聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法Word格式文档下载.docx
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（1）凝胶及缓冲液配制系统
有关资料很多，可以根据需要选择适宜的系统。
列表4供参考。
最常用的是系统1（所谓Davis的标准状态）。
各种贮存液配制后，盛于棕色瓶中，贮冰箱备用。
用时需测PH值，以检查是否失效。
TEMED要密封贮藏。
过硫酸铵溶液最好现用现配，不宜超过一周。
表4几种适用电泳的聚丙烯酰胺凝胶系统
<
DIValign=center>
系统Ⅰ
（PH值8.9）（7.2%）
系统Ⅱ
（PH值7.5）（7.5%）
系统Ⅲ
（PH值4.3）（15%）
系统Ⅳ
（PH值2.9）（7.5%）
溶液号
组份/100ml
PH
值
组份/100ml
PH值
1
1mol/lHCl
48.0ml
Tris36.3克
TEMED
0.46ml
8.9
15
1mo;
/LHCl
Tris6.85克
7.5
17
1mol/LKOH
醋酸17.2mlTEMED
4.0ml
4.3
20
1mol/lKOH
12.0ml
醋酸.25ml
1.15ml
2.9
2a
丙烯酰胺
28.0克
双丙烯酰胺0.735克
8
2
30.0克
双丙烯酰胺0.8克
6
60.0克
双丙烯酰胺0.4克
21
过硫酸铵
2.8克
3
0.14克
16
1NH3PO4
39.0ml
Tris4.95克TEMED0.46ml
5.5
18
0.28克
22
1NKOH
48.0升
醋酸2.95ml
5.9
4a
1NHCl
48ml
Tris5.98克
6.7
19
醋酸2.87ml
5
10.0克
双丙烯酰胺2.5克
核黄素
4.0mg
7
蔗糖
40.0克
电极缓冲液：
Tris6.0克
甘氨酸28.8克
加水至1升
使用：
10%稀释液
8.3
二乙基巴比妥5.82克
Tris1.0克
7.0
β-丙氨酸32.2克
醋酸8.0克
加水至1升
4.5
甘氨酸28.1克
醋酸3.06ml
4.0
电极：
上槽接负极Θ
下槽接正极⊕
上槽接正极⊕
下槽接负极Θ
各溶液混合比
浓缩胶
分离胶
1份4a号
2份5号
1份6号
4份7号
1份1号
2份2a号
1份水
4份3号
1份16号2份5号
1份15号
2份2号
1份19号
1份17号
2份8号
4份18号
1份22号
4份20号
2份21号
（2）指示剂配制
蛋白质样品通常是无色的，为了观察和估计样品在凝胶上迁移情况，常加指示剂作为电泳迁移的可见标志。
对碱性缓冲系统，一般用溴酚蓝或酚红，对于酸性缓冲系统，一般用甲基绿或次甲基兰。
指示剂可直接加在样品中，也可加在电泳槽的缓冲液中，也可加在玻管中。
溴酚蓝通常配制成0.1%的母液备用。
（3）染色剂配制
蛋白质的染色方法很多，常用的染色剂有氨基黑10B，考马斯亮蓝R250，考马斯亮蓝G250等，有关配制浓度，染色方法以及同工酶的显色方法见操作过程中的染色部分。
4.操作技术
（1）凝胶制备
配制凝胶前，应把玻璃管装好。
装玻管的方式很多：
在凝胶架的孔洞内，加少许40%蔗糖溶液，然后把洗净干燥的玻璃管套上乳胶管，插入架的孔洞内，使玻璃管、乳胶管与孔底相平；
玻璃管的一端用青霉素瓶盖封口，或者用附有玻璃短柱的乳胶管封口；
底平坦的玻管也可用橡皮膏布封口，封口的玻管安放在试管架上；
也可把玻璃管用橡皮筋捆扎在一起，一端搞平后放在培养皿中，然后用1%琼脂趁热倒在培养皿中，冷却后，玻璃管口即被琼脂凝胶封住。
配制凝胶时，先将所需的贮备液自冰箱中取出，放至室温下预温。
聚丙烯酰胺凝胶通常只制备二种胶。
先制备分离胶，再在分离胶上面制备浓缩胶，样品胶一般不制作，这是因为①有些样品会抑制胶聚合；
②光照可引起某些蛋白质变性；
③多了一道手续，延长制胶时间。
分离胶的制备：
按表4比例混合贮存液，（先不与过硫酸铵混合），放在真空干燥器中抽气，排除溶液中空气。
抽气后在贮存液中加入过硫酸铵混匀，用注射器沿玻璃管壁慢慢注入胶液，各支玻管注入的量要相同，或按事先作好标记，注胶到相同的高度。
