秋季《食品毒理学》实验方案文档格式.docx

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5.皮肤无创伤、脓疮、疥癣、湿疹。

6.头颈部姿势端正。

颈项歪斜提示可能存在内耳疾患，不能用于实验。

7.消化道无呕吐、便秘、腹泻，粪便成形，肛门附近被毛洁净。

8.神经系统无震颤、麻痹、运动失调，如有转圈运动或倒提时呈圆圈摆动，不能用于实验。

9.四肢及尾四肢、趾及尾无红肿、溃疡。

10.食欲及营养良好

（二）实验动物的性别鉴定

1.大鼠、小鼠主要观察肛门与生殖孔的间距，雄性间距大，而雌性间距小；

雄鼠夏天或卧位可见睾丸，雌鼠腹部有明显乳头，大鼠6对，小鼠5对。

（三）实验动物的抓取和固定

实验前应了解动物的一般习性，正确抓取和固定动物，既要大胆，又要细心。

1.小鼠的抓取方法先用右手抓取鼠尾部提起，置于实验台上向后拉，在其向前方爬行时，用左手拇指和食指快速、准确抓取小鼠的两耳和颈部皮肤，将鼠体置于左手手心中，以无名指按住鼠尾根部，小指按住后腿即可。

右手则可进行灌胃或注射等操作。

（四）实验动物的称重、编号和标记

1.称重一般同一组内，同性别动物体重差异应小于平均体重的10％，组间同性别动物体重平均值相差应小于5％。

2.编号和标记

（1）染色法一般采用不同颜色的染料涂擦于动物不同部位的被毛染色，表示不同号码，此法适用于大鼠、小鼠和豚鼠。

常用的染料有苦味酸酒精饱和液（黄色）、美蓝溶液（蓝色）或甲基紫酒精饱和液、0.5％中性红或品红溶液（红色）等。

具体方法为：

头部为1号，按顺时针方向，右前肢2号、右肋3号、右后肢4号、尾跟5号、左后肢6号、左肋7号、左前肢8号、背部9号；

在相应部位涂染另一种颜色染料表示十位，两种颜色可编1~99号。

（五）实验动物的染毒途径和方法

1.经口染毒

（1）灌胃将毒物不经口腔和食道，直接灌入胃内。

急性毒性试验多用此法。

具体方法：

用带有灌胃器的适当容积注射器吸取所需的受试液（溶液、混悬液、乳液）备用。

①小鼠保定，一手紧抓住耳后、颈部皮肤，用无名指、小指和大鱼际肌压紧尾根部。

将动物固定成垂直体位，腹部面向操作者，使上消化道固定呈一直线。

另一手持注射器，将针头由动物口腔侧插入，避开牙齿，沿咽后壁缓缓滑入食道。

若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，当感到阻力消失时，即将针头深入至胃部。

如动物挣扎，应停止进针或将针头拔出，千万不能强行插入，以免损伤、穿破食道，甚至误入气管，导致动物立即死亡。

进针深度一般是小鼠2.5～４cm。

为验明灌胃针是否正确地插入胃部，可轻轻回抽注射器，如无气泡抽出表明已在胃中，可将受试液推入。

（2）喂饲将受试化学物均匀拌入饲料或溶于饮水中，由动物自由采食。

适用于染毒时间较长的毒性试验，如亚慢性和慢性毒性试验。

（3）吞咽胶囊将所需剂量的受试化学物装入胶囊内，强制动物咽下。

适用于易挥发、易水解和有异味的化学物，兔、犬、猫可用此法。

2．注射染毒外源化学物的毒性研究中，根据试验目的和需要，可选择腹腔注射、静脉注射、肌肉注射、皮下注射等途径染毒。

大鼠和小鼠经尾静脉注射，兔则经耳静脉注射。

（六）实验动物生物材料的采集和制备

毒理学研究中，常常需要采集动物的血液、尿液或组织，测定外源化学物或其代谢物的浓度。

因此，生物材料的采集和制备是毒理学研究重要的基本操作技术。

