血清免疫球蛋白的提取分离纯化及鉴定.docx

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血清免疫球蛋白的提取分离纯化及鉴定

I血液及组织样品的制备

分析组织中某种物质的含量、探索物质代谢的过程和规律，经常使用动物的肝、肾、脑、粘膜和肌肉等组织，也选用全血、血浆、血清或者无蛋白血滤液等血液样品，有时也采用尿液、胃液等完成各种生化实验。

掌握以上各种实验样品的正确处理和制备方法是保证生化实验顺利进行的关键。

一、血液样品

（一）采血

测定用的血液，多由静脉采集。

一般在饲喂前空腹采取，因此时血液中化学成分含量比较稳定，采血时所用的针头、注射器，盛血容器要清洁干净；接血时应让血液沿着容器壁慢慢注入，以防溶血和产生泡沫。

（二）血清、全血及血浆的制备

1.血清的制备

血清是全血不加抗凝剂自然凝固后析出的淡黄清亮液体。

制备方法是：

将刚采集的血液直接注入试管或离心管中。

将试管放成斜面，让其自然凝固，一般经3h血块自然收缩而析出血清；也可将血样放入37℃恒温箱内，促使血块收缩，能较快约析出血清。

为了缩短时间，也可用离心机分离（未凝或凝固的均可离心），分离出的血青，用吸管吸出置于另一试管中，若不清亮或带有血细胞，应重离心，加盖冷藏备用。

2.全血及血浆的制备

取清洁干燥的试管或其它容器，收集动物的新鲜血液，立即与适量的抗凝剂充分混合，所得到的抗凝血为全血。

每毫升血液中加入抗凝剂的种类可以根据实验的需要进行选择，但是用量不宜过大，否则将影响实验的结果。

将已抗凝的全二于2，000r/min离心10min，沉降血细胞，取上层清液即为血浆。

血浆比血清分离得快而且量多：

两者的差别，主要是血浆比血清多含一种纤维蛋白原，其它成分基本相同。

3.抗凝剂

凡能够抑制血液凝固反应进行的化合物称为抗凝剂。

抗凝剂种类甚多，实验室常用的有如下几种，可根据情况选择使用。

（1）草酸钾（钠）优点是溶解度大，可迅速与血中钙离子结合，形成不溶性草酸钙，使血液不凝固。

每毫升血液用1-2mg即可。

配制方法：

配制10％草酸钾水溶液二吸取此液0.1ml放入一试管中，慢慢转动试管，泛草酸钾尽量铺散在试管壁上，置80℃烘箱烤干（若超过150℃则分解），管壁即呈一薄层三色粉末，加塞备用。

