诺丽汁改善吸烟者的血脂状况及其他风险指标(西沙诺丽酵素).docx
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·抗血脂活性·诺尼的保健功效—国际最新研究进展论文集
TheScientificWorldJournal.2012,ArticleID594657.
诺尼汁改善吸烟者的血脂状况及其他风险指标
诺尼汁改善吸烟者的血脂状况及其他风险指标
Mian-YingWang,aLinPeng,aVickiWeidenbacher-Hoper,bShixinDeng,cGaryAndersonaandBrettJ.Westc
(a罗克福德伊利诺伊大学医学院病理系,罗克福德,美国;b罗克福德伊利诺伊大学医学院家庭和社区医学系,罗克福德,美国;c巴戟天公司研究发展部,福克,美国)
摘要:
香烟烟雾诱导的氧化应激会引起血脂异常和系统性炎症并发。
诺尼果汁已被发现具有显著的抗氧化活性。
132位烟瘾严重的成年人完成了一项随机、双盲、用以安慰剂对照的临床试验,旨在研究诺尼果汁对血清胆固醇,甘油三酯,低密度脂蛋白胆固醇(LDL),高密度脂蛋白胆固醇(HDL)、高敏C-反应蛋白(HS-CRP)和同型半胱氨酸的作用。
在为期一个月内,志愿者每日饮用诺尼果汁或一种果汁安慰剂。
每天饮用29.5ml-188ml的诺尼汁能显著降低胆固醇水平,甘油三酯和hs-CRP水平。
并且在饮用诺丽果汁的志愿者中也观察到了LDL和同型半胱氨酸的减少以及HDL的增加。
不含环烯醚萜苷的安慰剂对血液中的血脂和hs-CRP水平没有显着影响。
诺尼汁能缓解香烟烟雾引起的高血脂,这一活性与环烯醚萜苷的存在有关。
1.前言
吸烟者持续吸入数以千计的致癌物质和自由基。
据估计,每一缕香烟烟雾中大约含有1017个氧化物分子[1]。
自由基增加了多形核白细胞数并诱发脂质过氧化作用,从而造成氧化损伤[2,3]。
此外,吸烟者的多数氧化应激指标升高。
这些指标包括增加巨噬细胞中释放的活性氧种类增加,如从外周血中性粒细胞释放的过氧化物,低密度脂蛋白胆固醇(LDL)的氧化,脂质氢过氧化物和丙二醛增加,血浆抗氧化能力降低[4-11]。
吸烟造成的众多有害健康的影响包括脂代谢紊乱和系统性炎症并发。
吸烟增加总胆固醇和三甘油酯,同时降低高密度脂蛋白胆固醇的事实早已被证实。
54项研究的综合分析显示,吸烟者比不吸烟者的血清胆固醇高出约3%,血清甘油三酯浓度比不吸烟者高出9%。
同时还发现,吸烟者的HDL比不吸烟者低5.7%[12]。
通过对吸烟者频率的分析,总胆固醇和甘油三酯的增加,以及相应的高密度脂蛋白的降低,被认为具有剂量依赖性。
基于人群的研究也显示,系统性炎症的指标物,如CRP在吸烟者以及二手烟吸入者的体内均有上升[13,14]。
与吸烟有关的CRP升高也伴随着血清同型半胱氨酸水平的上升[15]。
虽然烟草烟雾毒性的分子机制还没有完全清楚,但是自由基介导的氧化应激被认为起了核心作用[16,17]。
吸烟者的氧化应激可通过血清丙二醛浓度来测定,与甘油三酯和胆固醇水平呈正相关[18]。
香烟烟雾不仅可以增加自由基,也可通过弱化抗氧化防御系统,如降低对氧磷酶的活性来提高氧化应激[19]。
这些条件导致线粒体受损[20],香烟烟雾甚至可能因脂质过氧化和相应的炎症反应诱发肝损伤[21,22]。
这些改变很可能导致脂质代谢的失衡。
水果和蔬菜是膳食抗氧化剂的主要来源。
流行病学研究表明,水果和蔬菜可降低吸烟者因自由基引起的氧化损伤和脂质过氧化[23]。
诺尼(NONI)是生长在许多热带地区的一种常绿小乔木。
