菌落总数测定经验及检测中常用的灭菌和消毒方法.docx

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菌落总数测定经验及检测中常用的灭菌和消毒方法

一、菌落总数测定经验分享

一、菌落总数的概念和测定意义

菌落（colony）是指细菌在固体培养基上发育而形成的能被肉眼所识别的生长物，它是由数以万计的相同细菌聚集而成的，故又有细菌集落之称。

菌落总数是指在被检样品的单位重量（g）、容积（mL）或表面积内，所含能于某种固体培养基上，在一定条件下培养后所生成的细菌集落的总数。

菌落总数主要是作为判定食品被细菌污染程度的标记，也可以应用这一方法观察食中细菌的性质以及细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供科学依据。

二、菌落总数测定的几项说明

1．菌落总数的测定。

是以检样中的细菌细胞和营养琼脂混合后，每个细菌细胞都能形成一个可见的单独菌落的假定为基础的。

由于检验中采用36℃于有氧条件下培养（空气中含氧约20％），因而并不能测出每g或mL检样中实际的总活菌数，厌氧菌、微嗜氧菌和嗜冷菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的一些细菌也受到了限制，因此所得结果，只包括一群能在普通营养琼脂中发育、嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。

2．鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个，成双、链状、葡萄状成堆的形式存在，因而在营养琼脂平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因此平板上所得需氧和兼性厌氧菌菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容量或表面积内的菌落数或菌落形成单位数（colonyformingunits，CFU）报告之。

3．每种细菌都有它一定的生理特性，培养时，应用不同的营养条件及其他生理条件（如温度、培养时间、pH、需氧性质等）去满足其要求，才能分别将各种细菌都培养出来。

因此，要得到较全面的细菌菌落总数，应将检样接种到几种不同的非选择性培养基上，并培养在不同条件下，如温度，氧气供应等。

但国家颁发的食品卫生标准对不同食品的菌落总数的规定，都是根据用普通营养琼脂进行需氧培养所得的结果确定的，因此在食品的一般卫生学评价中并不要用几种不同的非选择性培养基培养。

三、菌落总数的测定

测定食品中菌落总数时，是将食品检样做成几个不同的10倍递增稀释液，然后从各个稀释液中分别取出一定量在平皿内与营养琼脂相混合，经培养后，按一定要求计算出皿内琼脂平板上所生成的细菌集落数，并再根据检样的稀释倍数，计算出每g或mL样品中所含细菌菌落的总数。

四、菌落总数测定中的一些要求和规定

为了正确地反映食品中各种需氧和兼性厌氧菌存在的情况，检验时必须遵循以下一些要求和规定。

（一）所用器皿及稀释液

1．检验中所用玻璃器皿，如培养皿，吸管、试管等必须是完全灭菌的，并在灭菌前彻底洗涤干净，不得残留有抑菌物质。

2．用作样品稀释的液体，每批都要有空白对照。

如果在琼脂对照平板上出现几个菌落时，要追加对照平板，以判定是空白稀释液，用于倾注平皿的培养基，还是平皿吸管或空气可能存在的污染。

3．检样的稀释液虽可用灭菌盐水或蒸馏水，但以用磷酸缓冲盐水特别是0.1％蛋白胨水为合适，因蛋白胨水对细菌细胞有更好的保护作用，不会因为在稀释过程中而使食品检样中原已受损伤的细菌细胞导致死亡。

如果对含盐量较高的食品（如酱品等）进行稀释，则宜采用蒸馏水。

（二）检样稀释

1．检样稀释时，应以无菌称取（或量取）有代表性的液体样品25g（或mL）剪碎放于含有225mL灭菌稀释液的玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠），经充分振摇作成1:

10的稀释液。

如系肉、鱼等固体样品，最好剪细于无菌均质袋与稀释液拍击均匀，或与稀释液同置于灭菌均质器杯中，以8000~l0000rpm速度搅拌1分钟，使做成均匀的1:

10稀释液。

2．根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，将上述1:

10的检样稀释液再做成几个适当的10倍递增稀释液。

即取1:

10稀释液1mL与9mL稀释液混和做成1:

100的稀释液，然后依次递增稀释，做成1:

1000、1:

10000等稀释液。

注意每递增稀释一次，必须另换1支1mL灭菌吸管，这样所得检样的稀释倍数方为准确。

3．从吸管筒内取出灭菌吸管时，不要将吸管尖端碰着其他仍留在容器内的吸管的外露部分；而且吸管在进出装有稀释液的玻璃瓶和试管时，也不要触及瓶口及试管口的外侧部分；因为这些部分都可能接触过手或其他沾污物。

