③在巨噬细胞、淋巴细胞的参与下介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC作用）；
④直接作用于子孢子和裂殖子阻止其入侵及在细胞内的发育。
鸡球虫苗免疫的作用特点：
鸡球虫免疫具有严格的种间特异性，一种球虫激发的免疫力，对其它种球虫的攻击没有交叉保护性，因此一种通用的球虫苗应该是多价的。
鸡胚传代致弱方法有4大缺点：
①致弱性能相对不稳定，当转为鸡传代时毒力返强快；
②通过鸡胚生产大量商品化致弱虫株的卵囊比较困难；
③随鸡胚传代次数的增加，虫体的免疫原性就会减少或丧失，实际上难以获得既保持良好的免疫力，又使毒力较弱的最佳组合；
④最主要的局限性在于流行最广的巨型、堆型和早熟艾美耳球虫不能在鸡胚内发育，毒力较强的布氏艾美耳球虫虽然可以在鸡胚内发育，但卵囊生长不良，因此通过鸡胚传代生产“全价”致弱虫苗就受到了限制。
第一章寄生虫抗原及其应用
在寄生虫与宿主的相互关系中，寄生虫抗原引起宿主产生免疫应答，特别是那些存在于寄生虫体表或分泌排泄物内的抗原，与宿主的免疫细胞直接接触，具有重要的免疫原性。
寄生虫抗原的化学构成：
多肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、核酸
一、按照免疫学标准分类
1.功能性抗原
（1）宿主保护性抗原
（2）免疫诊断抗原（3）免疫病理抗原（4）寄生虫保护性抗原
2.按照在不同宿主的免疫原性进行分类
（1）自然抗原：
使宿主在自然感染的情况下或者对自然宿主进行免疫接种时使宿主机体产生免疫反应的抗原。
（2）新抗原又称为异源抗原，非自然宿主的免疫接种和非相容性宿主的免疫接种用抗原。
3.半抗原：
在一定环境条件下寄生虫产生的载体决定簇，主要引起细胞免疫的非正常活动。
二、按寄生虫学标准分类
1.来源和定位
（1）可溶性外抗原
（2）可溶性体抗原（3）虫体抗原
2.按照虫群的生活史分类
（1）虫特异性抗原。
属特异性抗原、种特异性抗原、株特异性抗原、期特异性抗原、蜕皮抗原
三、按生物学标准进行分类
1.按照组成成分：
蛋白质、脂肪、糖类、核酸
2.按照特性分类：
大小、链结构、决定簇数目、类型
3.按照分子功能分类：
酶、代谢物、受体、识别结构
4.未来抗原的来源：
在各种媒介体内克隆的DNA的表达、化学合成、抗-独特型抗体抗原
第二节寄生虫抗原的分离、纯化和鉴定
一、寄生虫抗原的分离
1.虫体抗原：
收集虫体，洗净表面粘附物，在磷酸缓冲液中之称匀浆，离心后的上清即为可溶性虫体抗原。
球虫
2.ES抗原
排泄分泌抗原：
由培养寄生虫的培养液中经过浓缩、层析分级获得。
可用于免疫诊断。
3.膜抗原
主要成分是膜蛋白，分为膜表面蛋白和膜组成蛋白。
膜表面蛋白通过用金属螯合物或高离子强度的缓冲液溶解，然后通过分级处理获得。
膜组成蛋白可以用清洁剂、有机溶剂溶解并分级处理获得。
二、纯化
离子交换层析注意点：
要将样品中各组分分别洗脱，必须改变洗脱液的离子强度和PH，以提高解脱吸附的能力。
带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。
离子交换层析考虑因素：
1.被分离物质带何种电荷。
2.被分离物质分子的大小
大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素。
3.被分离物质所处的环境。
4.被分离物质的物理化学性质。
5.被分离物质的大概数量
根据分离过程的实验条件强酸强碱—应用广泛。
弱酸型—只能在碱性pH范围内使用。
弱碱型—只能在酸性pH范围内使用
缓冲液的选择原则：
不能发生化学反应，所带电荷应与样品一致。
避免使样品变性
洗脱剂原则：
所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离子或基团
洗脱方式：
梯度洗脱
三.鉴定
1.抗原组分及化学性质
（1）SDS-PAGE（十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）
SDS由一个非极性的疏水区和一个强阴离子基团组成，在有SDS和还原剂存在的情况下低聚物的蛋白质解离成多肽链，各种大小的蛋白质在凝胶中形状相同，所以可以根据电泳的速度来判断分子量的大小。
（2）双向电泳
第一向电泳：
等点聚焦电泳。
根据蛋白质的等电点进行分离
第二向电泳SDS-PAGE电泳，根据蛋白质分子量的大小进行分离。
垂直板电泳仪（第二向）
（3）氨基酸序列测定最终目的是为了合成蛋白或者是多肽，诺氏疟原虫CSP，环子孢子蛋白质，12个氨基酸残基组成的重复结构。
2.抗原活性极其特异性鉴定
（1）血清学方法
（2）体外实验淋巴细胞转化实验（3）动物实验过敏性反应
第三节寄生虫抗原的应用
一、免疫诊断
1、常用的诊断抗原：
1）、整体抗原和固相抗原整体虫卵，幼虫，成虫切片。
2）、液相抗原可溶性抗原如血吸虫可溶性虫卵抗原
2.主要寄生虫诊断抗原的研究进展