诺尼果实作为药食两用的水果,在太平洋群岛和东南亚有一个悠久的食用历史[24,25]。
诺尼果的多种保健功能也已有报道[26],包括免疫调节作用[27,28],体外和体内的抗氧化活性[29-31]。
已经发现诺尼汁对运动员发挥的抗氧化的功效,帮助其增加耐力[32]。
诺尼果汁也降低了重度吸烟者血浆中超氧阴离子自由基和脂质过氧化物的浓度[33]。
因其表现出的抗氧化活性,同样也可降低香烟烟雾带来的一些有害影响。
因此,目前的研究旨在探讨诺尼汁对当前重度吸烟者的血清胆固醇,甘油三酯,低密度脂蛋白,高密度脂蛋白胆固醇,高敏C-反应蛋白(HS-CRP)和同型半胱氨酸水平的影响。
2.材料和方法
2.1研究道德
罗克福德伊利诺伊大学医学院的机构审查董事委员会批准了这项试验的研究方案。
所有参与研究的受试者都提供了书面同意书。
该试验遵守照赫尔辛基宣言。
2.2研究对象
132成人吸烟者参加了本试验。
入选标准为年龄在18至65岁的吸烟者,平均每天吸烟20支以上,有超过一年的吸烟史,没有同时使用处方药或抗氧化维生素,或者在之前的3个月内未使用这些药物。
所有研究对象进行了面试,并要求完成了人口和健康情况调查表。
研究参与者被随机分配到一个118毫升安慰剂组(n=26),29.5毫升的诺尼果汁(n=51),或118毫升的诺尼果汁剂量组(n=55)。
男性和女性患者的比例相等。
2.3诺尼果汁和安慰剂
试验所用的诺尼汁为欧盟批准的大溪地诺尼果汁(TahitianNoniJuice,MorindaInc.,Provo,Utah)。
葡萄和蓝莓混合果汁组成的安慰剂,用天然奶酪的味道模仿诺尼果汁的味道,它也作为不含环烯醚萜果汁的对照。
2.4干预
参与者和观察员都不清楚治疗组的分配。
29.5mL组被要求在早晨空腹饮用诺尼果汁。
在其他两个组被要求喝59毫升,每日两次(每日118毫升计),早上空腹一次,睡前一次。
按此服用30天。
不要求参加者在干预期间改变吸烟习惯,假设其继续以受试前同样的方式(相同的量和持续时间)吸烟。
2.5血清的制备和分析
每名参加者报名时和每次干预完成时各抽取10毫升全血,转入离心管,4度放置2-3小时,然后1500×g离心20分钟以分离血清。
血清样品被送到伊利诺伊州芝加哥医学中心实验室进行血脂,hs-CRP水平,和同型半胱氨酸分析。
2.6数据与统计分析
对试验数据进行系统分以评价其是否具有显著影响[34]。
本实验旨在比较各组试验前后的每对数据。
为了评估诺丽果汁与安慰剂对于血清的影响,对每组干预前后,以及诺丽果汁组与安慰剂组的均值采用t分布进行了比较。
2.7化学分析
根据先前报道的方法[35],环烯醚萜的含量,特别是去乙酰基车叶草苷酸(DAA)和车叶草甙酸(AA),通过高效液相色谱(HPLC)进行测定。
色谱乙腈(MeCN),甲醇(MeOH)和水购自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯,MO,美国)。
分析纯甲酸购自谱化学品制造股份有限公司(新不伦瑞克,NJ,USA)。
去乙酰基车叶草苷酸(DAA)和车叶草甙酸(AA)标准品,在本实验室从诺尼果汁中分离得到。
通过高效液相色谱法、质谱和核磁共振的res-onance(NMR)鉴定,纯度高于99%。
精确称量后溶解在适当体积的甲醇中备用。
试验中使用的DAA和AA的标准曲线分别通过0.00174-1.74mg/mL和0.0016-0.8mg/mL稀释的甲醇(依次递增)的7个浓度获得。
所有试验及贮存均在0℃下进行。
诺丽果汁及安慰剂样品均用MeOH-H2O(1:
