蛋白质纯化课侧记Word格式文档下载.docx
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老板人很nice，但是他实在没钱了，所以我只好咬咬牙自己套腰包解决了，去年的退税就这样全搭进去了，欲哭无泪啊。
四月五号下午我赶到冷泉港，办完登记手续后被告知晚上七点全体开会，与教员和同学见面。
老师一共有四个，每人负责一个模块的实验，持续三天时间，每个老师都有一两个助手帮忙。
学生则一共有16个，分成四组，轮转式的做完四个模块。
我这一组其他三个人是：
来自coloradoBoulder的chad，做有丝分裂的；
来自Princeton的Adam，做海洋生物学的。
Chad和Adam都是博士后。
第三个是来自丹麦的Charlotte，是个博士生，做植物的。
现在开始八卦一下几个老师，^_^总负责人是来自wisconsin-madison的RichardBurgess教授，这老头很有意思，带这个培训班已经带了十二年了，到现在还是乐此不疲。
他六十年代是watson的博士后，watson似乎跟他关系很好，每年纯化课的时候，watson都会跑到培训班的实验室找Burgess聊天，同时拉他去吃饭什么的。
后来的有一天，我还真的看到了watson去找他聊天。
不过令人惊讶的是，watson此人相当精神，走路象年轻人。
watson此人口碑很不好，很自大。
连Burgess教授一次和我们吃饭的时候都承认，watson有时候口无遮拦，让他都觉得很难堪。
但是Burgess又承认watson对他自己的学生很支持，很提拔，这几年又尽心尽力为冷泉港筹款，贡献巨大。
第二位教员是来自UCLA的AlbertCourey教授。
这位教授人很nice也很幽默，四位老师中我对他印象最好。
申请这个课前，我先跟他发过e-mail询问这个课的情况，而他也鼓励我申请。
这老哥研究果蝇的，但是他却负责教一组纯化转录因子的实验。
我一开始不太理解，后来问他的学术经历，才明白是怎么回事。
原来这老哥博士是做生化，博后跟的是robertTjian（钱泽南），还是做生化，研究转录因子。
后来做了faculty之后，决定用果蝇做模型来研究转录因子。
他那时侯不懂果蝇的遗传学，完全靠自学和到处问人。
我知道后觉得特佩服，真正的科学家不应该被自己过去所受的训练束缚死了，应该是根据研究的需要随时准备学习新东西。
这老哥虽然不是最年轻的，但是却很能跟上年轻人的潮流，比如他说他有一个ipodmini,还在网上itunes商店买过歌。
我还跟他就ipod聊了一阵子，因为我也有个ipod。
第三位教员是来自TexasMDAndersoncancercenter的sue-hwalin教授。
她是一个身材瘦小的中年妇女，台湾人，特搞笑，非常喜欢给我们讲她博士后老板的笑话。
一个笑话是这样的，有一天有一个学生向这个老兄投诉说和实验室另一人有矛盾。
这个老兄想了想，然后一本正经的说，和人产生矛盾了，一般有三种选择。
第一种呢，就是既然你恨他，那就杀了他好了。
那个学生听了之后，差点倒了。
这个老兄说看起来你丫没这胆量，那还有第二种选择，就是杀了你自己。
那个学生听了几乎要吐血。
这老兄一看乐了，然后说你既然没种杀人或者自杀，就剩第三种选择了，就是ignorethatguy哈。
还有另一个笑话，sue-hwalin的博士后老板虽然当了老板，但是还是喜欢做实验，并且和一个博后共用一个bench。
有一天那个博后指着这老兄的鼻子说，XXX呀，你把bench弄得太乱了，赶快给我清理干净了。
这老兄听了之后也不怒，而是慢条斯理的辩解说，每个人都有自己喜欢的工作方式，我喜欢乱，你丫管我呢，要是不喜欢，我们可以在bench上画条线划清界线，从此井水不犯河水。
哈哈哈。
这老美连三八线都出来了。
第四位教授是rutgersuniversity的konstantinSeverinov副教授，这老兄是俄罗斯人，这四位老师中最年轻的一位。
此君满头乱发，一脸大胡子，看起来很邋遢，所以一开始我对他印象不佳。
后来发现此人相当nice。
Konstantin特搞，有一次他做报告，他的电脑的桌面上有一堆乱七八糟的文件夹，其中有一个竟然是divorce!