可抗凝血液5ml。

此抗凝血，常用于非蛋白氮等多种测定项目，但不适用于钾、钙的测定。

对乳酸脱氯酸性磷酸酶和淀粉酶具有抑制作用，使用时应注意。

（2）草酸钾-氟化钠氟化钠是一种弱抗凝剂。

但浓度2mg/ml时能抑制血液内葡萄糖的分解，因此在测定血糖时常与草酸钾混合使用。

配制方法：

草酸钾6g、氟化钠3g，溶于100ml蒸馏水中。

每个试管加入0.25ml，于80℃烘干备用。

每管含混合剂22.5mg，可抗凝5ml血液。

此抗凝血，因氟化钠抑制睬酶，所以不能用于脉酶法的尿素氮测定；也不能用于淀粉酶及磷酸酶的测定。

（3）乙二胺四乙酸二钠盐（简称EDTANa2）EDTANa2易与钙离子络合而使血液不凝。

有效浓度为0.5mg可抗凝lml血液。

配制方法：

配成4%EDTANa：

水溶液。

每管装0.lml,80℃烘干，可抗凝5ml血液。

此抗凝血液适用于多种生化分析。

但不能用于血浆中含氮物质、钙及钠的测定。

（4）肝素最佳抗凝剂，主要抑制凝血酶原转变为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而凝血：

0.1-0.2mg或20单位可抗凝lml血液。

配制方法：

配成10mg/ml的水溶液。

每管加0.lml于37-56℃烘干，可抗凝5-10ml血液（市售品为肝素钠溶液，每毫升含12,500国际单位，相当干100mg，故每125国际单位相当于lmg）

除上述抗凝剂外，还有柠檬酸钠、草酸铵等，因不常用，故不作介绍。

（三）无蛋白血滤液的制备

测定血液或其它体液化学成分时，样品内蛋白质的存在常常干扰测定。

因此，需要先做成无蛋白血滤液再行测定。

无蛋白血滤液制备的基本原理是以蛋白质沉淀剂沉淀蛋白，用过滤法或离心法除去沉淀的蛋白。

现介绍几种常用的方法：

1.钨酸法

原理：

钨酸钠与硫酸混合，生成钨酸：

Na2WO4+H2SO4→H2WO4十Na2SO4

血液中蛋白质在pH值小于等电点的溶液中可被钨酸沉淀：

沉淀液过滤或离心，上清液即为无色而透明、pH约等于6的无蛋白滤液。

可供非蛋白氮、血糖、氨基酸、尿素、尿酸及氯化物等项测定使用。

制备方法：

（1）取50ml锥形瓶1只，加入蒸馏水7份；

（2）用奥氏吸管吸取抗凝血1份，擦去管壁外血液，将吸管插入锥形瓶底部，缓缓放出血液。

放完血液后，将吸管提高吸取上清液再吹入，反复洗管3次。

充分混合，使红细胞完全溶解；（3）加入0.333mol/l，硫酸溶液1份，随加随摇，充分混匀，此时血液由鲜红变成棕色，静置5-10min，使其酸化完全；（4）加入10％钨酸钠1份，随加随摇；（5）放置约5min后，如振摇亦不再发生泡沫，说明蛋白质已完全变性沉淀。

用定量滤纸过滤或离心（2,500r/min,10min），即得完全澄清无色之无蛋白血滤液。

用此法制得的无蛋白血滤液为10倍稀释的血滤液。

即每毫升血滤液相当于0.lml全血。

试剂：

（1）10％钨酸钠溶液

（2）0.333mol/L硫酸溶液

2.氢氧化锌法

原理：

血液中蛋白质在pH大于等电点的溶液中可用znZ十来沉淀。

生成的氢氧化锌本身为胶体可将血中葡萄糖以外的许多还原性物质吸附而沉淀，所以此法所得滤液最适作血液葡萄糖的测定（因为葡萄糖多是利用它的还原性来定量的）。

但测定尿酸和非蛋白氮时含量降低，不宜使用此滤液。

制备方法：

（1）取干燥、洁净的50ml锥形瓶或大试管1支，准确加入7份水；

（2）加入混匀的抗凝血1份，摇匀；（3）加入10％硫酸锌溶液1份，摇匀；（4）慢慢加入0.5mol/L氢氧化钠溶液1份，边加边摇，放置5min，用定量滤纸过滤或离心（2,500，10min），除去沉淀，便得到完全澄清的无蛋白血滤液。