1)稀释,然后通过0.45微米的尼龙膜过滤器过滤。
在配有C18柱的966PDA分离单元的Waters2690(4.6mm*250mm,5µm,WatersCorporation,Milford,MA,USA)下进行色谱分析。
该泵连接两个移动液相A;乙腈和B:
0.1%甲酸的水溶液(体积比),在0.8mm/min流速洗脱。
流动梯度编程如下:
0-5分钟,0%A,40分钟,30%A。
PDA检测器控制在210-400纳米范围内。
每个样品溶液注射10μL。
柱体温度保持在25℃。
使用WatersMillennium32(版本)进行数据的收集整合。
表1:
安慰剂和诺丽果汁使用前后血清测量的比较
剂量组及采样时间
总胆固醇(mg/dL)
甘油三酯(mg/dL)
hs-CRP(mg/L)
安慰剂组
使用前
239.2±9.4
254.2±54.2
1.48±2.16
使用后
246.6±16.9
281.7±37.3
2.22±1.79
29.5mL诺丽果汁组
使用前
使用后
250.2±36.75
186.2±53.3a
325.9±152.0
191.5±131.4a
1.61±1.55
1.39±1.36b
118mL诺丽果汁组
使用前
242.3±43.5
310.4±163.4
1.72±1.51
使用后
193.2±70.5a
218.8±150.8b,c
1.46±1.39b,c
aP<0.001与安慰剂组和基线相比,bP<0.05与安慰剂组相比,cP<0.05与基线相比
根据先前报道的方法[36],诺尼汁中的其他主要次级代谢产物也通过HPLC进行分析。
准确称量东莨菪素,芦丁,槲皮素,和绿原酸,溶解于合适体积的甲醇/乙腈中,配制出相应的标准溶液。
同样采用上述Waters2690(配有C18柱和966PDA检测器)进行色谱分析。
由三种溶剂构成流动相系统:
A,MeCN;B,MeOH;C,0.1%体积比的TFA水溶液。
浓度梯度如下:
0分钟,10%A,10%B,80%C,15分钟,20%A,20%B,60%C,26分钟,40%A,40%B,20%C,28至39分钟,50%A,50%B,以及0%的C;40-45分钟,10%A,10%B,80%C。
流速保持在1.0mL/min洗脱。
在362nm处进行紫外光谱测定。
总多酚含量的测定通过的Folin-Ciocalteu法。
将样品离心分离,用去离子水稀释10倍。
稀释的样品(10μL)与800μL去离子水以及50μLFolin-Ciocalteu(2N)混合。
室温下保持几分钟后,于样品管中加入150μLNaCO3(饱和)摇匀,并在室温孵育2小时。
使用同样的方法制备空白组和没食子酸标准组。
孵育后,在765nm处用酶标仪测得空白组,标准组合样品组的吸光度。
使用没食子酸浓度与吸光度建立校正曲线,以便确定样品中的总酚含量。
由于诺丽果汁富含维生素C[37],经过巴氏杀菌和灌装后对安慰剂组和诺丽果汁中的维生素浓度进行了测定。
3.结果
3.1参与者的人口统计
组与组之间在人口统计学上没有显著性差异。
每个组维持1:
1的性别比例,年纪从37到43不等。
各组的平均吸烟量是每日26-28.6支,平均32.19-32.49包/年(每天吸烟量的综合除以年份)。
各组民族分布主要是白人,76-95%;非裔美国人,8-22%。
最后,118mL诺丽组较29.5mL组有较大比例的达不到饮用量。
错失5次以下的在29.5mL组与118mL组分别占30%和32%。
错失了5-10次的比例在低剂量组和高剂量组分别为2%和10%。