务必勿使气泡出现。
为了使凝胶表面平整，在凝胶表面再慢慢地加入一层水，约3～5mm高度，消除凝胶的弯月面。
加水要小心，切勿冲乱界面。
加水的另一作用是隔绝空气中氧与胶液接触。
以防影响顶部胶层的聚合。
注射器中残留的胶液要立即清洗掉，以防胶液在针头与注射器中聚合，而使其损坏。
水层放好后，静置30分钟，使凝胶进行化学聚合反应。
聚合最适温度为25℃。
当水刚加入胶面时，水与凝胶形成一界面，后界面慢慢消失，当凝胶聚合时，水与凝胶之间又出现界面。
界面的再出现表明凝胶已经聚合，再静置20～30分钟，聚合便完全。
分离胶的预电泳（此步骤应根据实验的需要决定取舍）：
凝胶聚合程度一般在90%以上。
残留的物质，尤其是过硫酸铵，对某些样品（如酶）会造成钝化或引起其它人为效应。
因此有时需要在正式电泳前，先用电泳方法除去这些残留物，称为“预电泳”。
若直接用光密度计来扫描分离的区带，则预电泳更为重要，因未聚合的丙烯酰胺单体对紫外光有较高吸收，会干扰测定。
步骤：
去除玻管封口，倒出玻管中凝胶上的水分，并用分离胶缓冲液洗涤一下。
把玻管插入电泳装置中。
上下电极槽中均加入分离胶缓冲液，预电泳的电流为3mA/管，时间需30分钟～2小时。
预电泳不能在制好浓缩胶后进行，也不能用电极缓冲液进行，不然会破坏不连续系统，而使浓缩效应失效。
浓缩胶的制备：
分离胶聚合好后，或已经过预电泳的分离胶，用注射器小心吸去水层，用滤纸条吸去残余的水。
按表4中比例混合浓缩胶液（也预先抽气，抽气时不要与核黄素混合，使用时再混匀），先用这种凝胶液漂洗一下分离胶顶，除去漂洗液后，再用注射器加浓缩胶溶液1cm左右，各管加的高度应一致，并在上面加水层压平胶面。
放在两只20W以上功率的日光灯下，约离灯管10～15cm处，光下聚合60分钟左右，当浓缩胶由浅黄色变为不透明的乳白色，即聚合完成，取出水层，吸干后用电极缓冲液洗涤，准备加样。
浓缩胶应临用前制备。
（2）样品的准备
聚丙烯酰胺盘状电泳可用于分离各种蛋白质、核酸等样品。
例如血清、唾液、细胞膜蛋白，动植物及微生物的各种蛋白提取液，昆虫的体液，各种酶制品，色素蛋白复合体以及核糖核酸等。
初学者可用现成的蛋白质样品如血清练习操作。
盘状电泳所需要的样品是很少的。
一个标准凝胶管按体积，需要5～100μl的样品（约0.1～2mm高）；
按含量需要5～100μg。
实际上就是用0.1%浓度的样品5～100μl。
由于样品组分的不同，用量可有一定的幅度。
对于只含有少数组分的样品，通常用10～20μg，对于含有多种组分的样品，可用到200μg。
即每一凝胶的样品容纳量不仅指所加的样品总量，更重要的是指样品混合物组分的量。
所加样品液量的精确性将影响重复性，误差要不大于±
5%。
近来，样品胶一般已改用样品液中加入5%～20%的蔗糖或10%甘油代替，因为样品胶的作用主要是抗对流，蔗糖液和甘油能起同样的效果。
如果样品离子强度太高，会引起分界面模糊不清，严重时完全不能进行电泳。
因离子强度太高时降低了蛋白质的电动电位，同时电导过高，在样品部分几乎没有电势梯度，以至样品的泳动速度近于零，不能泳动。
硫酸铵盐析的样品或柱层析高盐浓度的洗脱部分，必须透析除盐，务必使其电导低于分离胶的电导，以便形成足够的电势梯度，使区带在分离之前进行浓缩变窄。
如果样品过稀，加样体积太大时，相应地加厚浓缩胶层。
玻璃管也要适当加长。
通常稀样液与浓缩胶的比不大于1∶1.2。
一个生物样品（粗抽提物），常需要事先经过处理（高速离心，微孔滤膜过滤，柱分离等）去除沉淀，消除混浊。
或只取可溶性部分进行电泳。
不然常有许多物质留在凝胶与缓冲液的界面上，阻塞凝胶，干扰分离。
当样品装载量与样品溶解度不相应时，也会在浓缩胶上或浓缩胶与分离胶界面上产生沉淀，并造成拖尾现象（随着电泳过程，沉淀逐渐溶解，逐渐进入）。
加样前先把密封下口的物件除去，如果是拔橡皮帽，应先让空气进去，再拔管子，防止凝胶拉坏。
下槽中放满缓冲液，把玻管固定在盘状电泳槽上槽的洞中。
安装时要特别注意保证凝胶管垂直和橡胶塞孔密封不漏。
管的下端悬一滴电极缓冲液。