此滤液亦为稀释10倍之血滤液。

试剂：

（l）10％硫酸锌溶液

（2）0.5mol/L氢氧化钠溶液

3.三氯醋酸法

原理：

三氯醋酸为一有机强酸，能使蛋白质变性而沉淀。

制备方法：

取10％三氯醋酸9份置于锥形瓶或大试管中，加1份已充分混匀的抗凝血液。

加时要不断摇动，使其均匀。

静置5min，过滤或离心。

即得10倍稀释之清明透亮的滤液。

二、组织样品

在生化实验中，经常利用离体组织研究各种物质代谢途径和酶系的作用。

或者从组织中分离、纯化核酸、酶以及某些有意义的代谢物质进行研究。

但是，在生物组织中，因含有大量的催化活性物质，离体组织的采集必需在冰冷条件下进行，并日需尽快完成测定。

否则其所含物质的量和生物活性都将发生变化。

一般采用断头法处死动物，放出血液，立即取出所需脏器或组织，除去脂肪和结缔组织，用冰冷生理盐水洗去血液，再用滤纸吸干，称重后，按试验要求制成匀浆或者组织糜。

组织糜：

迅速将组织剪碎，用捣碎机绞成糜状，或加入少量砂于乳钵中，研磨至糊状。

组织匀浆：

取一定量新鲜组织剪碎，加入适量匀浆制备液，用高速电动匀浆器或者玻璃匀浆器磨碎组织。

由于匀浆器的柞头在高速运转中会产生热量，因此在制备匀浆时，需将匀浆器置于冰水中。

常用的匀浆制备液有生理盐水、缓冲液和0.25mol/L的蔗糖液等，可根据实验的要求，加以选择。

组织浸出液：

上述组织匀浆液再经过离心分离出的上清液就是组织浸出液。

II蛋白质的沉淀反应

1．实验原理

在水溶液中，蛋白质分子表面结合大量的水分子，形成水化膜，同时蛋白质分子本身带有电荷，与溶液的反离子作用，形成双电层，因而每个蛋白质分子可形成一个稳定的胶粒。

整个蛋白质溶液就形成稳定的亲水溶胶体系。

当某些物理化学因素导致蛋白质分子失去水化膜或失去电荷，甚至变性时，它就丧失了稳定因素，以固态形式从溶液中析出，这就是蛋白质的沉淀作用。

蛋白质的沉淀作用分为两类：

1）可逆沉淀作用

在发生沉淀作用时，虽然蛋白质已经沉淀析出，然而其分子内部结构并没发生明显的改变，仍保持原有的结构和性质。

如除去沉淀因素，蛋白质可重新溶解在原来的溶剂中。

因此，这种沉淀作用称为可逆沉淀作用。

属于此类的有盐析作用，低温下丙酮、乙醇使蛋白质沉淀的作用，以及利用等电点的沉淀。

盐析作用：

用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程。

在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子的水化膜被剥夺。

同时蛋白

质分子所带的电荷被中和，因而破坏了蛋白质溶胶的稳定因素，使蛋白质沉淀析出。

但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去中性盐或减低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。

有机溶剂沉淀蛋白质：

在蛋白质溶液中加入适量丙酮或乙醇，蛋白质分子的水化膜被破坏而沉淀。

若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。

2）不可逆沉淀作用

一些物理化学因素往往会导致蛋白质分子结构，尤其是空间结构破坏，因而失去其原来的性质，这种蛋白质沉淀不能再溶解于原来的溶剂中。

重金属盐，生物碱试剂、过酸、过碱、加热、震荡、超声波和有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉定：

重金属盐类Cu2+、Ag+、Pb2+和Hg2+等均能与蛋白质分子中的巯基等基团结合，生成不溶物而沉淀。

生物碱试剂与蛋白质结合形成不溶物，使蛋白质沉淀。

植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱（或植物碱）。

能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。

2．试剂和器材

1）试剂

（1）蛋白质氯化钠溶液取20ml蛋清，加蒸馏水200ml和饱和氯化钠溶液l00ml，充分搅匀后纱布滤去不溶物。

（加氯化钠的目的是溶解球蛋白）。

（2）蛋白质溶液取5ml蛋清，用蒸馏水稀释至100ml，搅拌均匀后，用纱布过滤。

（3）饱和硫酸铵溶液称固体（NH4）2SO4加于l000ml蒸馏水中，在70-80℃下搅拌促溶，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铁溶液。

（4）饱和苦味酸溶液取2g苦味酸放入三角烧瓶，加蒸馏水100ml，80℃水浴约10min使之完全溶解，于室温下冷却后瓶底析出黄色结晶，上清液即为饱和苦味酸，此液可存放数年。

（5）1％醋酸铅溶液

（6）1％硫酸铜溶液

（7）1％三氯乙酸溶液

（8）0.5％磺基水杨酸溶液

（9）1％醋酸溶液

（10）5％鞣酸溶液

（11）硫酸铵粉末

2）器材

试管及试管架，抽滤瓶、量筒、布氏漏斗等

3．操作方法

1）蛋白质的盐析作用

取1支试管加入3ml蛋白质溶液和3ml饱和硫酸铵溶液，混匀，静置约10min，球蛋白则沉淀析出，过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒搅拌，直至粉末不再溶解达到饱和为止析出的沉淀为清蛋白，再加水稀释，观察沉淀是否溶解。

2）乙醇沉淀蛋白质

取1支试管加蛋白质溶液lml，加晶体氯化钠少许（加速沉淀并使沉淀完全）待溶解后再加95%乙醇2ml混匀，观察有无沉淀析出。

3）有机酸沉淀蛋白质

取2支试管，各加入蛋白质溶液约0.5ml，然后分别滴加10%三氯乙酸和0.5％磺基水杨酸数滴。

观察蛋白质沉淀。

4）重金属盐沉淀蛋白质

取2支试管各加蛋白质溶液2ml，一管内滴加1％醋酸铅溶液，另一管内滴加1%硫酸铜溶液，观察沉淀生成。

5）生物碱试剂沉淀蛋白质

取2支试管各加蛋白质溶液2ml，及1%醋酸4-5滴，其中一管滴加5%鞣酸，另一管滴加饱和的苦味酸溶液，观察沉淀的形成。

III总氮量的测定一微量凯氏定氮法

常用微量凯氏定氮法测定天然含氮有机物中的含氮量。

含氮有机物与浓硫酸共热，被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，氨进一步与硫酸作用生成硫酸铁。

