基因工程复习知识点内蒙古农业大学Word下载.doc
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原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程
菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA，再将DNA烘干固定于膜上，与标记的探针杂交，检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。
组织原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。
PCR
PCR原理：
变性温度下，DNA双链变性双螺旋解开成单链DNA，在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板DNA互补的新链，实现DNA的扩增。
影响PCR扩增的影响因素：
（1）聚合酶（TaqDNA聚合酶，易在3′末端加A；
Pfu聚合酶，高保真性，合成长片段和平末端）
（2）dNTPs的浓度；
（3）模板：
主要考虑纯度及使用量，对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。
（4）引物浓度：
0.1-0.5µ
mol/L之间，过多则非特异扩增增加，形成引物二聚体；
（5）Mg2+浓度：
常用0.5-2.5mmol/L，影响酶的活性、引物-模板退火、特异性；
（6）PCR反应程序设定：
变性温度和时间、引物退火温度Tm与时间、引物延伸温度与时间和循环数
引物设计原则：
（1）引物长度以18-25bp为宜。
（2）碱基尽可能随机分布,G+C占20-80%。
（3）引物内部避免形成二级结构。
（4）两引物间避免有互补序列。
（5）引物3’端为关键碱基，必须完全互补；
5’端无严格限制，可加入酶切位点。
（6）上下游引物退火温度相差5℃以内。
（7）内部避免重复序列。
PCR特点：
特异性强敏感性高快速简便可扩增RNA或cDNA对起始材料质量要求低单核苷酸错误掺入
PCR分类
1）不对称PCR
目的：
扩增产生特异长度的单链DNA。
方法：
采用两种不同浓度的引物。
分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。
用途：
制备核酸序列测定的模板.制备杂交探针.基因组DNA结构功能的研究
2）反向PCR（reversePCR）：
用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。
可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；
用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；
建立基因组步移文库。
3）定量PCR
定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。
目前主要有两种方法：
荧光探针技术和双链DNA特异结合染料。
PCR的应用：
基因组克隆；
基因合成；
遗传病的诊断和研究；
性别鉴定等。
TA克隆：
利用PCR反应中所使用的聚合酶具有在3′加上A的末端转移的活性，使PCR产物与一个具有3′-T突出的载体DNA连接起来的方法
DNA测序方法
Sanger双脱氧链终止法原理：
在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷（ddNTP）,由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA的核苷酸序列。
基因工程工具酶
DNA聚合酶
（1）大肠杆菌DNA聚合酶I
基本性质：
5’→3’的DNA聚合酶活性;
5’→3’的核酸外切酶活性；
3’→5’的核酸外切酶活性。
基本用途：
缺口前移：
Nicktranslation（切口平移）；
制备³
²
P标记的探针。
（2）Klenowfragment
①Klenowfragment的性质：
具有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性。
（失去了5’→3’外切酶活性）。
②基本用途
v 末端补齐（补平5′突出末端，切除3′突出末端）
v DNA3’末端标记（在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP）
v 在cDNA克隆中，用于cDNA第二链的合成。
v 双脱氧末端终止法测定DNA序列
（3）T4DNA聚合酶
①基本特性：
a.具有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性。
b.在无dNTP时，可以从任何3‘-OH端外切
c.在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止
d.在有四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。
a.补平隐蔽末端；
b.DNA3’末端标记
（4）T7DNA聚合酶
②T7DNA聚合酶的特点：
u 持续合成能力强：
一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。
u 3’→5’外切酶活性高：
单链和双链都能降解。
u 不受DNA二级结构的影响
③T7DNA聚合酶的用途
以大分子量DNA为模板的合成：
如M13
进行末端标记：
与T4DNA聚合酶相同
补平隐蔽末端：
合成补平3’隐蔽末端；
水解修平3’突出末端。
（5）修饰后的T7DNA聚合酶
①T7DNA聚合酶的化学修饰
去除3’→5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。
②修饰后的T7DNA聚合酶的用途
l Sanger双脱氧链终止法对长片段DNA进行测序的理想用酶
l 标记DNA3’隐蔽末端