3.2血脂、超敏C反应蛋白及同型半胱氨酸的变化
对诺尼果汁组和安慰剂组人员的总胆固醇、甘油三酯及超敏C反应蛋白进行了比较(结果见表1),安慰剂组没有明显变化,即使30天后这些值出现了轻微增长的趋势。
两组诺尼果汁试验组人员的总胆固醇、甘油三酯及超敏C反应蛋白的均有降低。
试验后结果明显低于试验前及安慰剂组。
唯一的区别是29.5mL诺尼果汁组试验后测得的超敏C反应蛋白值明显低于安慰剂组(P<0.05),但与基线值未有显著性差异(P>0.05)。
诺尼果汁组总胆固醇、甘油三酯及超敏C反应蛋白分别降低20.3-25.6%,29.4-41.2%及15.2%。
对两诺尼果汁组试验后的指标值进行了比较未发现显著性差异。
这表明日服用量29.5mL可能已达到抗氧化活性的阈值,但是也可能是由于服用118mL组的服从性较低的缘故。
表2诺丽果汁组使用前后在指定基线范围内的总胆固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯水平变化
基线范围
基线
使用后
总胆固醇(TC)
190–219mg/dL
220–299mg/dL
>300mg/dL
204.4±9.3
249.1±21.5
328.7±22.8
190.8±41.6
203.9±69.4a
256.4±89.3b
LDL
TC190–219mg/dL
TC220–299mg/dL
154.6±10.3
199.1±20.5
140.8±21.6b
153.4±1.4a
TC>300mg/dL
287.7±20.8
206.4±39.3
甘油三酯(Trig)
170–199mg/dL
200–399mg/dL
>400mg/dL
184.1±7.5
266.7±48.0
553.6±143.5
166.6±95.3b
209.1±129.3b
255.5±219.7
aP<0.001,bP<0.05
两诺尼果汁组试验前后总胆固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯的分层分析结果见表2。
在此分析中,分层是建立在总胆固醇或甘油三脂的基准值或初始值之上的。
血清胆固醇的低、中、高基线分别为190-219mg/dL,200-399mg/dL,>300mg/dL。
甘油三脂的低、中、高的基线分别为170-199mg/mL,200-399mg/dL,>400mg/dL。
这样分析的目的是为了评估诺丽果汁对偏离正常值的影响。
总胆固醇、低密度脂蛋白及甘油三脂的值相对于最低级别分别降低了6.6%,8.9%和9.5%。
采用同样的方法相对于中级别来说降低的比例分别为18.1%,22.9%,21.6%。
相对于高级别来说降低的比例分别为22.0%,28.2%,53,8%,但是仅总胆固醇的改变达到统计学显著水平。
分层分析表明作用效果随着初始胆固醇或初始甘油三脂水平的增加而增加。
表3列出来诺尼果汁剂量对总胆固醇和甘油三酯的分层分析结果。
每组中层级的血清总胆固醇和甘油三酯明显下降。
在29.5mL诺尼果汁组中,低层级的胆固醇和高层级的甘油三脂有显著下降。
很明显,层级越高降低的趋势也越大。
29.5mL诺尼果汁组平均总胆固醇低、中、高层级降低比例分别为12.1%,17.3%和36.4%。
此组中甘油三脂低、中、高层级的降低比例分别为10.5%,29.3%和61.8%。
118mL诺尼果汁组平均总胆固醇低、中、高层级降低比例分别为9.9%,29.2%和23.6%,相应的甘油三脂的降低比例分别为12.6%,25.2%和41.7%。
