蛋白质王镜岩生物化学第三版笔记完美打印版.docx

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蛋白质王镜岩生物化学第三版笔记完美打印版

第四章蛋白质

提纲

一.概念

简朴蛋白、结合蛋白、基本氨基酸、等电点、甲醛滴定法、Edman降解、一级构造、肽键、构型与构象、二面角、二级构造、超二级构造、构造域、三级构造、四级构造、亚基、别构蛋白、分子病、水化层、双电层、蛋白质变性与复性、盐析与盐溶

二.氨基酸

分类、基本氨基酸构造、分类、名称、符号、化学反映、鉴定、蛋白质水解

三.蛋白质构造

一级构造构造特点、测定环节、惯用办法、酶

二级构造四种构造特点、数据、超二级构造

三级构造重要靠疏水键维持

四级构造变构现象

构造与功能适应、构造变化对功能影响、典型蛋白质

四.蛋白质性质

分子量测定办法、酸碱性、溶解性、变性、颜色反映

第一节蛋白质通论

一、蛋白质功能多样性

蛋白质是原生质重要成分，任何生物都具有蛋白质。

自然界中最小、最简朴生物是病毒，它是由蛋白质和核酸构成。

没有蛋白质也就没有生命。

自然界生物各种各样，因而蛋白质种类和功能也十分繁多。

概括起来，蛋白质重要有如下功能：

1.催化功能生物体内酶都是由蛋白质构成，它们有机体新陈代谢催化剂。

没有酶，生物体内各种化学反映就无法正常进行。

例如，没有淀粉酶，淀粉就不能被分解运用。

2.构造功能蛋白质可以作为生物体构导致分。

在高等动物里，胶原是重要细胞外构造蛋白，参加结缔组织和骨骼作为身体支架，占蛋白总量1/4。

细胞里片层构造，如细胞膜、线粒体、叶绿体和内质网等都是由不溶性蛋白与脂类构成。

动物毛发和指甲都是由角蛋白构成。

3.运送功能脊椎动物红细胞中血红蛋白和无脊椎动物体内血蓝蛋白在呼吸过程中起着运送氧气作用。

血液中载脂蛋白可运送脂肪，转铁蛋白可转运铁。

某些脂溶性激素运送也需要蛋白，如甲状腺素要与甲状腺素结合球蛋白结合才干在血液中运送。

4.贮存功能某些蛋白质作用是贮存氨基酸作为生物体养料和胚胎或幼儿生长发育原料。

此类蛋白质涉及蛋类中卵清蛋白、奶类中酪蛋白和小麦种子中麦醇溶蛋白等。

肝脏中铁蛋白可将血液中多余铁储存起来，供缺铁时使用。

5.运动功能肌肉中肌球蛋白和肌动蛋白是运动系统必要成分，它们构象变化引起肌肉收缩，带动机体运动。

细菌中鞭毛蛋白有类似作用，它收缩引起鞭毛摆动，从而使细菌在水中游动。

6.防御功能高等动物免疫反映是机体一种防御机能，它重要也是通过蛋白质（抗体）来实现。

凝血与纤溶系统蛋白因子、溶菌酶、干扰素等，也肩负着防御和保护功能。

7.调节功能某些激素、一切激素受体和许多其她调节因子都是蛋白质。

8.信息传递功能生物体内信息传递过程也离不开蛋白质。

例如，视觉信息传递要有视紫红质参加，感受味道需要味觉蛋白。

视杆细胞中视紫红质，只需1个光子即可被激发，产生视觉。

9.遗传调控功能遗传信息储存和表达都与蛋白质关于。

DNA在储存时是缠绕在蛋白质（组蛋白）上。

有些蛋白质，如阻遏蛋白，与特定基因表达关于。

β－半乳糖苷酶基因表达受到一种阻遏蛋白抑制，当需要合成β－半乳糖苷酶时通过去阻遏作用才干表达。

10.其她功能某些生物能合成有毒蛋白质，用以袭击或自卫。

如某些植物在被昆虫咬过后来会产生一种毒蛋白。

白喉毒素可抑制生物蛋白质合成。

二、蛋白质分类

（一）按分子形状分类

1.球状蛋白外形近似球体，多溶于水，大都具备活性，如酶、转运蛋白、蛋白激素、抗体等。

球状蛋白长度与直径之比普通不大于10。

2.纤维状蛋白外形细长，分子量大，大都是构造蛋白，如胶原蛋白，弹性蛋白，角蛋白等。

纤维蛋白按溶解性可分为可溶性纤维蛋白与不溶性纤维蛋白。

前者如血液中纤维蛋白原、肌肉中肌球蛋白等，后者如胶原蛋白，弹性蛋白，角蛋白等构造蛋白。

（二）按分子构成分类

1.简朴蛋白完全由氨基酸构成，不含非蛋白成分。

如血清清蛋白等。

依照溶解性不同，可将简朴蛋白分为如下7类：

清蛋白、球蛋白、组蛋白、精蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白和硬蛋白。

2.结合蛋白由蛋白质和非蛋白成分构成，后者称为辅基。

依照辅基不同，可将结合蛋白分为如下7类：

核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血红素蛋白、黄素蛋白和金属蛋白。

三、蛋白质元素构成与分子量

1.元素构成所有蛋白质都具有碳氢氧氮四种元素，有些蛋白质还具有硫、磷和某些金属元素。

蛋白质平均含碳50％，氢7％，氧23％，氮16％。

其中氮含量较为恒定，并且在糖和脂类中不含氮，因此常通过测量样品中氮含量来测定蛋白质含量。

如惯用凯氏定氮：

蛋白质含量＝蛋白氮×6.25

其中6.25是16％倒数。

2.蛋白质分子量蛋白质分子量变化范畴很大，从6000到100万或更大。

这个范畴是人为规定。

普通将分子量不大于6000称为肽。

但是这个界限不是绝对，如牛胰岛素分子量为5700，普通仍以为是蛋白质。

蛋白质煮沸凝固，而肽不凝固。

较大蛋白质如烟草花叶病毒，分子量达4000万。

四、蛋白质水解

氨基酸是蛋白质基本构造单位，这个发现是从蛋白质水解得到。

蛋白质水解重要有三种办法：

1.酸水解用6MHCl或4MH2SO4，105℃回流20小时即可完全水解。

酸水解不引起氨基酸消旋，但色氨酸完全被破坏，丝氨酸和苏氨酸某些破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺酰胺基被水解。