由大分子分解成小分子的过程通常称为“消化”。

消化过程一般进行的比较缓慢。

通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高消化液的沸点（消化液的沸点由290℃-400℃），加入硫酸铜作为催化剂，过氧化氢作为氧化剂，以促进反应的进行。

硫酸铵与浓碱作用可游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的H＋浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来H＋浓度为止。

最后根据所用标准酸的量计算出待测物中总氮量。

（NH4）2SO4＋2NaOH→2NH4OH+Na2SO4

NH4OH→NH3+H2O

H3BO4→H++H2BO4

NH3+H+＋H2BO4-→NH4H2BO4

NH4H2BO4+HCI→NH4CI+H＋+H2BO4-

一、试剂和器材

1．试剂

（1）消化液30％过氧化氢与硫酸与水的比例为3:

2:

1，即在1份的蒸馏水中缓慢加入2份的硫酸，待冷却后，将其加到3份的过氧化氢中。

临用时配制。

（2）催化剂硫酸铜（CuSO4·5H2O）与硫酸钾（K2SO4）以1:

3配比研磨混合。

（3）40％氢氧化钠溶液（4）2％硼酸溶液

（5）标准盐酸溶液（约0.0100mol/L）（6）混合指示剂（田氏指示剂）混合指示剂由50ml0.1％甲烯蓝乙醇溶液与200ml0.1％甲基红乙醇溶液混合配成。

贮于棕色瓶中备用。

这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色，变色范围很窄且很灵敏。

2.器材

消化管或凯氏烧瓶、凯氏定氮蒸馏装置、电炉、100ml锥形瓶、5ml酸式滴定管。

一、操作方法

（一）微量凯氏定氮仪的构造和安装

凯氏定氮仪由蒸汽发生器、反应室、冷凝管三部分组成。

蒸汽发生器包括一个电炉及一个3-5升容积的烧瓶。

蒸汽发生器借橡皮管与反应室相连。

反应室上边有二个小烧杯，一个供加样用，一个盛放碱液。

样品和碱液由此可直接到反应室中。

反应室中心有一长玻璃管，其上端通到反应室外层，下端靠近反应室的底部。

反应室下端底部有一开口，上有橡皮管和管夹。

由此放出反应废液。

反应所产生的氨可通过反应室上端细管经

冷凝管通入收集瓶中。

反应室与冷凝管之间由橡皮管相连。

安装仪器时，将蒸汽发生器垂直地固定在铁架台上，用橡皮管把蒸汽发生器、反应室、冷凝管连接起来。

橡皮管连接的部位应在同一水平位置。

冷凝管下端与实验台的距离以放得下收集瓶为准。

安装完毕后，不得轻易移动，以免仪器损坏。

要认真检查整个装置是否漏气，以保证所测结果的准确性。

（二）样品的处理

1．固体样品随机取一定量研磨细的样品放入恒重的称量瓶中，置于105℃的烘箱中干燥4h，用增锅钳将称量瓶取出放入干燥器内，待降至室温后称重，随后继续干燥样品，每干燥lh，称重一次，恒重即可。

2．血清样品取人血（或猪血）放入离心管中，干冰箱中放置过夜。

次日离心除去血凝块，上层透明清液，即为血清。

吸出lml血清加到50ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀备用。

溶液如果显浑浊，加少量氯化钠再混匀。

（三）消化

取5支消化管并编号，在1、2、3号管中各加入精确称取的干燥样品（注意：

加样品时应直接送入管底，避免沾到管口和管颈上）,加催化剂05g，混合消化液3ml，在4、5号管中各加相同量的催化剂和混合消化液（若样品是液体时，还要加与样品等体积的蒸馏水）作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。

摇匀后，将5支消化管放在通风厨内的远红外消煮炉上消化。

先用小火加热煮沸，不久看到消化管内物质

碳化变黑，并产生大量泡沫，此时要特别注意，不能让黑色物质丘升到消化管的颈部，否则将严重地影响样品测定结果。

当混合物停止冒泡，蒸汽与二氧化碳也均匀地放出时，适当加强火力。

在消化时，应使全部样品都浸泡在消化液中，如在瓶颈t发现有黑色颗粒，应小心地将消化管倾斜振摇，用消化液将它冲洗下来。

通常消化需要1-3h（对于那些赖氨酸含量较高的样品需要更长的时间）。

待消化液变成褐色后，为了加速消化完成，可将消化管取出，稍冷，加30％过氧化氢溶液1-2滴于管底消化液中，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成清晰的淡蓝绿色，消化即告成功。