我告诉坐我旁边的一个老美，老美说也注意到了，认为实在是很sad，呵呵。
另外，他有两个未成年的儿子，喜欢不断打他手机。
结果他常常讲实验讲到一半就得停下来接电话。
这个课结束之后，他还跑到冷泉港书店买了一堆虫子毛绒玩具给两个儿子做纪念品。
舔犊情深，可见一斑。
（三）不溶的Sigma32
四月六号早上，我们开始了第一模块的实验，Burgess教授负责。
这老兄研究了一辈子E.Coli的RNApolymerase。
E.ColiRNApolymerase核心酶是一个蛋白质复合体，只有合成RNA的活性，却没有识别DNA的能力。
Sigma系列因子能够识别启动子，并且与核心酶结合，从而实现转录。
我们这个实验的核心主角就是其中一个因子，叫Sigma32。
Sigma32可以识别heatshockgenes的启动子。
Sigma32过表达在大肠杆菌里面的时候，绝大部分形成了不溶的包涵体（inclusionbody），我们的任务就是要用变性剂溶解变性不溶的蛋白，然后做重折叠。
所有的buffer几乎都已经配好了，所以直接做就行了。
我们先用1%Triton来溶解细菌本身的一些蛋白，inclusionbody相当稳定，不溶于triton，所以这一步，绝大部分垃圾就被去掉了。
下一步就是用变性剂来溶解inclusionbody。
用什么好呢？
Burgess教授提到了sarkosyl。
sarkosyl（N十二烷基肌氨酸钠）是一种比较强的阴离子去垢剂，0.3%的浓度就可以让包涵体溶解。
sarkosyl的优点是，虽然在高浓度下有变性作用，低浓度下却对蛋白质有稳定的作用。
所以用sarkosyl做重折叠之前的变性剂是再好也不过的了。
Burgess还要我们试了经典的GudnHCl（盐酸胍）来变性，作为对比。
Inclusionbody在这两种变性剂下很容易就溶解了。
然后我们得去掉变性剂，做重折叠。
怎么做呢？
方法有很多种，最简单的是透析，把变性剂全部换掉。
这个方法Burgess并不喜欢，因为，透析是个缓慢的过程。
在透析袋里面，蛋白的浓度还是很高。
折叠中间产物容易相互接触形成不溶的聚合物。
另一种方法是突然稀释变性的蛋白，由于蛋白浓度相对与透析低了很多，好一点。
但是问题也是类似的。
Burgess提议用逐步滴加稀释的办法。
就是放一大烧杯的缓冲液，里面有一个磁石可以不断混合液体，然后一滴一滴加入变性的蛋白溶液。
由于烧杯里的溶液蛋白量是逐渐增加的，所以一开始蛋白折叠中间产物能够相互作用的几率大大降低了。
Burgess说的还真象那么回事，可事实上，嘿嘿。
我们先用试着重折叠GudnHCl溶解的Sigma32。
一开始还好，滴到后来，溶液就变浑浊了，最后几乎成了冲淡了的牛奶那样的东东。
Burgess脸色不好看，说不应该这样的。
我们一离心，沉淀出来一大堆不溶解的蛋白。
剩下的上清跑了一个PorosHQ50阴离子交换柱，拿到的蛋白很少，回收率小于5%。
失败啊。
从这里开始，我要岔开一下，讲一些跟这个模块实验没太大关系，但是很有意思的东西。
（四）Hydrostaticpressure和跑小柱子的trick
Dr.Burgess假定我们对蛋白质纯化一无所知，所以讲得很细致。
比如他特别提到了disposablecolumn的用法。
这种小柱子很简单，把beads倒进去，冲洗一下就可以用来纯化蛋白了，很方便。
唯一的问题是，由于是依靠重力跑，速度有时候会十分慢。
液体流经柱子速度由hydrostaticpressure（静流体压力）来决定。
而hydrostaticpressure又是由实际柱高（即液体经过的长度）来决定。
如果你嫌液体流得太慢（尤其是洗柱子的时候），可以在柱子下端出口连一个长的塑胶管子或者针管，这样速度会快很多。
这是很简单的小trick，但我觉得对初做蛋白质纯化的人还是很有帮助的。
我知道一个例子。
我原来很喜欢女生A，有一天晚上主动等在她实验室等她做完实验，就开车送她回家。
这一等不得了，从晚上七点等到了凌晨一点。
这个过程中，她好像没什么事情，但是每隔20分钟，她就会去一次coldroom。
作完实验了之后，我好奇的问她，到底是什么试验花了这么长时间，结果她说她在用一个disposablecolumn纯化蛋白，由于beads稍微多了一点，速度很慢，而protocol有一步要求用数百毫升的洗液来冲洗柱子。
所以她每隔二十分钟就去加洗液，所以白白花了好几个小时。