如样品具有杂质，在酸水解过程中常产生腐黑质，使水解液变黑。

用3mol/L对甲苯磺酸代替盐酸，得到色氨酸较多，可像丝氨酸和苏氨酸同样用外推法求其含量。

2.碱水解用5MNaOH，水解10－20小时可水解完全。

碱水解使氨基酸消旋，许多氨基酸被破坏，但色氨酸不被破坏。

惯用于测定色氨酸含量。

可加入淀粉以防止氧化。

3.酶水解酶水解既不破坏氨基酸，也不引起消旋。

但酶水解时间长，反映不完全。

普通用于某些水解，若要完全水解，需要用各种酶协同作用。

第二节氨基酸

一、氨基酸构造与分类

（一）基本氨基酸

构成蛋白质20种氨基酸称为基本氨基酸。

它们中除脯氨酸外都是α-氨基酸，即在α-碳原子上有一种氨基。

基本氨基酸都符合通式，均有单字母和三字母缩写符号。

按照氨基酸侧链构造，可分为三类：

脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸和杂环氨基酸。

1.脂肪族氨基酸共15种。

侧链只是烃链：

Gly,Ala,Val,Leu,Ile后三种带有支链，人体不能合成，是必须氨基酸。

侧链具有羟基：

Ser,Thr许多蛋白酶活性中心具有丝氨酸，它还在蛋白质与糖类及磷酸结合中起重要作用。

侧链含硫原子：

Cys,Met两个半胱氨酸可通过形成二硫键结合成一种胱氨酸。

二硫键对维持蛋白质高档构造有重要意义。

半胱氨酸也经常出当前蛋白质活性中心里。

甲硫氨酸硫原子有时参加形成配位键。

甲硫氨酸可作为通用甲基供体，参加各种分子甲基化反映。

侧链具有羧基：

Asp（D）,Glu（E）

侧链含酰胺基：

Asn（N）,Gln（Q）

侧链显碱性：

Arg（R）,Lys（K）

2.芳香族氨基酸涉及苯丙氨酸（Phe,F）和酪氨酸（Tyr,Y）两种。

酪氨酸是合成甲状腺素原料。

3.杂环氨基酸涉及色氨酸（Trp,W）、组氨酸（His）和脯氨酸（Pro）三种。

其中色氨酸与芳香族氨基酸都含苯环，均有紫外吸取（280nm）。

因此可通过测量蛋白质紫外吸取来测定蛋白质含量。

组氨酸也是碱性氨基酸，但碱性较弱，在生理条件下与否带电与周边内环境关于。

它在活性中心常起传递电荷作用。

组氨酸能与铁等金属离子配位。

脯氨酸是唯一仲氨基酸，是α-螺旋破坏者。

B是指Asx，即Asp或Asn；Z是指Glx，即Glu或Gln。

基本氨基酸也可按侧链极性分类：

非极性氨基酸：

Ala,Val,Leu,Ile,Met,Phe,Trp,Pro共八种

极性不带电荷：

Gly,Ser,Thr,Cys,Asn,Gln,Tyr共七种

带正电荷：

Arg,Lys,His

带负电荷：

Asp,Glu

（二）不常用蛋白质氨基酸

某些蛋白质中具有某些不常用氨基酸，它们是基本氨基酸在蛋白质合成后来经羟化、羧化、甲基化等修饰衍生而来。

也叫稀有氨基酸或特殊氨基酸。

如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸、锁链素等。

其中羟脯氨酸和羟赖氨酸在胶原和弹性蛋白中含量较多。

在甲状腺素中尚有3,5-二碘酪氨酸。

（三）非蛋白质氨基酸

自然界中尚有150各种不参加构成蛋白质氨基酸。

它们大多是基本氨基酸衍生物，也有某些是D-氨基酸或β、γ、δ-氨基酸。

这些氨基酸中有些是重要代谢物前体或中间产物，如瓜氨酸和鸟氨酸是合成精氨酸中间产物，β-丙氨酸是遍多酸（泛酸，辅酶A前体）前体，γ-氨基丁酸是传递神经冲动化学介质。

二、氨基酸性质

（一）物理性质

α-氨基酸都是白色晶体，每种氨基酸均有特殊结晶形状，可以用来鉴别各种氨基酸。

除胱氨酸和酪氨酸外，都能溶于水中。

脯氨酸和羟脯氨酸还能溶于乙醇或乙醚中。

除甘氨酸外，α-氨基酸均有旋旋光性，α-碳原子具备手性。

苏氨酸和异亮氨酸有两个手性碳原子。

从蛋白质水解得到氨基酸都是L-型。

但在生物体内特别是细菌中，D-氨基酸也存在，如细菌细胞壁和某些抗菌素中都具有D-氨基酸。

三个带苯环氨基酸有紫外吸取，F:

257nm,ε=200;Y:

275nm,ε=1400;W:

280nm,ε=5600。

普通蛋白质紫外吸取重要是后两个氨基酸决定，普通在280nm。

氨基酸分子中既具有氨基又具有羧基，在水溶液中以偶极离子形式存在。

因此氨基酸晶体是离子晶体，熔点在200℃以上。

氨基酸是两性电解质，各个解离基表观解离常数按其酸性强度递降顺序，分别以K1’、K2’来表达。

当氨基酸分子所带净电荷为零时pH称为氨基酸等电点（pI）。

等电点值是它在等电点先后两个pK’值算术平均值。

氨基酸完全质子化时可看作多元弱酸，各解离基团表观解离常数按酸性削弱顺序，以pK1’、pK2’、pK3’表达。

氨基酸可作为缓冲溶液，在pK’处缓冲能力最强，pI处缓冲能力最弱。

氨基酸滴定曲线如图。

（二）化学性质

1.氨基反映

（1）酰化

氨基可与酰化试剂，如酰氯或酸酐在碱性溶液中反映，生成酰胺。

该反映在多肽合成中可用于保护氨基。

（2）与亚硝酸作用

氨基酸在室温下与亚硝酸反映，脱氨，生成羟基羧酸和氮气。

由于伯胺均有这个反映，因此赖氨酸侧链氨基也能反映，但速度较慢。

惯用于蛋白质化学修饰、水解限度测定及氨基酸定量。

（3）与醛反映

氨基酸α-氨基能与醛类物质反映，生成西佛碱-C=N-。

西佛碱是氨基酸作为底物某些酶促反映中间物。

赖氨酸侧链氨基也能反映。

氨基还可以与甲醛反映，生成羟甲基化合物。

由于氨基酸在溶液中以偶极离子形式存在，因此不能用酸碱滴定测定含量。

与甲醛反映后，氨基酸不再是偶极离子，其滴定终点可用普通酸碱批示剂批示，因而可以滴定，这叫甲醛滴定法，可用于测定氨基酸。

（4）与异硫氰酸苯酯（PITC）反映

α-氨基与PITC在弱碱性条件下形成相应苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-AA），后者在硝基甲烷中与酸作用发生环化，生成相应苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-AA）。

这些衍生物是无色，可用层析法加以分离鉴定。

这个反映一方面为Edman用来鉴定蛋白质N-末端氨基酸，在蛋白质氨基酸顺序分析方面占有重要地位。

（5）磺酰化

氨基酸与5-（二甲胺基）萘-1-磺酰氯（DNS-Cl）反映，生成DNS-氨基酸。

产物在酸性条件下（6NHCl）100℃也不破坏，因而可用于氨基酸末端分析。

DNS-氨基酸有强荧光，激发波长在360nm左右，比较敏捷，可用于微量分析。

（6）与DNFB反映

氨基酸与2,4-二硝基氟苯（DNFB）在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯基氨基酸（DNP氨基酸）。