1．大、小鼠采血

（1）鼠尾采血。

适用于用血量较少的试验。

固定动物后，将鼠尾浸入45~50℃温水，使尾静脉充血，擦干，用酒精棉球消毒。

将尾尖剪去约2~3mm,拭去第一滴血，用血色素吸管（吸管内加抗凝剂与否，依试验需要而定）吸取定量尾血，然后用干棉球压迫止血。

如需要多次采血，可用火棉胶涂封，下次采血时去掉火绵胶。

鼠尾采血亦可用1ml注射器连接5~6号针头直接刺入尾静脉定量采血（鼠尾明显可见四条血管，上下两条为动脉，左右两条为静脉）。

（2）眼眶静脉丛采血。

操作者以左手拇指、食指抓住鼠两耳之间的皮肤，并轻压颈部两侧使眼球充分外突，眶后静脉丛充血，为防止动物窒息死亡，用力要恰当。

右手持玻璃毛细管（长7~10cm,内径1.5mm）从一侧眼内毗邻部以45度角向眼后方向刺入，捻转前进。

如无阻力可继续刺入，有阻力则抽出玻璃毛细管调整方向后再刺入，直至出血为止，小鼠大约2~3mm，大鼠大约4~5mm。

收集血液后，拔出毛吸管，用干棉球压迫止血。

本法短期内可重复采血，采血量小鼠一般为0.2~0.3ml，大鼠0.5~1ml。

（3）摘眼球采血。

保定方法同

（2）。

动物倒立，使眼球外突充血，用小镊迅速摘掉眼球，将血液滴入事先备好的容器内。

此法用于鼠类大量采血，仅使用一次。

（4）断头采血。

操作者一手握住动物，另一手持剪刀或断头钳快速断头，倒立动物将血液滴入容器，注意防止断毛落入容器中。

用于大鼠、小鼠。

（七）实验动物的处死方法

1.颈椎脱臼法多用于小鼠，一手按住鼠头，另一手抓住鼠尾猛力向后拉，

使动物颈椎脱臼，立即死亡。

2.断头法用于大鼠和小鼠。

保定者一手按住鼠头，另一手握住背部，露出颈部，助手持大剪刀或断头器剪断颈部，使之死亡。

此法不引起血浆皮质酮、儿茶酚胺升高，常用于血液及化学成分、组织酶测定。

3.击打法适用于较小的动物。

抓住鼠尾、提起，用力摔打其头部，鼠痉挛后立即死亡；

也可用器具击打动物头部，使其致死。

前法多用于小鼠，后法多用于大鼠和家兔。

4.其他电击法、枪击法、微波法等。

动物处死方法多种多样，原则是根据实验需要进行选择，同时尽量消除动物在试验过程中所致的疼痛和不适，遵守动物试验的职业道德。

四、作业

注明自己小组所选择实验动物的性别、体重及编号（画图说明）；

以及用专业术语描述小鼠粪便的颜色和形状。

五、注意事项

1.对实验动物要有尊重爱护的态度，实验操作必须严肃认真，注意力高度集中。

2.正确抓取动物，防止被咬伤；

严禁乱扔小鼠；

防止将小鼠掉在地上。

实验二亚硝酸盐的急性毒性观察

一、实验目的和原理

急性毒性是机体一次接触或24h内多次接触较大剂量外源化学物后所引起的快速剧烈的中毒效应。

亚硝酸盐是食品毒理学中常见的一种化学毒物，通过采用不同途径对小鼠染毒，观察其对毒性的影响及亚硝酸盐急性毒性反应的特征。

二、试剂、器材及动物

亚硝酸钠溶液（10mg/mL）

托盘天平、电子天平、容量瓶、烧杯、注射器、灌胃针、鼠笼、酒精棉球

成年健康小鼠100只（雌雄各半）

三、试验方法

（一）健康动物的选择及性别鉴定

（二）动物称重

（三）亚硝酸盐溶液的配置

（四）灌胃

1．动物的禁食和复食由于外源化学物质进入胃内后易受胃内容物作用而降低毒性，胃充盈时其内容物还可影响受试溶液的灌入和吸收，因此灌胃前应禁食6~10h，使动物既保持空腹状态，又不至禁食时间过长，否则动物长期饥饿会影响肝脏，进而影响实验结果。