l ③更有效地补平末端
（6）Taq-DNA聚合酶
Ø
具有耐95℃左右高温达30min以上的特性；
催化5’→3’的DNA新链合成，最适温度68～72℃，合成速度1200bases/min；
在合成的DNA链的3’端常多一个“A”；
不具3’→5’的外切酶活性,即无校正功能，大约每合成500个碱基要错配一个；
具微弱的5’→3’的DNA外切酶活性。
（7）pfu聚合酶
v 具有耐95℃左右高温达30min以上的特性；
v 催化5’→3’的DNA新链合成，最适温度68～72℃，合成速度600bases/min；
v 合成的DNA为平端,TA克隆时要用Taq酶加A；
v 合成的DNA片段长度在2kb以内；
v 具3’→5’的外切酶活性,即有校正功能；
v 无5’→3’的DNA外切酶活性。
（10）依赖于RNA的DNA聚合酶
反转录酶的基本特性：
以RNA为模板聚合cDNA链
① M-MuLV:
鼠源RT,来源于鼠白血病病毒（MoloneyMurineLeukemiaVirus）
最适温度42℃,以RNA、DNA或RNA∶DNA杂分子为模板，需引物，需Mg2+或Mn2+为辅助因子，具有RNaseH活性，特异性地对RNA∶DNA杂分子中的RNA降解
② 禽源RT,来源于鸡成髓细胞增多症病毒（AvianMyeloblastosisvirus）（特点同上）
③ PowerscriptÔ
ReverseTranscriptase
CLONETECH公司的专利产品，源于M-MuLV的一个点突变。
无RNaseH活性，故合成的cDNA不会因此变短。
具有末端转移酶活性，倾向加3个“C”。
用于合成全长cDNA。
核酸酶
核酸酶Ⅲ，切割双链DNA，不能降解突出3′末端，可降解平末端。
绿豆核酸酶，降解单链DNA，3′和5′都能降解，产生平末端。
Bal31核酸酶，单链内切双链外切的核酸酶，3′和5′末端切割速度不同，可产生粘性末端。
S1核酸酶，切割单链RNA和单链DNA，降解由限制性内切酶切割形成的3或5突出末端，切割双链中未配对的单链区域，低浓度切割单链，高浓度可切割双链。
限制性内切酶
命名
限制性酶采用三字母的命名原则，即属名+种名+株名的个一个首字母，再加上序号，
A、第一个字母大写，表示该酶来源的细菌属名的第一个字母
B、第二、三个字母小写，表示该酶来源的细菌的种名的前2个字母
C、第四个字母大写代表不同的变种/品系
小写代表不同的菌株和型
D、最后罗马字母，代表同一菌株中不同的限制性内切酶
注意限制性内切酶的正确写法：
1、前3个字母一定斜体2、字母与罗马数字间空格如：
EcoRIPstI
影响限制性核酸内切酶活性的因素
①DNA样品的纯度
蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS等
解决方法：
加大酶的用量，1mgDNA用10U酶；
加大反应总体积，延长反应时间。
②DNA甲基化程度
③反应条件
高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即Staractivity现象。
EcoRI在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%，可切割5‘PuPuATPyPy3’
④酶的纯度
⑤酶切反应的温度和时间
大多数的内切酶，最适反应温度为37度，但也有例外，如SmaI为25度。
酶解时间可以通过加大酶量而缩短。
星号活性:
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称为
同裂酶:
识别相同序列的限制性内切酶称为～。
它们的切割位点可能不同
同序同切酶:
识别序列和切割位置都相同
同序异切酶（Isoschizomer）:
识别序列相同，但切割位点不同
同功多位酶：
许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能
同尾酶（Isocaudarner）:
不同的限制性内切酶切割DNA产生的末端是相同的，切是对称的，即相同的粘性末端
DNA连接酶
（1）大肠杆菌连接酶
需要NAD作物辅助因子只能连接粘性末端。
（2）T4噬菌体DNA连接酶
以ATP作为辅助因子；
不但能连接粘性末端；
还能连接齐平末端；
RNA:
DNA杂交分子中RNA上的缺口。
连接条件
① 必须是两条双链DNA。
② DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）。
③ 需要能量动物或噬菌体中：
ATP；
大肠杆菌中：
NAD+
④ 只能连接相邻核苷酸之间的缺口，不能连接gap，可以连接nick。
核酸修饰酶
1.末端脱氧核苷酸转移酶
5’→3’DNA聚合酶活性
①末端转移酶的特性：
需要3’—OH、二甲胂酸缓冲液。
不需要模板。
底物可以是单链DNA是3’—OH突出的双，随机添加的dNTPs，如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。
②末端转移酶的用途：
同聚物加尾：
给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。
再生酶切位点：
便于回收克隆片断。
非放射性标记DNA片断的3’端：
催化非放射性标记物参入DNA片断的3’端。
（生物素-11-dUTP等）
2.T4多核苷酸激酶
①功能：
催化γ磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。
（不论5’-OH端突出与否）。
如果ATP的γ磷酸带有32P标记，就会被转移到DNA的5’端。
②多核苷酸激酶的用途：
正向反应（forwardreaction）和交换反应标记法
反应混合物中具有超量（γ-32P）ATP和ADP时，多核苷酸激酶能催化（γ-32P）ATP的32P与DNA5’端的磷酸交换。
3.碱性磷酸酶
可催化核酸分子的脱磷作用，使DNA或RNA的5’磷酸变为5’-OH末端。
可防止载体自链。
基因克隆载体
载体