4．在作10倍递增稀释中，吸管插入检样稀释液内不能低于液面2.5cm；吸入液体时，应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖端贴于玻璃瓶或试管的内壁使吸。

管内液体调至所要求的刻度，这样取样较准确，而且在吸管从稀释液内取出时不会有多余的液体粘附于管外。

5．当用吸管将检样稀释液加至另一装有9mL空白稀释液的试管内时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液，以防吸管尖端外侧部分粘附的检液也混入其中。

（三）平板接种与培养

1．将稀释液加至灭菌平皿内时，应根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移lmL稀释液加入皿内（从皿侧加入，不要揭去皿盖），最后将吸管直立使液体流毕，并在皿底干燥处再擦一下吸管尖将余液排出，而不要吹出。

每个稀释度应作2个平皿。

2．用于倾注平皿的营养琼脂应预先加热使其融化,并保温于（45±1）℃恒温水浴中待用。

温度太高影响细菌生长,太低琼脂易凝固不能与检液充分混匀,倾注平皿时,每皿内倾入约15mL,平板过厚可影响观察,太薄又易干裂,最后将琼脂底部带有沉淀的部分弃去。

※为了防止细菌增殖及产生片状菌落,在检液加入平皿后,应尽快倾注培养基并旋转混匀,可正反两个方向旋转,以使充分混匀。

旋转中应加小心，不要使混和物溅到皿边的上方。

检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min。

琼脂凝固后,在数分钟内即应将平皿翻转予以培养,这样可避免菌落蔓延生长。

3.为了控制污染,需做空白对照实验,在取样进行检验的同时,于工作台上打开一块琼脂平板,其暴露的时间,应与该检样从制备、稀释到加入平皿时所暴露的最长的时间相当,然后与加有检样的平皿一并置于温箱内培养,以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。

4．皿内琼脂凝固后，不要长久放置，然后始翻转培养；易于琼脂凝固后，在数分钟内即应将平皿翻转予以培养，这样可避免菌落蔓延生长。

必要时，可先将皿打开倒置（皿底向上）于温箱内经15~60分钟使琼脂表面干燥后，再将皿底移至盖内倒置于温箱内培养。

这样可以阻止运动性强的变形杆菌属、假单胞菌属和芽胞杆菌属中一些菌株在琼脂表面扩展生长。

5．为了控制污染，在取样进行检验的同时，于工作台上打开一块琼脂平板，其暴露的时间，应与该检样从制备、稀释到加入平皿时所暴露的最长的时间相当，然后与加有检样的平皿一并置于温箱内培养，以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。

6．培养温度，应根据食品种类而定。

肉、，乳、蛋类食品用36℃培养，培养时间为48±2小时。

水产品用30℃培养,培养时间为72±2小时。

培养温度和时间之所以有这种不同的区分，乃是因为在制定这些食品卫生标准中关于菌落总数的规定时，分别采用了不同的温度和培养时间所取得的数据之故。

水产品因来自淡水或海水，水底温度较低，因而制定水产品细菌方面的卫生标准时，系用30℃作为培养的温度。

四、对照试验

1．加入平皿内的检样稀释液（特别是10-1的稀释液），有时带有食品颗粒，在这种情况下，为了避免与细菌菌落发生混淆，可作一检样稀释液与琼脂混和的平皿，不经培养，而于4℃环境中放置，以便在计数捡样菌落时用作对照。

2．为了防止检样中食品颗粒与菌落混淆，也可在已溶化而保温于45℃水浴内的琼脂中，按每100mL加lmL0.5％氯化三苯四氮唑（2，3，5triphenyltetrazoliumchloride，TTC）水溶液之量加入适量的TTC。

培养后，如系食品颗粒，不见变化。

如为细菌，则生成红色菌落。

配好的TTC溶液，应先用来与不加TTC的作对照，以观察其对计数是否有不利的作用（TTC在一定浓度下对革兰氏阳性菌有抑制作用）。

TTC溶液要放冷暗处保存，以防受热与光照而发生分解。

无色的TTC是作为受氢体加入培养基中，如果有细菌存在，培养后，在细菌脱氢酶的作用下，TTC便接受氢而成为红色的三苯基甲艏（formazan），使菌落呈现红色。

五、菌落计数

1．从温箱内取出平皿进行菌落计数时，应先分别观察同一稀释度的两个平皿和不同稀释度的几个平皿内平板上菌落生长情况。

平行试验的2个平板与菌落数应该接近，不同稀释度的几个平板上菌落数则应与检样稀释倍数成反比，即检样稀释倍数越大，菌落数越低，稀释倍数越小，菌落数越高。

2．计数菌落时，应选取菌落数在30~300之间的平板作为菌落总数测定的标准。

一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数；如其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。