先在下槽放上电极缓冲液，再把上槽放在下槽上，避免管下有气泡。
然后加样。
加样方法因人习惯不同而略有差异。
有的把样品与增加比重的蔗糖及指示剂先混在一起加样；
有的指示剂单独加在玻璃管中或在上槽电极缓冲液中滴上几滴指示剂。
加样时，有的先加好样液，再在样品上加几滴缓冲液，然后在样液上加电极槽缓冲液；
有的先在上槽中加满电极缓冲液，然后用加样器插在缓冲液中往胶管浓缩胶上方加样。
总的原则，先提高样品的比重，后加样，加样和加电极缓冲液互不干扰。
（3）电泳
在电泳槽中注满电极缓冲液。
缓冲液应事先在冰箱中预冷，上槽电极缓冲液必须浸没玻管和电极。
连接直流稳压电源，缓冲液系统为碱性时上槽为负极，下槽为正极。
缓冲系统为酸性时则相反。
Davis标准状态的凝胶电泳，负极在上，正极在下，电泳槽一般放在冰箱中，保持温度在0～4℃。
打开电源开关，调节电流，开始时用1～2mA/管，电泳3～5分钟后，再逐渐升高到4mA/管。
不要一开始就电流很高。
电流最好不要超过5mA/管。
太高的电流强度会造成产热量大，使分离失败。
如果高温对样品不利，可降低电流，延长时间，或进行有效冷却，在整个电泳过程中，一般要求电流保持稳定。
电泳时间与所用缓冲液和样品有关，一般根据指示剂的迁移来决定，如果指示剂已迁移到凝胶柱的下口附近，或已迁移管长的3/4距离时，就可停止电泳，关闭电源，取出玻璃管。
上槽电极缓冲液可连续使用几次，但必须每次测一下PH，如PH值发生改变就不能再使用。
每次电泳后，下槽中混入了催化剂及氯离子，如将下槽缓冲液用于上槽，则影响电泳。
重要的电泳，电极缓冲液最好用新鲜的。
（4）剥胶
为了防止电泳后凝胶中蛋白（酶）盘状区带扩散，电泳完毕必须立刻取出凝胶柱进行固定与染色，一般用20～30ml的注射器配上10cm长的针头，左手拿玻管，右手握灌满水的注射器，将针头插入凝胶与管壁之间，左手慢慢旋转玻管，右手一边压水，一边使针头呈螺旋式推进。
靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，一般情况下，针头抽出，胶就自动滑出。
如果不出，就从另一端再注水或用洗耳球在一端稍加压力。
如果胶浓度较高，取出困难，可用10%甘油水溶液代替水注入。
一般剥胶的方向是从浓缩胶端开始。
剥胶时应注意不要损伤胶柱表面。
（5）固定与染色
为防止凝胶柱内已分离成分的扩散，需要进行固定。
剥出的凝胶柱只要浸泡在7%乙酸或12.5%三氯乙酸的水溶液中几分钟就可达到蛋白带固定的效果。
也可浸泡在用7%乙酸或12.5%三氯乙酸配制的染色液中，同时进行固定和染色。
如果用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和鉴定同工酶，为了让酶带上进行某种显色反应，往往是先显色后固定。
三氯醋酸固定蛋白质的机制可能是这样：
其分子不仅与蛋白质带正电荷侧链结合，而且通过氢键与蛋白质的肽链结合，其结果使蛋白质分子失去水分子，同时在肽链表面包上一层疏水的CCl3基团，使蛋白质水溶性破坏，从水相沉淀在凝胶相上。
乙酸固定蛋白质的机制可能同三氯乙酸一样。
电泳后蛋白质区带的检测，对于不同的目的，应采用不同的检测方法，最常用的方法是用染料和生物大分子结合形成有色的复合物，选用染料通常应考虑以下要求：
A）必须与大分子结合以形成一个不溶性的，有色的，紧密的复合物，但不结合到凝胶中和支持膜上，以便从凝胶中除去，否则背景会影响蛋白带的辨别和定量扫描;
B）染料必须容易溶解在对大分子没有影响的溶剂中，以利于背景的脱色;
C）选用高吸光系数的染料有利于提高定量测定的灵敏度;
D）选用能与大分子有专一性结合的染料，并在结合后能产生不同的颜色，可以提高检测的选择性。
用于蛋白质区带染色的试剂常用的有氨基黑10B、考马斯亮蓝，1-苯胺基-8-萘磺酸等，其性能及染色原理如下：
①氨基黑10B（aminoblack10B）C22H13O12N6S3Na3MW＝715λmax＝620～630nm氨基黑是酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。