为了保证消化彻底，再继续加热0.5h。

消化完毕，取出消化管冷却至室温。

（四）蒸馏

1．仪器的洗涤仪器应先经一般洗涤，再经水蒸汽洗涤。

目的在于洗去冷凝管中可能残留的氨。

对于处于使用状态的仪器（正在测定中的仪器）加样前使蒸汽通过1-2min即可，对于较长时间未使用的仪器，必须用水蒸汽洗涤到吸收蒸汽的硼酸一指示剂混合液中指示剂的颜色合格为止。

洗涤方法如下：

取2-3个100ml锥形瓶，加入10m12％硼酸、2滴混合指示剂，用表面皿覆盖备用。

先煮沸蒸汽发生器，器中盛有2/3体积的用几滴硫酸酸化过的蒸馏水，样品杯中也加入2/3体积蒸馏水进行水封。

关闭夹子使蒸汽通过反应室中的插管进入反应室，再由冷凝管下端逸出。

在冷凝管下端放一空烧杯以承受凝集水滴。

这样用蒸汽洗涤5min左右，在冷

凝管下口放一个准备好的盛有硼酸-指示剂的锥形瓶，位置倾斜，冷凝管下口应完全浸泡于液体内，继续用蒸汽洗涤1-2min，观察锥形瓶中的溶液是否基本上不变色，若不变色，则证明蒸馏器内部已洗涤干净。

下移锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管口约1cm，继续通蒸汽lmin。

最后用蒸馏水冲洗冷凝管外口，排废开始。

用右手轻提样品杯中棒状玻塞，使水流入反应室的同时，立即用左手关闭夹子，盖好玻塞。

由于反应室外层中蒸汽冷缩、压力降低，反应室内废液通过反应室中插管自动抽到反应室外壳中，再在样品杯中加入2/3体积蒸馏水，如此反复三次即可排尽废液及洗涤液。

打开夹子将反应室外壳中积存的废液排出，关闭夹子再使蒸汽通过全套蒸馏仪1-3min，可进行下一次蒸馏。

2．样品及空白的蒸馏取5个100ml锥形瓶，分别加入2％硼酸10ml，混合指示剂2滴，溶液呈紫红色，用表面皿覆盖备用。

把消化管中的消化液全部转移到样品杯中，用约2ml蒸馏水冲洗消化管，重复3次，把洗涤液都倒入样品杯中，打开样品杯的棒状玻塞，将样品放入反应室，用少量燕溜水冲洗样品杯后也使之流入反应室，盖上玻塞，并在样品杯中加约2/3体积的蒸馏水进行水封。

而后将装有硼酸一指示剂的锥形瓶放在冷

凝管口下方，打开存放碱液杯下端的夹子，放10ml40％氢氧化钠溶液于反应室后，立即上提锥形瓶，使冷凝管下口浸没在锥形瓶的液面下。

反应液沸腾后，锥形瓶中的硼酸-指示剂混合液由紫红色变为绿色，自变色时起计时，蒸馏3-5min，移动锥形瓶，使硼酸液面离开约1cm，并用少量蒸馏水冲洗冷凝管下口外面，继续蒸馏lmin，将锥形瓶取出，用表面皿覆盖以待滴定。

排废和洗涤等操作与前面相同。

排废洗涤后，可进行下一个样品的蒸馏（每一个样品要同时做三份，以求得准确结果）。

待样品和空白消化液蒸馏完毕后，同时进行滴定。

（五）滴定

全部蒸馏完毕后，用0.0100mol/I标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，直至硼酸-指示剂混合液由绿色变回淡紫色，即为滴定终点。

（六）计算

样品的总氮含量（g氮/%）=（A-B）×0.0100×14×100/（C×1000）

若测定的样品含氮部分只是蛋白质，（如血清）则：

样品中的蛋白含量（g/%）=（A-B）×0.0100×14×6.25×100/（C×1000）式中：

A为滴定样品用去的盐酸体积（ml）;B为滴定空白用去的盐酸体积（ml）;C为称量样品的量（g）;0.0100为盐酸的摩尔浓度（mol/l）（实际上，此项应按实验中使用盐酸的实际浓度填写）;14为氮原子量；6.25为系数（1ml0.01mol/I盐酸相当于0.14mg氮）。