动物灌胃后至少2~3h后才能复食，灌服油剂比水剂要求复食时间更长。

2.灌胃液浓度和容量相同剂量的受试化学物，若给以不同浓度可能会产生不同的死亡情况。

灌服体积大小亦可影响试验结果，体积太小，太浓，可能产生局部刺激或其他损伤；

体积太大，可能引起胃部机械性损伤，影响正常生理功能。

经口急性毒性试验中，常常是固定受试化学物体积，根据试验设计的剂量用1：

K系列稀释法将受试化学物配制成不同浓度的液体剂型灌胃。

其灌胃体积以体重的1%~2%计算，最多不超过3%，即小鼠每10g体重灌胃0.1~0.2ml，最多不超过0.3ml，根据实际经验得出灌胃量的极限是，小鼠0.5~1ml；

大鼠1~4ml；

豚鼠1~5ml；

家兔5ml;

鸡10ml/kg和犬50ml/kg。

3.灌胃操作技术主要有小鼠、大鼠及豚鼠灌胃法。

①小鼠保定，一手紧抓住耳后、颈部皮肤，用无名指、小指和大鱼际肌压紧尾根部；

②大鼠、豚鼠保定，一手抓住大鼠、豚鼠双耳后至背部皮肤。

均将动物固定成垂直体位，腹部面向操作者，使上消化道固定呈一直线。

进针深度一般是小鼠2.5～４cm，大鼠或豚鼠４～６cm。

（五）静脉注射染毒

四、中毒症状观察

1.中毒症状　染毒后认真观察中毒发生、发展过程，中毒特点和毒作用靶器官。

观察期间每3d称重一次，对死亡动物和实验结束时的存活动物全部称重，做大体病理学检查，取病变组织做病理组织学检查，为亚慢性、慢性和其他毒性试验剂量和观察指标选择提供参考依据，并按表2-1做好记录。

表2-1急性毒性试验观察原始记录

组别

动物编号

性别

体重（g）

染毒计量（mg/kg）

染毒

时间

症状及出现时间

死亡

时间

体重纪录（g）

实验记录者：

记录日期：

2.LD50计算根据受试动物种类确定计算方法，如改良寇氏法、概率单位法、Bliss法等，并在实验前设计计量分组和每组动物数，按选择方法求出LD50及其95％的可信限范围。

如毒性反应存在种属或性别差异，应分别求出不同种和不同性别动物的LD50。

五、结果评定

根据实验动物的中毒症状、死亡时间、LD50及急性毒作用特点，按受试化学物种类分别参照相应化学物经口急性毒性分级标准进行评定，初步判断该受试化学物的毒性大小及毒性特征。

六、作业

完成急性毒性原始记录表，并简要分析不同途径染毒毒性差异的原因。

七、注意事项

1.防止操作者中毒。

2.剩余受试化学物和实验动物应在教师指导下处理。

实验三小鼠精子畸形试验

一、实验目的

精子畸形试验是检测受试化学毒物能否破坏哺乳动物精子正常形态的试验方法。

通过该实验，学习和掌握小鼠精子畸形试验的原理和步骤。

二、实验原理

精子畸形是指精子的形状异常和异常精子的数量增多。

生殖系统对化学毒物的作用十分敏感，在其他系统还未出现毒性反应前，生殖系统可能已出现了损害作用。

正常情况下，哺乳动物的精液中也存在少量的畸形精子，但在某些化学毒物的作用下，特别是在可引起生殖细胞遗传性损伤的化学毒物的作用下，哺乳动物睾丸产生的畸形精子数量可大量增加。