每组起始的胆固醇或甘油三脂水平越高平均降低值越大。
唯一例外的是118mL组的总胆固醇降低比例,中层级的降低比例高于高层级。
诺尼果汁组同型半胱氨酸水平的下降。
基线水平(19.7±8.5μmol/L)的平均值(±标准偏差)从23.9%降至15.0±9.0(P<0.05)。
相反,诺尼果汁组HDL平均值从49±10增加至57±9mg/dL(P<0.05)。
表3:
诺丽果汁组总胆固醇、甘油三酯在指定标准内的变化
基础范围 29.5mLNonijuice118mLNonijuice
Baseline PosttestBaseline Posttest
总胆固醇(TC)
190–219mg/dL 200.1±7.1 175.8±50.0a 206.4±10.5 186.0±59.7
220–299mg/dL 236.2±16.8 195.3±50.9a 262.8±17.9 186.1±74.1a
>300mg/dL 323.7±18.6 205.7±84.3 328.8±27.8 251.2±87.3
甘油三酯(Trig)
170–199mg/dL 184.6±6.1 165.2±136.4 185.5±7.0 162.1±58.6
200–399mg/dL 273.5±52.2 193.3±141.5a 267.9±8.8 200.4±29.2a
>400mg/dL 547.4±111.3 208.9±109.0a583.6±187.8 340.3±311.7
a
P<0.05
表4:
诺丽果汁和安慰剂中植物化学成分(平均值±标准差)在临床上的评估
分析成分
诺尼汁组
安慰剂组
绿原酸(mg/mL)
0.0831±0.0015
0.1030±0.0020
芦丁(mg/mL)
0.0349±0.0004
0.0252±0.0004
总胆固醇(mg/mL)
0.6200±0.0400
0.4900±0.0600
总环烯醚萜(mg/mL)
0.5115±0.0162
nonedetected
去乙酰基车草叶甘酸(mg/mL)
0.3747±0.0158
nonedetected
车草叶甘酸(mg/mL)
东莨菪(mg/mL)
0.1122±0.0070
0.0139±0.0005
nonedetected
nonedetected
3.3不良反应
干预期内安慰剂组及诺尼果汁组均为出现不良反应。
3.4诺尼果汁和安慰剂化学成分的对比
诺利果汁及安慰剂的植物化学组成比较如表4.两种物质的总多元酚构成相近,黄酮(槲皮黄酮和芦丁)或绿原酸浓度也无太大差异。
维生素C的浓度差别,均低于0.2mg/mL.而环烯醚萜类大量出现在诺尼果汁中,安慰剂中却没有。
东莨菪内酯同样在诺尼果汁中检出,但是其含量与总环烯醚萜浓度相比却很低,低于之前提及的发挥有效抗氧化活力的值[38,39]。
4.讨论
重度吸烟者在摄入诺尼果汁四周后其血清总胆固醇,低密度脂蛋白,甘油三脂,超敏C反应蛋白及同型半胱氨酸的含量降低。
此发现与之前研究报告结果一致,研究报告指出体内及人类干预研究表明补充抗氧化营养物质和植物提取物可抑制由香烟引起的血脂异常[40-43]。
还有一点需要指出的是在诺尼果汁没有使参与人体试验的受试者(已处于正常健康范围内)发生任何变化。
例如,血脂正常的轻度(<5支烟/天)或非吸烟的96位健康志愿者在为期四周、日服用量30,300或750mL诺尼果汁试验中,其总胆固醇,低密度脂蛋白,高密度脂蛋白及甘油三脂水平均未出现改变[44]。
同样34位糖尿病患者在进行了日服用量30mL,为期21天的试验后总胆固醇,低密度脂蛋白,高密度脂蛋白及甘油三脂水平没有改变,目前血脂水平仍维持在正常水平。