若样品中除有蛋白质外，尚有其它含氮物质，则样品蛋白质含量的测定要复杂一些。

首先，需向样品中加入三氯乙酸，使其最终浓度为5%，然后测定未加入三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品的上清液中的含氮量，得出非蛋白氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步折算出蛋白质含量。

蛋白氮＝总氮-非蛋白氮蛋白质含量（g/％）＝蛋白氮×6.25

IV透析

原理：

透析是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖等分开。

常用的半透膜是玻璃纸或称塞璐玢纸、火棉纸或称塞璐锭纸盒其他改型的纤维素材料，透析时把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中进行的，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质降低到最小值为止。

一、试剂和器材

1．试剂

EDTA，NaCO3，NaOH。

2．器材

电炉，磁力搅拌器，500ml烧杯

二、操作过程

1．透析袋的预处理：

取100ml0.01mol/l的EDTA溶液，加入1gNaCO3，溶解后用NaOH调pH值为7.0；将透析袋剪成适宜长度，放入EDTA溶液中煮沸10分钟，然后用蒸馏水冲洗，再用EDTA溶液煮10分钟，反复处理4-5次，在蒸馏水中与4℃保存备用。

2．透析：

将样品放入透析袋内，两端封闭（注意袋内不要留气泡），放入透析液中在磁力搅拌器上透析。

V蛋白质含量测定

一、双缩脲法测定蛋白质浓度

（一）目的

了解并掌握双缩脉法测定蛋白质浓度的原理和方法。

（二）原理

具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与硫酸铜形成紫色络合物，在540nm处有最大吸收。

在一定浓度的范围内，蛋白质浓度与双缩脲反应所呈的颜色深浅成正比，可用比色法定量测定。

双缩脲法最常用于需要快速但不要求十分精确的测定。

（三）实验仪器

容量瓶、试管、吸管、分光光度计等。

（四）实验试剂

1.标准蛋白溶液（5mg/ml）准确称取已定氮的酪蛋白（干酪素或牛血清白蛋白）用0.05mol/l氢氧化钠溶液配制，冰箱存放备用。

2.双缩脲试剂：

溶解1.5g五水硫酸铜和酒石酸钾钠于500ml蒸馏水中，在搅拌下加入300ml10%氢氧化钠溶液，用水稀释到1000ml，贮存于内壁涂以石蜡的瓶内，此试剂可长期保存。

3.样品血清：

动物血清用水稀释10倍，置于冰箱保存备用。

（五）操作

1．标准曲线的绘制：

将7只干燥试管编号，按下表加人试剂：

各管混匀后，分别加入双缩脲试剂3.0ml充分混匀，于37℃水浴30min，在波长540nm处比色，以0号管调零点测定各管吸光度，以吸光度为纵坐标，蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。

2.样品测定取未知浓度的蛋白质溶液3.0ml，置试管内，加入双缩脲试剂3.0ml充分混匀，在540nm处测吸光度，对照标准曲线，求得未知溶液的蛋白质浓度（含量），在根据样品稀释倍数换算为g/100ml。

操作1、2应同时进行。

此外还可用标准管法测定（可参见相关资料）

二、福林-酚试剂法测定蛋白质浓度

（一）目的

熟悉并掌握福林-酚法测定蛋白质浓度的原理和方法。

（二）原理

蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比，可用比色法测定蛋白质浓度。

此法也适用于酪氨酸或色氨酸的定量测定。

（三）实验器材

1.蛋白质及其水解产物。

2.722型（或7220型）分光光度计。

3.试管1.5cmx1.5cm（×8）。

4.吸管0.50ml、0.10ml、0.20ml、5.0ml。

（四）实验试剂

1.福林-酚试剂A：

将19Na2CO3溶于50ml0.lmol/lNaOH溶液。

另将0.5gCuSO4·5H2O溶于100mll％酒石酸钾（或酒石酸钠）溶液。

将前者50ml与硫酸铜-酒石酸钾溶液lml混合。

混合后的溶液一日内有效。

2.Folin-酚试剂B：

将100g钨酸钠（Na2WO4·2H2O）、25g钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）、700ml蒸馏水、50ml85％磷酸及100ml浓盐酸置于1500ml磨口圆底烧瓶中，