因此，可以用检测雄性动物接触化学毒物后精子畸形率的高低，来反映该化学毒物的生殖毒性和对生殖细胞潜在的致突变性。

化学毒物引起精子畸形的机制尚未完全清楚。

正常情况下，精子的成熟和正常形态发生过程受多种基因调控，一旦这些基因中的一个或多个在化学毒物的作用下发生突变，就会导致畸形精子数量大量增加。

一般认为，常染色体上的基因调控精子畸形，Y-性连锁基因调控畸形精子的表现。

某些特异的染色体重排，如性、常染色体易位，是化学毒物诱发哺乳动物精子畸形率增高的主要机制。

三、器材和试剂

（一）器材

眼科剪、眼科镊、玻璃平皿、显微镜、擦镜纸、带橡皮头吸管。

（二）试剂

磷酸盐缓冲液（称取NaCl8g、KCl0.2g、KH2PO40.12g、Na2HPO40.91g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL）、生理盐水、甲醇（分析纯）、甲基磺酸甲酯或甲基磺酸乙酯或环磷酰胺、2%伊红水溶液。

四、操作步骤

（一）动物选择

成熟大鼠、小鼠均可使用。

一般采用雄性小鼠，年龄宜在6~8周。

因小鼠较为经济，且有大量实验证明小鼠在该试验系统中对化学毒物最为敏感。

（二）剂量和分组

试验至少应设3个以上剂量组，同时设立阳性对照组和阴性对照组。

接触化学毒物后每组至少应存活5只动物。

最高剂量组5d总剂量应能使部分动物死亡。

一般可采用LD50的2~4倍剂量，或预先做5d给予化学毒物的LD50，求得最高总剂量，然后以它的1/2（或1/5、1/10）作为下一组的接触剂量，依此类推。

阳性对照可用环磷酰胺20mg/kg或甲基磺酸甲酯75mg/kg或甲基磺酸乙酯60mg/kg进行腹腔注射，每天一次，连续5d。

阴性对照选用与受试化学毒物相同体积的溶剂。

对于不稳定或稳定性不强的受试化学毒物，应每天新鲜配制。

（三）染毒与采样

可采用1次或每天1次连续5d的方法进行染毒。

染毒途径多用腹腔注射，也可采用与人体实际接触化学毒物相同的途径，如经口、吸入和皮肤接触等。

一般认为精原细胞后期或初级精母细胞早期对化学毒物敏感，在接触化学毒物后4~5周精子畸形率最高，故选择在第一次染毒后第35d进行采样。

也可在染毒后第1、第4和第10周分3次采样，或者在染毒后每周采样1次，连续进行动态观察，直至精子形态恢复正常。

（四）制片

用颈椎脱臼法处死小鼠，剪开腹腔，分离并摘取双侧附睾，将附睾放入盛有约1mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的小平皿中，以眼科剪将附睾剪成小块，用吸管将悬浮液慢慢吹打5~6次，静置3~5min，用4层擦镜纸过滤除去组织碎片，吸取此精子悬浮液滴于清洁载玻片上，均匀推片，待玻片晾干后用甲醇固定5min，干燥后即可镜检观察精子形态。