如在一个稀释度的两个平板中，一个平板的菌落数在30一300之间，另一个大于300或小于30时，则以菌落数在30—300间的平板作为计数的标准。

3．菌落计数所得结果，可分别按以下几种不同情况作报告：

a、若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每g（mL）样品中菌落总数结果。

b、若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按式

（1）计算:

示例:

c、若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

d、若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

e、若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

d、若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU~300CFU之间,其中一部分小于30CFU或大于300CFU时,则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

4．注意事项

（1）如果稀释度大的平板上菌落数反比稀释度小的平板上菌落数高，则系检验工作中发生的差错，属实验室事故。

此外，也可能因抑菌剂混入样品中所致，均不可用作检样计数报告的依据。

（2）如果平板上出现链状菌落，菌落之间没有明显的界限，这是在琼脂与检样混合时，一个细菌块被分散所造成。

一条链作为一个菌落计，如有来源不同的几条链，每条链作为一个菌落计，不要把链上生长的各个菌落分开来数。

（3）如果所有平板上都有菌落密布，不要用多不可计作报告，而应在稀释度最大的平板上，任意数其中2cm2个，除2求出每cm2内平均菌落数乘以皿底面积63.6cm2数，再乘其稀释倍数作报告。

如所用平皿的皿底直径不是9cm，则可按其直径的实际cm数代人圆面积公式求出。

（4）检样如系微生物类制剂（如酸牛乳、酵母制酸性饮料），则平板计数中应相应地将有关微生物（乳酸杆菌、酵母菌）排除，不可并入检样的菌落总数内作报告。

一般在校正检样的pH7.6后，再进行稀释和培养，此类嗜酸性微生物往往即不易生长。

并可用革兰氏法染色鉴别。

染色鉴别时，要用不校正pH的检样做成相同稀释度的稀释液培养所生成的菌落涂片染色作对照，以资辨别。

酵母菌卵圆形，远比细菌大，大小为2～5×5～30μm，革兰氏阳性着色。

乳酸杆菌在24小时内，于普通营养琼脂平板上在有氧条件下培养，通常是不生长的。

六、报告方式

1、菌落数小于100CFU时,按“四舍五入”原则修约,以实有数报告。

2、菌落数大于或等于100CFU时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。

3、若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落蔓延。

4、若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。

5、称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。

a、检样为固体，用重量法取样检验时，以g为单位报告其菌落数；检样为液体，用容量法取样检验时，以mL为单位报告其菌落数；如检样为样品表面的涂擦液，则应以cm2为单位报告其菌落数。

b、如检样为液体，在两个平皿内所加lmL未经稀释的检样（原液）培养中，均无细菌集落生成，则报告为lmL检样内未有菌落生长，或1mL检样内菌落数<1。

微生物检测常用的灭菌和消毒方法

消毒和灭菌两个词在实际使用中常被混用，其实它们的含义是有所不同的。

消毒是指应用消毒剂等方法杀灭物体表面和内部的病原菌营养体的方法，而灭菌是指用物理和化学方法杀死物体表面和内部的所有微生物，使之呈无菌状态。

一、物理方法

1、温度

利用温度进行灭菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。

高温可使微生物细胞内的蛋白质和酶类发生变性而失活，从而起灭菌作用，低温通常起抑菌作用。

01

干热灭菌法：

a.灼烧灭菌法：

利用火焰直接把微生物烧死。

此法彻底可靠，灭菌迅速，但易焚毁物品，所以使用范围有限，只适合于接种针、环、试管口及不能用的污染物品或实验动物的尸体等的灭菌。

b.干热空气灭菌法：

这是实验室中常用的一种方法，即把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，升温至160℃，恒温1小时即可。

此法适用于玻璃皿、金属用具等的灭菌。

02

湿热灭菌法：

在同样的温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好，这是因为一方面细胞内蛋白质含水量高，容易变性。

另一方面高温水蒸汽对蛋白质有高度的穿透力，从而加速蛋白质变性而迅速死亡。

a.巴氏消毒法：

有些食物会因高温破坏营养成分或影响质量，如牛奶、酱油、啤酒等，所以只能用较低的温度来杀死其中的病原微生物，这样既保持食物的营养和风味，又进行了消毒，保证了食品卫生。