这一反映是定量转变，产物黄色，可经受酸性100℃高温。

该反映曾被英国Sanger用来测定胰岛素氨基酸顺序，也叫桑格尔试剂，当前应用于蛋白质N-末端测定。

（7）转氨反映

在转氨酶催化下，氨基酸可脱去氨基，变成相应酮酸。

2.羧基反映

羧基可与碱作用生成盐，其中重金属盐不溶于水。

羧基可与醇生成酯，此反映惯用于多肽合成中羧基保护。

某些酯有活化作用，可增长羧基活性，如对硝基苯酯。

将氨基保护后来，可与二氯亚砜或五氯化磷作用生成酰氯，在多肽合成中用于活化羧基。

在脱羧酶催化下，可脱去羧基，形成伯胺。

3茚三酮反映

氨基酸与茚三酮在微酸性溶液中加热，最后生成蓝色物质。

而脯氨酸生成黄色化合物。

依照这个反映可通过二氧化碳测定氨基酸含量。

4.侧链反映

丝氨酸、苏氨酸含羟基，能形成酯或苷。

半胱氨酸侧链巯基反映性高：

（1）二硫键（disulfidebond）

半胱氨酸在碱性溶液中容易被氧化形成二硫键，生成胱氨酸。

胱氨酸中二硫键在形成蛋白质构象上起很大作用。

氧化剂和还原剂都可以打开二硫键。

在研究蛋白质构造时，氧化剂过甲酸可以定量地拆开二硫键，生成相应磺酸。

还原剂如巯基乙醇、巯基乙酸也能拆开二硫键，生成相应巯基化合物。

由于半胱氨酸中巯基很不稳定，极易氧化，因而运用还原剂拆开二硫键时，往往进一步用碘乙酰胺、氯化苄、N-乙基丁烯二亚酰胺和对氯汞苯甲酸等试剂与巯基作用，把它保护起来，防止它重新氧化。