也可用2%的伊红水溶液染色1~2h后再做镜检。

（五）阅片

在高倍镜下检查精子形态，可加上蓝色或绿色滤光片。

每只小鼠检查完整的精子200~500条，每个剂量组至少检查1000条精子。

精子畸形主要表现在精子的头部，可分为：

无钩、香蕉形、双头、胖头、尾折叠及双尾等形态。

但在镜检时，要特别区分两条精子部分重叠所造成的假双头或假双尾精子。

头部重叠或全部重叠的精子、无尾精子不进行计数。

精子畸形类型和精子畸形率统计表见表实3-1。

表实3-1精子畸形类型统计

剂量组

无钩

香蕉形

无定形

胖头

尾折叠

双头

双尾

合计

空白对照组

低剂量组

中剂量组

高剂量组

阳性对照组

注：

每只动物检查1000个精子，每组5只动物。

表实3-2精子畸形率统计

畸形精子数

正常精子数

畸形率（%）

五、结果分析与评价

分别计算各剂量组的精子畸形发生率。

各剂量组的精子畸形率与阴性对照组之间进行非参数等级秩和检验，也可按χ2检验法计算各组精子畸形率的差异显著性。

由于不同品系小鼠精子畸形率本底值差异较大，且影响因素也较多，故在结果分析时，应首先观察阳性和阴性对照组的试验结果。

阳性对照组精子畸形率增高应在本实验室的历史记录范围内，并与阴性对照组有显著性差异（P<

0.01），阴性对照组的畸形精子率也应与自己实验室的历史记录相接近，否则所得结果不可靠，试验应重做。

出现可重复的剂量-反应关系时，可判断试验结果为阳性。

即要判定某一化学毒物为精子畸形诱变剂，至少应该有两个相邻剂量组的精子畸形率比阴性对照组显著增高（P<

0.01）；

或达到阴性对照组的两倍或两倍以上，并且试验结果能够重复，则也可认为试验结果阳性。

如果试验组染毒剂量已使动物发生死亡，而精子畸形仍未见增加，则可判定试验结果为阴性。

在受试化学毒物的毒性作用较低而不至于引起动物死亡时，应当记录最大染毒剂量。

六、注意事项

1.在镜检时要注意鉴别制片过程中人为造成的精子损伤。

要特别注意由于精子重叠和交叉所造成的如多头、双头、双尾及多尾畸形等假象。

2.在结果判定时，要主意排除机体某些如缺血、变态反应、感染和体温增高等可能导致精子畸形率增高的因素，以免造成假阳性结果。

实验四小鼠骨髓细胞微核实验

通过检测哺乳动物骨髓细胞中嗜多染红细胞（PCE）的微核出现率，判断受试物是否具有致突变作用，主要用于鉴别损伤染色体和干扰细胞有丝分裂的物质。

二、实验原理

微核是在细胞有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片或环。

这些成分在有丝分裂末期以后，单独形成一个或几个规则的次核存在于细胞质，由于其体积明显小于细胞核，故称微核。

一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。

所以微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。

微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核分叶及核突出物相区别。

红细胞在成熟之前，先由成红细胞将主核排出，演变为嗜多染红细胞（polychromaticerythrocytes，PCE），PCE细胞保持其嗜碱性约24h，然后成为正染红细胞，并进入循环的外周血中。

在PCE细胞中，主核排出，微核可留在胞浆中，并保持一定的时间，容易观察和识别。

因此观察和计数PCE细胞中的微核，可反映染色体断裂和纺锤体损伤情况。

三、器材与试剂

1.器材

手术刀、手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、干净纱布、带橡皮头吸管、台式离心机、刻度离心管、晾片架、电吹风机、玻璃染色缸、1mL注射器及6号针头、载玻片及推片、定时钟、带油镜头显微镜、细胞计数器、细菌过滤器等。

2.试剂

（1）小牛血清小牛血清过滤除菌后放入56℃恒温水浴锅保温1h进行灭活，储存于4℃冰箱。

（2）甲醇（分析纯）、丙三醇（分析纯）、生理盐水。

（3）吉姆萨（Giemsa）贮备液取Giemsa染料1.5g、丙三醇75mL、甲醇75mL。

先将染料置于研钵内，加入少量丙三醇研细，再分次倾入剩余的丙三醇继续研磨，然后转移至烧杯内，盖上玻璃表面皿，置60℃水浴2h，并不时搅拌。

取出待冷却后加入甲醇，混合静置2周后，过滤于棕色瓶内，存放阴凉处。

该贮备液存放时间越长，染色效果越好。

此即为1%的Giemsa原液。

临用时，用pH6.4的磷酸盐缓冲液进行1：

10稀释。

（4）磷酸盐缓冲液

①甲液：

1/15mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO4）称取无水Na2HPO49.47g溶于1000mL蒸馏水；