是最常用的蛋白质染料。
但用氨基黑染SDS-蛋白质时效果不好。
另外氨基黑染不同蛋白质时的着色度不等，色调不一（有蓝、黑、棕等），作同一凝胶柱的扫描时误差较大，需要对各种蛋白质作出本身的蛋白质-染料量（吸收值）的标准曲线。
②考马斯亮兰R250（CoomassiebrilliantblneR250）即三苯基甲烷（triphenylmethane）C46H44O7H3S2NaMW＝824λmax＝560～590nm染色的灵敏度比氨基黑高5倍。
尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色，但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白的染色不合乎Beer定律，用作定量分析时要注意这点。
③考马斯亮兰G250（CoomassiebrilliantblneG250），即二甲花青亮蓝（XyleneCyaninebrilliantBlue），MW＝854，λmax＝590～610nm，染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。
优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色。
所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。
氨基黑与考马斯亮兰两种染料的共同点是：
都带有负电荷的磺酸基，能与蛋白分子上带正电荷的侧链相结合。
但是，氨基黑分子含有较多的亲水基团，和蛋白质亲水微区以及亲水的凝胶基质有很大的亲和力。
而考马斯亮兰却相反，含有较多的疏水基团，和蛋白质的疏水区有较大的亲和力，而和凝胶基质的亲和力不如氨基黑。
因此，用考马斯亮兰染色的漂洗要容易得多。
另外，考马斯亮兰的灵敏度要比氨基黑高。
4.1-苯胺基-8-萘磺酸（1-animo-naphthalsulfonicacid简称ANS），MW＝241，本身无荧光，但与蛋白质结合后则产生荧光。
电泳后，凝胶在此染料溶液浸1～3分钟，用长波紫外灯照射时产生黄色荧光，可显示蛋白质100mg，如果不明显，可将凝胶取出暴露于空气或盐酸气中，或浸没在3mol/L盐酸中几秒至2分钟，使表面蛋白质稍变性,然后再用
表5蛋白质的常染色法
方法
固定液
染料
染色时间
脱色
氨基黑
10B
甲醇
7%乙酸
0.1N氢氧化钠中1%氨基黑
7%乙酸中0.5%～1%氨基黑
5分钟（室温）
2小时（室温）
10分钟（96℃）
5%乙醇
考马斯亮兰R250
20%磺基水杨酸
10%三氯乙酸
样品中含尿素的在5%三氯乙酸中固定
0.25%R250水溶液
10%三氯乙酸-1%R250
19∶1（V/V）
5%磺基水杨酸和1%R250
19∶1
0.5小时（室温）
1小时（室温）
90%甲酸
考马斯亮兰G250
6%乙酸
12.5%三氯乙酸
6%乙酸中1%G250
12.5%三氯乙酸中0.1%G250
10分钟（室温）
30分钟（室温）
甲醇-水-浓氨
64∶36∶1
1-苯胺基-8-萘磺酸
2mol/L盐酸浸几秒种
PH6.8，0.1mol/L磷酸盐缓冲液中0.003%染料
3分钟
Ponceau3R
0.1mol/LNaOH中1%3R
2分钟（室温）
固绿
7%乙酸中1%固绿
2小时（5℃）
ANS染色，这样可显示蛋白质20μg。
这种染色优点是可保留凝胶内中的酶和抗体的活性。
可将该区带切下来进行酶活力测定，也可直接把凝胶捣碎研细，用作抗原来注射动物，聚丙烯酰胺不影响抗体的产生。
常用染色方法见表5。
（6）脱色
凝胶柱染色后，先用水洗掉表面染料，然后放在脱色液中浸洗，常用的脱色液有7%乙酸，甲醇-水-乙酸溶液等。
经常更换新溶液，直到染料洗出，背景几乎无色为止。
用氨基黑染色的，脱色时间较长，而考马斯亮蓝染料易于脱色。
为了短时间得出结果，可采用电泳脱色。
即在一玻璃或有机玻璃槽中盛7%的乙酸溶液，已染色的胶放置在槽中间，两边加铂金电极，并通直流电，电压30～40V，电流0.5A左右，1～2小时即可脱色完毕。