（2）烷化

半胱氨酸可与烷基试剂，如碘乙酸、碘乙酰胺等发生烷化反映。

半胱氨酸与丫丙啶反映，生成带正电侧链，称为S-氨乙基半胱氨酸（AECys）。

（3）与重金属反映

极微量某些重金属离子，如Ag+、Hg2+，就能与巯基反映，生成硫醇盐，导致含巯基酶失活。

5.如下反映惯用于氨基酸检查：

l酪氨酸、组氨酸能与重氮化合物反映（Pauly反映），可用于定性、定量测定。

组氨酸生成棕红色化合物，酪氨酸为桔黄色。

l精氨酸在氢氧化钠中与1-萘酚和次溴酸钠反映，生成深红色，称为坂口反映。

用于胍基鉴定。

l酪氨酸与硝酸、亚硝酸、硝酸汞和亚硝酸汞反映，生成白色沉淀，加热后变红，称为米伦反映，是鉴定酚基特性反映。

l色氨酸中加入乙醛酸后再缓慢加入浓硫酸，在界面会浮现紫色环，用于鉴定吲哚基。

在蛋白质中，有些侧链基团被包裹在蛋白质内部，因而反映很慢甚至不反映。

三、色谱与氨基酸分析分离

1.色谱（chromatography）发展史

最早层析实验是俄国植物学家Цвет在19用碳酸钙分离叶绿素，属于吸附层析。

40年代浮现了分派层析，50年代浮现了气相色谱，60年代浮现HPLC，80年代浮现了超临界层析，90年代浮现超威量HPLC可分离ng级样品。

2.色谱分类：

按流动相可分为气相、液相、超临界色谱等；

按介质可分为纸层析、薄层层析、柱层析等；

按分离机制可分为吸附层析、分派层析、分子筛层析等

3.色谱应用

可用于分离、制备、纯度鉴定等。

定性可通过保存值、内标、原则曲线等办法，定量普通用原则曲线法。

氨基酸分析分离是测定蛋白质构造基本。

在分派层析和离子互换层析法开始应用于氨基酸成分分析之后，蛋白质构造研究才获得了显着成就。

当前这些办法已自动化。

氨基酸从强酸型离子互换柱洗脱顺序如下：

Asp,Thr,Ser,Glu,Pro,Gly,Ala,Cys,Val,Met,Ile,Leu,Tyr,Phe,Lys,His,（NH3）,Arg

第三节蛋白质一级构造

　蛋白质是生物大分子，具备明显构造层次性，由低层到高层可分为一级构造、二级构造、三级构造和四级构造。

一、肽键和肽

一种氨基酸羧基与另一种氨基酸氨基缩水形成共价键，称为肽键。

在蛋白质分子中，氨基酸借肽键连接起来，形成肽链。

最简朴肽由两个氨基酸构成，称为二肽。

具有三、四、五个氨基酸肽分别称为三肽、四肽、五肽等。

肽链中氨基酸由于形成肽键时脱水，已不是完整氨基酸，因此称为残基。

肽命名是依照构成肽氨基酸残基来拟定。

普通从肽氨基端开始，称为某氨基酰某氨基酰…某氨基酸。

肽书写也是从氨基端开始。

肽键象酰胺键同样，由于键内原子处在共振状态而体现出较高稳定性。

在肽键中C－N单键具备约40％双键性质，而C=O双键具备40％单键性质。

这样就产生两个重要成果：

（1）肽键亚氨基在pH0-14范畴内没有明显解离和质子化倾向；

（2）肽键中C－N单键不能自由旋转，使蛋白质能折叠成各种三维构象。