1）、血吸虫：
虫卵主要沉积于肝及结肠肠壁等处，引起的肉芽肿和纤维化是血吸虫病的主要病变。
血吸虫虫卵尿素溶解抗原血吸虫成虫微粒体抗原纯化抗原分子成虫31KD等
2）、疟原虫：
肝内期抗原；
肝-裂质体特异抗原（LSA）
二、疫苗接种1、减弱疫苗2、分子疫苗
Westernblot实验技术
定义：
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
WesternBlot基本原理：
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
WesternBlot一般流程：
蛋白样品的制备；
SDS聚丙烯酰胺；
凝胶电泳；
转膜；
封闭；
底物显色
通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白
水溶液提取法：
针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。
稀盐和缓冲系统的水溶液。
对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。
有机溶剂提取法：
对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。
通过层析或电洗脱法制备目的蛋白
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：
SDS是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当SDS与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺
基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和SDS的平均结合量是1:
1.4（以重量为单位）,而蛋白质结合固定比例之SDS后由于SDS带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致（chargedensity）,所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素
凝胶成份
凝胶浓度与蛋白分离范围
转膜
半干法：
将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转10－30min。
湿法：
将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。
转膜后检测
丽春红S染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤
膜，换水几次。
印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。
封闭：
把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。
37℃一小时，4℃过夜。
倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。
加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，37℃一小时，4℃过夜。
二抗与底物反应显色：
辣根过氧化物酶法（HRP）碱性磷酸酶法（AP）化学发光显色法（HRP）
第二节寄生虫感染宿主免疫的特点
一、关于抗原传递的若干概念
组织相容性（histocompatibility）是指在不同个体之间进行组织器官移植时，受体和供体双方相互接受的程度。
若移植物能被受体“容忍”或“相容”，则不被排斥而在受体体内存活，移植成功；
反之，若不能容忍或不相容，则出现移植物被排斥或移植物抗宿主反应，器官的移植亦告失败。
导致移植物排斥反应的抗原称为移植抗原或称组织相容性抗原
在哺乳动物中具有复杂的组织相容性抗原，统称组织相容性抗原系统。
其中能引起快而强的排斥反应的抗原系统称为主要组织相容性系统MHS），编码MHS的基因群称为主要组织相容性复合体（MHC）.
而引起慢而弱的排斥反应的抗原系统称为次要组织相容性系统（mHS），编码mHS的基因群自然群次要组织相容性复合体（mHC）
MHC是移植排斥反应的主要决定性因素，但在机体免疫系统的生理性免疫应答上也有着重要作用。
MHC基因在免疫应答中的重要作用。
1、抗原特异性T淋巴细胞不识别游离状态或溶解状态的抗原，只识别和MHC产物非共价结合的抗原的某一部分。
2、MHC分子是结合在自身机体的抗原呈递细胞的膜上，而不是以分泌形式存在。
3、MHC基因有两种不同类型的产物，称为Ⅰ和Ⅱ类MHC分子。
4、当抗原某部分与MHC结合形成复合物并呈递到该细胞的表面时，T细胞才与带有MHC-抗原复合物的细胞相互作用，并被激活。