载体（vector）是由在细胞中能够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行复制。
理想载体条件：
（1）具有较小的分子质量和较高的拷贝数
（2）具有若干限制性内切酶的单一酶切位点，以满足基因克隆的需要
（3）具有合适的筛选标记
（4）容易在宿主细胞中分离纯化
（5）插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达
（6）能在宿主细胞中独立复制
克隆型载体：
复制和扩充重组DNA为目的，以获得更多重组DNA,也称扩增型载体。
表达型载体：
在宿主细胞中表达外源基因为目的，获得足够的表达产物蛋白质或RNA。
质粒
质粒（plasmid）是存在于细胞中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成分。
质粒的特点：
A:
质粒是能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；
B:
质粒常见于原核细菌和真菌中；
C:
绝大多数的质粒是DNA型的（酵母的杀伤质粒是一种RNA质粒）；
D:
绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA；
E:
质粒DNA的分子量范围：
1-300kb。
编码2~3个蛋白质；
F：
编码一些非染色体控制的遗传性状，对宿主非必须，但可赋予宿主额外遗传特征。
G：
对抗生素的抗性是质粒最重要的编码特性之一。
质粒具有三种构型：
共价闭合环形DNA（cccDNA），通常呈超螺旋的SC构型，其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构，电泳速度最快。
开环DNA（ocDNA），即OC构型，两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口，电泳速度居中。
线性DNA，即L构型。
质粒DNA经适当的核酸内切酶切割之后，发生双链断裂而形成线性分子，电泳速度最慢。
质粒不亲和性（plasmidincompatibility），也称不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存的现象。
典型质粒：
F因子，Col质粒，R质粒，Ri质粒，Ti质粒等。
1）F质粒:
又叫F因子或性质粒（sexplasmid）。
它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。
F质粒，又称F因子，即致育因子,在寄主细胞中以三中不同的形式存在：
以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，其上不带有任何来自寄主染色体的基因或DNA片段，这样的细胞称为F+细胞;
.以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，同时在其上携带有细菌的染色体基因或DNA片段，这样的细胞称为F′细胞:
以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色体上，这样的细胞称为Hfr细胞（高频重组细胞）
2）.R质粒:
通称抗药性因子。
它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力
3）.Col质粒:
即所谓产生大肠杆菌素因子。
它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。
大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。
重要的大肠杆菌质粒载体（图谱的元件组成自己动手画一下）
（1）pBR322:
松弛型复制；
氯霉素可扩增；
拷贝数50-100/cell；
用于基因克隆。
a.元件来源：
①复制起点ori：
pMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点；
②Ampr基因：
pSP2124质粒的Ampr基因；
③Tetr基因：
pSC101的Tetr基因。
b.选择标记:
氨苄青霉素和四环素抗性
c.pBR322的优点:
①双抗菌素抗性选择标记：
插入失活，分两次先后选择：
没有获得载体的寄主细胞，在Amp或Tet中都死亡。
获得载体的寄主细胞，在Amp或Tet其中之一中死亡。
②分子小，克隆能力大：
载体越小越好。
>
10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
③高拷贝数：
氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy
④安全：
失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。
不能通过接合转移。
（2）pUC18/19（P43）：
拷贝数2000-3000/cell；
装有多克隆位点（MCS）；
正选择颜色标记lacZ’；
用于基因克隆和测序。
a.元件来源:
①复制起点:
pBR322的ori
②Ampr基因:
pBR322的Ampr基因，但其上失去了克隆位点。
③lacZ的启动子:
大肠杆菌
④lacZ’基因:
大肠杆菌lacZ的α-肽链序列，是LacZ的氨基端片断。
b.正选择标记：
lacZ’的显色原理:
β-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。
①α-肽（lacZ’）：
β-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。
lacZ只有在4聚体的状态下才有功能.;
②受体菌lacZ突变（lacZ∆M15）：
受体菌基因组的β-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失α肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal
③载体lacZ’与α互补：
pUC质粒载体上的lacZ’编码α肽与这个缺失突变的β-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。
又能分解Xgal。
产生蓝色物质。
④α互补的插入失活：
pUC载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位点（MCS）区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成。
不能互补。
c.IPTG的诱导作用：
IPTG是乳糖的类似物。
能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ的C端部分和载体的lacZ’a肽都表达。
从而互补。
d.pUC系列载体的优点：
①更小的分子量；
②选择方便:
Xgal显色、抗菌素双重直接选择；
③克隆便利:
具有多克隆位点（MCS）；
④测序方便
α-互补：
LacZ′基因编码的α-肽链是β-半乳糖苷酶的氨基末端的短片段，它同失去了正常氨基末端的β-半乳糖苷酶突变体互补时，便会产生有功能活性的β-半乳糖苷酶分子。
于是便可以应用X-gal和IPTG显色技术检测转化子。
重组子为白斑，非重组子为蓝斑
（3）pGEM-3Z
由pUC派生而来,与pUC的主要区别是在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和SP6。
可被T7和SP6的RNA聚合酶识别转录
pGEM-3Z的特点：
如果加入纯化的T7或SP6RNA聚合酶，在试管里就可以转录mRNA；
②外源基因正接反接都可以转录；
③MCS与pUC18的完全一样
噬菌体载体
M13噬菌体
M13噬菌体是一种丝状噬菌体，内有一个环状单链DNA分子，长6407个核苷酸，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息。
M13DNA的复制起始位点定位在基因间隔区内。
但是基因间隔区的有些核苷酸序列即使发生突变、缺失或插入外源DNA片段，也不会影响M13DNA的复制。
其中M13mp系列对野生型M13加以改造，插入了多克隆位点和LacZ基因，可容纳外源DNA300-400bp，可用于制备DNA测序时用的单链模板和核酸探针，也可以进行盒式定点诱变。
M13噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。
感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒（一出芽方式），宿主细胞仍能继续生长和分裂。
获取单链，离心去上清即可，获取双链，离心，取菌体提取质粒即可。
M13系列载体的优点
（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段。
（2）X-gal显色反应，可供直接选择。
（3）无包装限制，克隆能力大。
（4）可以克隆双链DNA分子中的每一条链（子代M13噬菌体中包含的是单连+DNA）。
M13载体的缺点
①插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降。
②实际克隆能力小于1500bp（虽无包装限制，并非无限包装）。
λ噬菌
λ噬菌体由头和尾构成，其基因组是长约49kb的线性双链DNA分子，组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。
λ噬菌体感染时，通过尾管将基因组DNA注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。
DNA进入大肠杆菌后以其两端12bp的互补单链粘末端环化成环状双链，能以两种不同的方式繁殖：
①溶菌性方式和②溶原性方式。
λDNA的整合是可逆的，原噬菌体可从宿主DNA中切出，进入溶菌性方式的繁殖。
λ噬菌体整个基因组可分为三个部分，①左臂：
从A到J长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。
②中段：
长约20kb，是λDNA整合和切出，溶原生长所需的序列。
③右臂：
长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及λDNA复制起始均在这区域内。
左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；
对溶菌生长来说，中段是非必需的。
λ噬菌载体
利用λ噬菌体作载体，主要是将外来目的DNA替代或插入中段序列，使其随左右臂一起包装成噬菌体，去感染大肠杆菌，并随噬菌体的溶菌繁殖而繁殖。
现在广泛使用的λ噬菌体载体也是已作过许多人工改造的，主要的改造是：
①设计去除λDNA上的一些限制性酶切点。
②在中段非必需区，替换插入某些标志基因如上述的可供蓝白筛选lacI-lacZ’序列，和多克隆位点等。
由此可构建出两类λ噬菌体作载体：
一类是插入型载体，可将外来序列插中段，常用的λgt系列载体，一般容许插入5-7kb外来DNA；
另一类是转换型载体，即可用外来DNA替代中段，如IMBL系列载体。
插入或置换中段外来的DNA长度是有一定限制的，当噬菌体DNA长度大于野生型λ噬菌体基因组105%或小于75%时，包装而成的噬菌体存活力显著下降。
所以λ噬菌体载体可插入长9-23kb的外来DNA，这比质粒载体能插入的DNA长得多；
而且包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高得多，所以λ噬菌体载体常用于构建cDNA文库或基因组文库。
包装限制：
λ噬菌的多连体DNA进行切割包装时，两个相邻cos位点之间的DNA长度是野生型λ噬菌基因组的75%~105%时，才能够包装成有活性的噬菌体颗粒的现象称为包装限制。
如果将左右臂和中段都去除，仅留下λDNA两端端包装噬菌体所必需的cos序列，再
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