含2、7或12份结晶水时，则分别称取11.87g、17.87g或23.88g。

②乙液：

1/15mol/L磷酸二氢钾（KH2PO4）称取KH2PO49.08g溶于1000mL蒸馏水。

为配制吉姆萨染液和吖啶橙染液，需配制3种磷酸盐缓冲液：

pH6.24磷酸盐缓冲液，取甲液20mL和乙液80mL混合即可；

pH6.47磷酸盐缓冲液，取甲液30mL和乙液70mL混合即可；

pH6.8磷酸盐缓冲液，取甲液49.5mL和乙液50.5mL混合即可。

各种pH的磷酸盐缓冲液配成后，可用pH计加以校准，调节至所需pH。

（5）吖啶橙染液

①吖啶橙贮备液以0.1%吖啶橙水溶液作为贮备液。

称取吖啶橙0.1g溶于100mL蒸馏水中。

至褐色瓶内，在4℃下可保存数周。

②吖啶橙工作液以0.24mmol/L吖啶橙-磷酸盐缓冲液作为工作液，临用时配制。

取两份0.1%吖啶橙贮备液，30份1/15mol/L、pH6.8磷酸盐缓冲液混匀即得。

四、操作步骤

1.动物一般选用7~12周龄、体重25~30g的小鼠，也可选用体重150~200g的大鼠。

每个剂量组至少用两种性别的动物各5只。

若需多次采样，则每组的动物数需增加，每个采样时间至少需存有8只动物。

动物购买后适应环境至少3天。

2.受试物配制一般用蒸馏水作溶剂，如受试物不溶于水，可用食用油、医用淀粉、羧甲基纤维素等配成乳化液或悬浊液。

受试物应于灌胃前新鲜配制，除非有资料表明以溶液（或悬浊液、乳浊液等）保存具有稳定性。

3.剂量及分组受试物应设三个剂量组，最高剂量组原则上为动物出现严重中毒表现和/或个别动物出现死亡的剂量，一般可取1/2LD50，低剂量组应不表现出毒性，分别取1/4LD50和1/8LD50作为中、低剂量。

急性毒性试验，给予最大剂量受试物（最大使用浓度和最大灌胃量）动物无死亡而求不出LD50时，高剂量组可按以下顺序：

a.10g/kg体重；

b.人的可能摄入量的100倍；

c.一次最大灌胃量进行设计，再下设中、低剂量组。

另设溶剂对照组和阳性对照组。

阳性对照组可用环磷酰胺40mg/kg体重经口或腹腔注射给予（首选经口）。

4.实验动物的处理

经口灌胃。

根据细胞周期和不同物质的作用特点，可先做预试验，确定取材时间。

常用30h给受试物法。

即两次给受试物间隔24h，第二次给受试物后6h，颈椎脱臼处死动物。

5.制片

（1）骨髓细胞液的制备取小鼠两侧股骨，剔去肌肉，用滤纸或纱布擦去血污和肌肉，剪去股骨两端。

用配有6号针头1mL注射器吸取小牛血清约0.05mL冲洗骨髓腔数次，将冲洗物滴在载玻片上。

（2）涂片将玻片上的冲洗物调匀后，推片若干张。

迅速干燥，可在酒精灯上短时烘烤。

（3）固定将干燥的涂片置甲醇液中固定5min~10min，取出晾干。

当日不染色的涂片亦应固定后保存。

（4）染色固定好的涂片用1:

10吉姆萨-磷酸盐缓冲液（ph6.4）染色15min~30min。

用蒸馏水冲洗，干燥，待检。

为了便于诊断，可用吖啶橙染色法。

固定好的涂片放入0.24mmol/L吖啶橙-磷酸盐缓冲液内，染色2min~3min。

用pH6.8磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次1min~2min。

晾干后在荧光显微镜下观察，如微核带红色荧光，可再冲洗数分钟，直至发黄绿色荧光。

在染色、干燥过程中均应避光，以防荧光减弱或消失。

（5）封片染色干燥后的涂片，若需长时间