该法一般在62℃，30分钟即可达到消毒目的。

此法为法国微生物学家巴斯德首创，故名为巴氏消毒法。

b.煮沸消毒法：

直接将要消毒的物品放入清水中，煮沸15分钟，即可杀死细菌的全部营养和部分芽孢。

若在清水中加入1%碳酸钠或2%的石炭酸，则效果更好。

此法适用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。

c.间歇灭菌法：

上述两种方法在常压下，只能起到消毒作用，而很难做到完全无菌。

若采用间歇灭菌的方法，就能杀灭物品中所有的微生物。

具体做法是：

将待灭菌的物品加热至100℃，15~30分钟，杀死其中的营养体。

然后冷却，放入37℃恒温箱中过夜，让残留的芽孢萌发成营养体。

第2天再重复上述步骤，三次左右，就可达到灭菌的目的。

此法不需加压灭菌锅，适于推广，但操作麻烦，所需时间长。

d.加压蒸汽灭菌法：

这是发酵工业、医疗保健、食品检测和微生物学实验室中最常用的一种灭菌方法。

它适用于各种耐热、体积大的培养基的灭菌，也适用于玻璃器皿、工作服等物品的灭菌。

加压蒸汽灭菌是把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的，以大量蒸汽使其中压力升高。

由于蒸汽压的上升，水的沸点也随之提高。

在蒸汽压达到1.055公斤/厘米2时，加压蒸汽灭菌锅内的温度可达到121℃。

在这种情况下，微生物（包括芽孢）在15~20分钟便会被杀死，而达到灭菌目的。

如灭菌的对象是砂土、石蜡油等面积大、含菌多、传热差的物品，则应适当延长灭菌时间。

在加压蒸汽灭菌中，要引起注意的一个问题是，在恒压之前，一定要排尽灭菌锅中的冷空气，否则表上的蒸汽压与蒸汽温度之间不具对应关系，这样会大大降低灭菌效果。

03

影响灭菌的因素：

a.不同的微生物或同种微生物的不同菌龄对高温的敏感性不同。

多数微生物的营养体和病毒在50~65℃，10分钟就会被杀死；但各种孢子、特别是芽孢最能抗热，其中抗热性最强的是嗜热脂肪芽孢杆菌，要在121℃，12分钟才被杀死。

对同种微生物来讲，幼龄菌比老龄菌对热更敏感。

b.微生物的数量多少显然会影响灭菌的效果，数量越多，热死时间越长。

c.培养基的成分与组成也会影响灭菌效果。

一般地讲，蛋白质、糖或脂肪存在，则提高抗热性，pH在7附近，抗热性最强，偏向两极，则抗热能力下降，而不同的盐类可能对灭菌产生不同的影响；固体培养基要比液体培养基灭菌时间长。

04

灭菌对培养基成分的影响：

a.pH值普遍下降。

b.产生混浊或沉淀，这主要是由于一些离子发生化学反应而产生混浊或沉淀。

例如Ca+2与PO4-3化合，就会产生磷酸钙沉淀。

c.不少培养基颜色加深。

d.体积和浓度有所变化。

e.营养成分有时受到破坏。

２、辐射

利用辐射进行灭菌消毒，可以避免高温灭菌或化学药剂消毒的缺点，所以应用越来越广，目前主要应用在以下几个方面：

１）接种室、手术室、食品、药物包装室常应用紫外线杀菌。

２）应用β射线作食品表面杀菌，γ射线用于食品内部杀菌。

经辐射后的食品，因大量微生物被杀灭，再用冷冻保藏，可使保存期延长。

３、过滤

采用机械方法，设计一种滤孔比细菌还小的筛子，做成各种过滤器。

通过过滤，只让液体培养基从筛子中流下，而把各种微生物菌体留在筛子上面，从而达到除菌的目的。

这种灭菌方法适用于一些对热不稳定的体积小的液体培养基的灭菌以及气体的灭菌。

它的最大优点是不破坏培养基中各种物质的化学成分。

但是比细菌还小的病毒仍然能留在液体培养基内，有时会给实验带来一定的麻烦。

二、化学方法

一般化学药剂无法杀死所有的微生物，而只能杀死其中的病原微生物，所以是起消毒剂的作用，而不是灭菌剂。

能迅速杀灭病原微生物的药物，称为消毒剂。

能抑制或阻止微生物生长繁殖的药物，称为防腐剂。

但是一种化学药物是杀菌还是抑菌，常不易严格区分。

消毒剂在低浓度时也能杀菌（如1：

1000硫柳汞）。

由于消毒防腐剂没有选择性，因此对一切活细胞都有毒性，不仅能杀死或抑制病原微生物，而且对人体组织细胞也有损伤作用，所以只能用于体表、器械、排泄物和周围环境的消毒。

常用的化学消毒剂有：

石碳酸、来苏水（甲醛溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。