我听了之后都要ft了，没想到她们实验室竟然没有人告诉她，有简单的办法可以让柱子跑得快一点的。
只要在下端出口加一个长管子，她至少可以少等两个小时。
当然最简单的办法还不是这个，最简单的办法的是把盛有洗液的容器放高，然后利用虹吸的原理让液体源源不断的流经柱子。
同时，柱子的下端连上塑胶管，弯成一个连通器，这个连通器的高度应该略高于柱面，这样冲洗结束后，柱子就不会干。
如果用这种方法，A就不用在实验室待一晚上了，因为一切都是自动完成的。
我现在跟A已经完全没有来往了，但我对她映象还是十分深刻，主要就是因为她那晚跑柱子的经历。
话撤远了，现在再回到蛋百质纯化课。
（五）“万金油”buffer
Dr.Burgess这人特有意思，喜欢吹嘘他发现的小trick。
比如，他得意说他是全美国最早用coomassieblue染蛋白胶的人。
据他说，六几年的时候他看到一个澳洲的老兄的一片文章，讲述一种新奇的染料叫考马市亮蓝，比当时流行的染料amidoblack灵敏十倍以上。
所以他就写了一封信要了一些，结果效果奇好。
我们听得都目瞪口呆。
不过Burgess最自豪的，还是他的“万金油”buffer。
他告诉我们说，他几十年了，总喜欢用这个buffer的配方，什么蛋白都喜欢这种buffer，可以说到了包治百病的神奇地步。
尽管他吹得神乎其神，配方却十分简单。
这个buffer叫TGE，就是Tris，glycerol和EDTA。
配方是这样的：
50mMTrispH7.9；
0.5mMEDTA；
50mMNaCl；
5%glycerol。
Tris、EDTA、NaCl这三样都没什么，真正关键的是5%glycerol。
有了这个glycerol，很多蛋白，尤其是酶会十分稳定。
这个稳定的效果是十分惊人的。
Dr.Burgess就此跟我们讲了他的经历。
六十年代的时候，他还是个小博士后，在watson实验室里干，主要是纯化细菌RNApolymerase的各个亚基。
那时候一个大问题是RNApolymerase纯化出来后十分不稳定，放冰上，过30分钟，活性还会损失一半。
Burgess有一次不小心出了错误，把纯化出来的RNApolymerase和glycerol混合了。
结果意外发现，RNApolymerase变得十分十分的稳定。
稳定到什么程度呢，就是你把这个酶加上50%glycerol，用平信从美国寄十几天到澳洲，活性还有70~80%！
另外Burgess也提到，如果要保存的蛋白有二硫键，加一点DTT，防止蛋白形成非天然的二硫键，也会对蛋白质的稳定有好处。
为了让我们对这个“万金油”buffer的好处有感性认识，Burgess设计了一个实验让我们做。
他之前已经准备好了在大肠杆菌中表达的GFP包涵体（inclusionbody）。
我们把包涵体分成两部分，一部分用guanidiniumhydrochloride（盐酸胍）溶解变性，另一部分用sarkosyl（N十二烷基肌氨酸钠）溶解变性。
然后把这些溶解的GFP溶液分到一个96孔板上,每个孔10微升，然后加入20倍的refoldingbuffer来稀释，稀释了之后，变性的GFP就开始重折叠。
我们有一个hampton卖的refolding试剂盒，内有十几种不同配方的refoldingsolution。
我们试了所有这些buffer同时还试了TGE，TGE+15%glycerol，TGE+35%glycerol，TGE+45%glycerol，这四种buffer。
由于GFP折叠好了才能发荧光，用一个fluorescenceplaterreader，我们可以实时监控折叠的效果。
结果让人很吃惊，Hampton卖的这个试剂盒，虽然配方都很fancy，但是一塌糊涂，没有一种溶液能让GFP重折叠的很好。
相比之下，TGE的四种溶液都很好，GFP重折叠的效率是hamptonkit的几十倍。
最强的是TGE+35%glycerol。
另外，不论是用GudnHCl变性还是用sarkosyl来变性，TGE+glycerol的重折叠的效果都很好。
实验结果出来后，看着我们惊讶的表情，Burgess脸上都笑开花了，呵呵。
这个实验我还学到的一个教训是，不能迷信商业化的kit，很多kit吹得很牛，但并不一定真的好用。
（六）兴风作浪的乳糖（lactose）
晚上每天都有人做报告，我觉得让我收获最大的是BillStudier的报告。
本来这个报告是后来才听到的，但是由于Burgess的模块是唯一的涉及大肠杆菌中表达蛋白的，我把这一段提前来说说。