（7）结果的记录
记录电泳结果常用的方法有
①绘制示意图，将各个样品的酶带如实地描绘下来，根据酶带宽窄，颜色深浅，拟分七级表示之（图10）。
图10酶带的分级标准
②测量相对迁移率（Rf）:
分离区带的泳动速度可用相对迁移率来表示。
测定迁移率时，在电泳结束后要先在指示剂移动的位置（前沿）作一标记（通常是插一根短铜丝），染色后，量出指示剂移动的距离和酶带移动的距离。
Rf＝酶带迁移距离/前沿指示剂迁移距离
测量迁移率时，应以酶带的中部位置为准，值得注意的是，交联剂的浓度，交联剂和丙烯酰胺的比例，催化剂浓度及聚胶时的温度和时间均对凝胶柱结构有影响，因而会影响迁移率。
另外，电泳时电场强度等也会影响带电颗粒迁移速度。
为了使试验重复性好，这些因子都应尽可能保持恒定。
③照相：
采用透射照相方法，用照相机把酶带真实地拍摄下来，盘状电泳的凝胶柱一般放在试管中（注满脱色液或保存液）拍摄。
对于绿色、蓝色和暗蓝色的染色区带，照相时可加黄滤色镜，能增加清晰度。
④光密度计扫描定量：
把酶带放在光密度扫描仪上，描绘酶谱——光密度曲线。
配合计算机，可作定量分析。
（二）垂直平板电泳
垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳和管型盘状凝胶电泳相比，具有以下优点：
①一系列样品可以在相同的制板、电泳、显色条件下进行比较，减少试验误差；
②在一块平板上点样数目可根据需要任意变动，可多可少；
③凝胶可制成干板，作为科研资料长期保存；
④电泳后取胶、显色、摄影等都较方便，并能得到较好的效果。
由于具有上述优点，故近年来垂直平板凝胶电泳技术发展较快，现将方法介绍如下：
垂直平板凝胶电泳所用的电泳仪，配制分离胶、浓缩胶的试剂，以及固定染色、脱色用的药品可与盘状凝胶电泳通用，所不同的主要在电泳槽结构上，以及随之带来的操作方法上。
1.器材夹心式垂直板电泳槽，凝胶模（135×
100×
1.5mm）（北京六一仪器厂），直流稳压电源（电压300～600V，电流50～100mA），吸量管（1，5，10mL），烧杯（25，50，100mL）,细长头的滴管，1mL注射器及6号长针头，微量注射器（10μL或50μL），水泵或油泵，真空干燥器，培养皿（直径120mm），玻璃板（13×
13cm），玻璃纸2张（18×
18cm），日光灯一台。
2.操作方法
图11夹心垂直平板电泳槽示意图
图12凝胶模示意图
3.操作技术
（1）安装夹心式垂直板电泳槽夹心式垂直板电泳槽（图11）两侧为有机玻璃制成的电极槽，两电极槽中间有一凝胶模（图12），该模由ㄩ形硅胶框，长、短玻璃板，模板梳组成，电泳槽由上贮槽（白金电极面对短玻璃板），下贮槽（白金电极面对长玻璃板）和回纹冷凝管组成，两电极槽与凝胶模间靠贮液槽螺丝固定，其组装顺序为：
①装贮槽和固定螺丝销钉；
②将洗净的长、短玻璃板分别插到ㄩ形硅橡胶框的凹形槽中，注意不要用手接触灌胶面的玻璃；
③将已插好玻板的凝胶模夹到贮槽中，短玻璃板应面对上贮槽，长玻璃板应面对下贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽；
④竖直电泳槽，用滴管吸取少量的1%琼脂糖溶液，灌入凝胶模板底部（长玻璃板外侧，下沿凹形小槽内），液面高度约0.5～1.0cm,待琼脂糖凝固后,即堵住凝胶模下面的窄缝（通电时又可作为盐桥）。
（2）制备凝胶板
①分离胶制备：
配制分离胶溶液（见表4），将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内（胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm），用注射器在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，并使胶面平整。
为防止渗漏，在上下贮槽中加入略低于胶面的蒸馏水。
约30～60分钟凝
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