因此,我们研究发现的高血脂的降低可能是由于诺尼果汁能够抑制氧化应激。
重度吸烟者在饮用诺尼果汁四周后,即使与果汁安慰剂组相比,其血脂情况也得到了改善。
诺尼果汁及安慰剂的植物化学分析表明环烯醚萜类,特别是酰基车叶草甙酸及车叶草甙酸是主要的区别点。
环烯醚萜类以其抗氧化活性著称[46]。
橄榄苦苷,一种裂环烯醚萜,可能是一种最典型的与其抗氧化活性相关的物质[47-49]。
与临床试验结果相似的是,橄榄苦苷在体内试验中能够降低总胆固醇,甘油三脂及低密度脂蛋白水平,同时能够增加高密度脂蛋白水平。
这种结果可能是由于抗氧化酶的活性增加[50]。
而且,作为橄榄苦苷的主要来源,橄榄叶提取物在人类干预研究中也发现其能够降低总胆固醇水平。
数据表明环烯醚萜苷类也具有抗氧化潜能。
两种环烯醚萜苷类物质与诺尼果汁中发现的马钱苷酸、马钱子苷结构相似。
马钱苷酸能够减少人类中性粒细胞中超氧化物的产生,此超氧化物是在浓度依赖模式下由N-酰基-甲二黄酰-苯基丙氨酸、花生四烯酸激活[52]。
马钱子苷在小鼠肾脏系膜细胞培养中表现出抗氧化活力,在培养过程中加入能诱导细胞氧化应激反应的高级糖基化终产物。
细胞在加马钱子苷培养48h后表现出例如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶活性增加,而丙二醛浓度降低[53]。
与橄榄中橄榄苦苷的抗氧化活性相似,出现在诺尼果汁中的环烯醚萜类物质能够在体外试验中抑制低密度脂蛋白(LDL)的氧化。
乙酰基车草叶甘酸及车草叶甘酸对由硫酸铜诱导的人类低密度脂蛋白氧化作用均表现出重要的的抑制作用[54]。
同样,乙酰基车草叶甘酸及车草叶甘酸也能阻止体外试验中由4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO-)诱导的DNA的损害。
4NQO是一种遗传毒物,能够引起DNA氧化产物-羟基脱氧鸟苷(8OHdG)的形成。
4NQO的暴露能够导致超氧化物,过氧化氢及羟基自由基的形成,从而,引起哺乳动物及细菌细胞DNA内产生大量的8OHdG[55,56]。
使用乙酰基车叶草甙酸及车叶草甙酸能够使4NQO在原核细胞内的基因毒性分别降低98.96和99.22%。
因此添加任意一种环烯醚萜类物质均能使4NQO的体外氧化活力几乎完全消失。
含有环烯醚萜类物质的诺尼果汁及缺少此类物质的安慰剂的抗氧化活力表明此类物质与试验中诺尼果汁表现出的保护性或适应性效果至少有一定的相关性。
一些人体研究结果已经表明香烟烟雾能够降低谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽转移酶的活力[57-62].有趣的是在先前的试验中发现诺尼果汁使等离子过氧化氢脂质降低的幅度大于等离子超氧阴离子自由基[33],这表明诺尼果汁可能有效增加谷胱甘肽过氧化物酶及谷胱甘肽转移酶的活性。
这一可能性得到以下发现的进一步支持:
对链脲霉素诱导的糖尿病小鼠喂养诺尼果汁醇类提取物30天后,上述两种酶的活性加倍[63]。
因此诺尼果汁或许可通过增加谷胱甘肽利用酶的活性来抑制由香烟烟雾诱导的氧化应激反应,从而进一步抑制血脂异常的发生。
致谢
作者非常感谢AlexandraCheerva博士和JannetNoton博士对本研究的完成做出的贡献,感谢C.JarakaeJensen和AfaK.Palu的参与。
本研究得到了巴戟天公司(诺尼果汁生产商)的资金支持。
(选自埃及《科学世界杂志》,ID:
594657,张欣译。
)