Studier这老哥是BrookhavenNationalLaboratory的，一生研究T7噬菌体，也是T7RNApolymeraseinductionsystem（pET系列质粒）的发明者。
T7系统在大肠杆菌表达蛋白的应用实在太广泛了，但凡表达蛋白的兄弟姐妹们的不可能不知道这个系统。
长话短说，pET系列的质粒都用T7promoter来控制基因的表达。
T7promoter只能被T7RNApolymerase识别，而这个咚咚大肠杆菌是没有的。
但是有一些溶原菌株，染色体里面已经整合入了由LacUVpromoter和lacoperon控制的T7RNApolymerase基因片断。
如果在细菌培养基里面加入IPTG，来诱导T7RNApolymerase的表达，就可以启动目的蛋白的表达。
这个系统非常强大，原因在于T7RNApolymerase工作起来非常有效率，效率高到什么地步呢？
就是表达一个蛋白，表达量可以占到大肠杆菌总蛋白量的50%！
大家可以想象，这种系统虽然很强大，但是表达量太大，对大肠杆菌有毒性，造成的结果就是大肠杆菌十分排斥表达蛋白的质粒。
这一点我深有体会。
我曾经想用细菌表达一个蛋白，而且估计这个蛋白会形成包涵体。
妖怪的是，用质粒转化蛋白表达菌株BL21（DE3）怎么也不能转化，铺的板一个菌落也没有。
我当时就怀疑是因为表达的蛋白对大肠杆菌有毒性，仅仅是本底的一点表达就足以杀死细菌。
我来来回回一共转化了五六次，最后终于找到了唯一的一个菌落。
虽然当时我怀疑过本底表达是罪魁祸首，但是我没有仔细想过本底是怎么来的。
这个问题到了billstudier做报告之后，才真相大白。
原来我们一般用的LBbroth有三种成分，其中一种是tryptone。
Tryptone是caseine的酶解产物，而casein又是milk里提取而来。
由于milk有乳糖（lactose），tryptone里面也有乳糖的污染。
Billstudier研究发现即使很微量的lactose也能有效的诱导蛋白表达。
原来如此
所以要解决我原来的那个问题，用一种不含有乳糖的media做培养板就完事了。
有意思的是，细菌有一种很有意思的特点，如果培养基里有足量的glucose，细菌会优先摄取glucose，而不能摄取lactose。
Billstudier根据这个特点研究出一种可以自动诱导的培养基。
这种培养基含有成比例的glucose和lactose。
细菌首先摄取glucose，不摄取lactose，当细菌长到一定密度，耗完glucose之后，就开始摄取lactose，从而开始诱导表达。
所以用这种培养基养菌，很省事，接种了第二天收细菌，提蛋白就行了。
最后Billstudier老爷子特别强调的是细菌的供氧。
氧气是限制细菌生长最重要的瓶颈，如果有足够氧气在培养基里面，大肠杆菌的密度可以从一般的OD6002~3翻十倍到20~30！
要提高培养瓶的供氧，可以用baffledflask。
这种flask的瓶底边缘有几处凹陷（类似于可乐塑料瓶底那样的形状），能有效增加空气培养基的混合。
最后，详细内容可以见下列文献：
ProteinExpressionandPurification41:
207~234（2005）
（七）古怪的CDC6
这里再给大家讲一个在大肠杆菌中表达蛋白质的例子，一个很夸张的例子，但是很有启发性。
BruceStillman是冷泉港的现任主管，是一个绝对的牛人。
不但科学做得很好，而且还很爱国。
他是澳洲人，在美国待了N年，却从没有加入美国国籍，所以他只是外籍院士。
我们的晚间报告有一个是他作的。
他主要研究真核生物的DNA复制。
这是一个到现在为止都没有完全弄明白的领域。
在报告里面，他特别提到了表达纯化CDC6蛋白的经历，我觉得十分有意思。
这个蛋白，用他的话说，是“apainintheass”。
CDC6是干什么的呢？
这要从ORC说起。
真核生物的DNA有多个复制起始位点（replicationorigin），ORC（OriginReplicationComplex）是一个很大的蛋白复合体，可以识别这些复制起始位点。
ORC在整个细胞周期里面都是与DNA结合的。
在G1期里面，CDC6这个蛋白会与ORC结合，同时让MCM（DNA解旋酶）也装载到ORC上，形成一个prereplicationproteincomplex。
这个complex一旦形成，DNA复制的准备工作就完成，只等其他kinase的激活，细胞从G1进入S期，复制就开始。