5、在每个个体中，成熟T细胞的膜上抗原受体和自身MHC分子复合物是特异的，MHC分子是T细胞所识别配基的组成部分。
6、抗原和Ⅰ类还是Ⅱ类MHC分子结合，决定了被激活的T细胞种类，也因此出现不同性质的免疫应答。
7、MHC基因种类很多，就是说有很多等位基因，这些等位基因所表达的MHC分子对不同蛋白质抗原决定簇的结合能力不同，MHC基因正是通过这种途径控制对蛋白质抗原的免疫应的。
8、任何机体内成熟的T细胞只识别外来抗原，而对自身蛋白无反应。
这些都决定于MHC是否与蛋白质抗原结合，也因此选择出只对外来抗原产生应的T细胞。
组织相容性抗原:
通过移植鉴定与组织相容性有关的抗原。
主要组织相容性抗原系统能引起较强移植排斥反应的抗原。
主要组织相容性复合体编码主要组织相容性抗原系统的紧密连锁的基因群。
主要组织相容性抗原分子的表达
MHC分子的合成组装：
MHC分子合成后便插入到内质网膜上。
信号肽只作为把多肽引导到内质网上的物质，翻译过程中便被切除。
在翻译过程中或刚刚转译完时，加入寡糖基。
最后这一成熟的糖蛋白通过泡囊运输转移到质膜上。
MHC可区分为3大类：
IIIIII
MHCⅡ分子也在内质网内组装，形成异二聚体。
在内质网内它须与一辅助分子结合，形成一个9链结构，即由3个αβ二聚体和1个三聚体的辅助分子组成的复合物。
然后在辅助分子的作用下识别结合外源抗原多肽，呈递到细胞表面，以激活相应的T淋巴细胞。
广义APC：
所有有核细胞。
表达MHCⅠ类分子
专职APC（professionalAPC）：
MΦ，DC，B细胞等。
表达MHCⅡ类分子
兼职APC（non-professionalAPC）：
内皮细胞，上皮细胞，激活的T细胞等
（四）T细胞与B细胞的相互作用
B细胞为T细胞提供抗原信息，T细胞是B细胞的增殖，分化，成熟和产生特异抗体类型的基础。
二、免疫球蛋白的独特型
同一物种内所有个体的免疫球蛋白共同具有的抗原专一性称为同种型（isotype），也称同族专一性；
同一物种内不同个体存在几种形式的抗原专一性，在同一物种内的这种多型现象称为同种异型（allotype）；
每一形成抗体的克隆细胞所产生的抗体上，都具有自身独特的抗原专一性，称为个体型，也称为独特型（idiotype）。
1．同种型（istype）：
是指同一物种内所有个体共同具有的免疫球蛋白分子的抗原专一性，因此这种专一性因种而异。
2．同种异型（allotype）：
在同一种属内出现的免疫球蛋白异型现象，称为同种异型。
3．独特型独特型的抗原决定簇位于抗体分子的V区。
抗体分子的可变区包含3个高变区和介于其间的4个框架区。
Id决定簇有的位于高变区部位也有的位于框架区部位。
它能在体内引起自身免疫系统对它的识别、应答和反应，产生抗独特型的抗体
抗体的多样性是抗体细胞先天固定有的功能，还是由抗原本身结构引发而后天获得的？
如果是先天固有的，那么免疫系统是怎样区分外来抗原和自身抗原的，是在识别自身抗原的基础上区分外来抗原，还是在排除自身抗原反应性的基础上建立对外来抗原的识别和反应？
无性细胞系选择学说
抗体独特型的一个很重要的特性就是具有自身免疫原性，可以诱发自身抗体。
我们可以设想，在一个个体体内，其抗体带有的Id（以Ab1表示），必然刺激与之互补的另一克隆产生Aid，即抗Ab1的抗体（以Ab2表示），而Ab2也是抗体，也有自己的Id，因而又刺激与之互补的另一克隆，产生抗Aid的抗体，即Ab3，以此类推，机体内可以诱发产生一系列的Ab4、Ab5……。
这种级联式的Id-Aid应答已在实验中得到证实。
由于K细胞本身的杀伤作用是非特异性的，该杀伤作用必须依赖于特意抗体的启动和搭桥，所以称为抗体依赖、细胞介导的细胞毒作用。
对于蠕虫、原虫的体内和体外实验均得到证实，是机体对寄生虫感染一种免疫防御反应。
嗜酸性粒细胞是一种高度强化的效应细胞，其膜表面有IgG和IgE两种受体，故能以来两种受体对组织阶段的蠕虫和原虫予以杀伤。
5.免疫复合物（IC）指抗原抗体复合物。
IC形成：
Ag+Ab=IC
抗原：
保护性抗原、非保护性抗原、诊断抗原
抗原刺激机体产生抗体种类？
低亲和力抗体、高亲和力抗体
抗体亲和力高低与IC形成和免疫病理有密切关系，高亲和力抗体在免疫清除程度上比低亲和力抗体高。
在诱发IC肾小球肾炎方面，LAAb比HAAb严重，LAAb遗传鼠的单核吞噬细胞系统清除功能减退，血循环中IC水平高，肾小球基底膜沉着的抗原、抗体和补体较厚。
临床上HAAb病人预后比LAAb病人要好。
HAAb组的亲和力随时间推移而增长，而LAAb组不会出现成熟过程。
影响上述两类抗体产生的原因：
A.抗原对高亲和力细胞的优先选择B.TH和TS细胞的相互作用C.抗原的竞争D.遗传因素
感染早期的体液免疫应答的特点是产生LAAb，随着抗原水平的减退，渐渐出现亲和力成熟和HAAb。
但在出现抗原编译的感染中
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