Stillman实验室一直想表达酵母的CDC6和ORC的重组蛋白，然后做结构研究。
但是到了CDC6，他们碰到了大麻烦。
首先他们尝试真核系统来表达，但是意外的是，他们发现表达出来的CDC6完全没有活性。
然后他们尝试用大肠杆菌来表达。
首先发现37度诱导表达出来的蛋白不溶，重折叠也没有用。
然后他们尝试在室温下诱导表达，发现蛋白虽然可溶了，但是都被降解了。
然后呢，他们就想到了加一个GSTtag，这下好了，蛋白也可溶了，也不被降解了，但是还是没有活性。
他们估计是因为GST可以形成dimer，干扰CDC6的正常功能。
所以呢，他们重新做了一个construct，在GST和CDC6序列中间加了一个蛋白酶切割位点。
正当他们满心欢喜的以为问题解决了的时候，意外又出现了。
有GST的CDC6是可溶的，可是一旦把GST切掉了，CDC就沉淀出来了....@#%#^&
%$^#
几乎是山穷水尽了，但是做这个project的博士后还是没有放弃希望，他做了最后的孤注一掷。
他猜到这个蛋白可能很不稳定，对缓冲液要求可能很高，所以他让一个本科生连续试了十多种buffer，最后发现如果用磷酸钾＋谷氨酸钾缓冲液，切掉GST之后CDC6就不会沉淀了。
Stillman认为谷氨酸根和磷酸根跟氯离子相比更接近与核酸，可能让CDC6更稳定。
这个CDC6一共花了他们18个月时间，却就这一点小trick！
这以后，他们表达的CDC6都有活性了，后来做了一系列的电镜三维结构重构实验，研究CDC6和ORC的复合体结构。
Stillman实验室正在准备一篇文章要投到nature上去。
大家等着看把。
（八）“液体DEAE”
绕了这么大一圈，现在再回到第一个模块的实验来。
前面提到Dr.Burgess要我们试GudnHCl溶解Sigma32之后的重折叠，结果很糟糕。
我们接着试了用sarkosyl做变性剂的蛋白重折叠。
步骤和前一个类似，只是这一次是突然稀释至25倍体积。
效果好了很多，至少没有浑浊现象了。
接着我们用PorosHS50，一种阳离子交换柱，来把可溶的Sigma分离了出来。
为什么这一次用PorosHS50而不是前面用的阴离子交换柱呢？
因为sarkosyl带负电，会与阴离子交换柱结合得很好。
再加上Sigma32很奇怪，既有负电的表面，又有带正电的表面，所以可以用阳离子交换柱。
值得一提的是绝大部分蛋白质都是偏酸性，所以阴离子交换柱用的比阳离子交换柱频繁得多。
好了，聊完离子交换柱，现在回到Dr.Burgess要我们作的另一个很重要的实验。
Sigma32在大肠杆菌过表达的时候，绝大部分都是inclusionbody,但是也有一部分是可溶的。
这些可溶的Sigma32可以和细菌体内的CoreRNApolymerase结合形成复合体。
我们这个实验就是要把这个复合体纯化出来。
核心办法是用免疫亲合柱来纯化。
但是为了提高纯化的效果，Burgess要我们提前用PEI沉淀的办法来粗分一下。
PEI是什么呢？
就是polyethyleneimine（聚乙烯亚胺）。
这个东东我过去没碰到，所以很感兴趣。
PEI呢是一个带正电的polymer，和酸性蛋白质和核酸结合以后聚合体沉淀出来。
由于这种结合是受离子强度影响的，感觉上很象DEAE那之类的性质，所以Burgess称之为“液体DEAE”。
RNApolymerase和DNA是结合的，所以PEI沉淀DNA的同时，把RNApolymerase+sigma32都沉淀了下来。
然后再用高盐洗脱蛋白质，而DNA和PEI结合很紧密，所以还是在沉淀里面。
这样一来，好多垃圾蛋白和核酸都被去掉了。
到了这一步，还有一个问题。
就是洗脱下来的蛋白里面还有PEI，如果现在就用透析的办法降低盐浓度，PEI和蛋白会重新形成沉淀。
所以下一步就是用硫酸胺沉淀的办法把蛋白和PEI分开。
用低盐buffer重溶沉淀的蛋白，过免疫亲合柱就行了。
免疫亲合柱就没有什么好说的了。
最后结果很不错，跑胶后用coomassieblue就可以清楚的看到RNApolymerase的各个亚基。
（九）沉淀，沉淀，沉淀
上一部分我匆匆提到了用硫酸氨沉淀来去掉PEI（Polyethyleneimine）的步骤。
不常做生化的同学可能对硫酸氨沉淀的方法不熟悉。
但其实这种沉淀是蛋白质纯化中及其重要的一种方法。
说实话我过去也很少接触，但是在
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