除了蛋白质某些水解可以产生各种简朴多肽以外，自然界中尚有长短不等小肽，它们具备特殊生理功能。

动植物细胞中具有一种三肽，称为谷胱甘肽，即δ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。

因其具有巯基，故常以GSH来表达。

它在体内氧化还原过程中起重要作用。

脑啡肽是天然止痛剂。

肌肉中鹅肌肽是一种二肽，即β-丙氨酰组氨酸。

肌肽可作为肌肉中缓冲剂，缓冲肌肉产生乳酸对pH影响。

一种抗菌素叫做短杆菌酪肽，由12种氨基酸构成，其中有几种是D-氨基酸。

这些天然肽中非蛋白质氨基酸可以使其免遭蛋白酶水解。

许多激素也是多肽，如催产素、加压素、舒缓激肽等。

二、肽理化性质

小肽理化性质与氨基酸类似。

许多小肽已经结晶。

晶体熔点很高，阐明是离子晶体，在水溶液中以偶极离子存在。

肽键亚氨基不解离，因此肽酸碱性取决于肽末端氨基、羧基和侧链上基团。

在长肽或蛋白质中，可解离基团重要是侧链上。

肽中末端羧基pK’比自由氨基酸稍大，而末端氨基pK’则稍小。

侧链基团变化不大。

肽滴定曲线和氨基酸很相似。

肽等电点也可以依照它pK’值拟定。

普通小肽旋亮度等于各个氨基酸旋亮度总和，但较大肽或蛋白质旋亮度不等于其构成氨基酸旋亮度简朴加和。

肽化学性质和氨基酸同样，但有某些特殊反映，如双缩脲反映。

普通具有两个或两个以上肽键化合物都能与CuSO4碱性溶液发生双缩脲反映而生成紫红色或蓝紫色复合物。

运用这个反映可以测定蛋白质含量。

三、一级构造测定

（一）一级构造

蛋白质一级构造是指肽链氨基酸构成及其排列顺序。

氨基酸序列是蛋白质分子构造基本，它决定蛋白质高档构造。

一级构造可用氨基酸三字母符号或单字母符号表达，从N-末端向C-末端书写。

采用三字母符号时，氨基酸之间用连字符（－）隔开。

（二）测定环节

测定蛋白质一级构造，规定样品必要是均一（纯度不不大于97％）并且是已知分子量蛋白质。

普通测定环节是：

1.通过末端分析拟定蛋白质分子由几条肽链构成。

2.将每条肽链分开，并分离提纯。

3.肽链一某些样品进行完全水解，测定其氨基酸构成和比例。

4.肽链另一某些样品进行N末端和C末端鉴定。

5.拆开肽链内部二硫键。

6.肽链用酶促或化学某些水解办法降解成一套大小不等肽段，并将各个肽段分离出来。

7.测定每个肽段氨基酸顺序。

8.从第二步得到肽链样品再用另一种某些水解办法水解成另一套肽段，其断裂点与第五步不同。

分离肽段并测序。

比较两套肽段氨基酸顺序，依照其重叠某些拼凑出整个肽链氨基酸顺序。

9.测定本来多肽链中二硫键和酰胺基位置。

（三）惯用办法

1.末端分析

（1）N末端

蛋白质末端氨基与2,4-二硝基氟苯（DNFB）在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯基蛋白质（DNP-蛋白质）。

产物黄色，可经受酸性100℃高温。

水解时，肽链断开，但DNP基并不脱落。

DNP-氨基酸能溶于有机溶剂（如乙醚）中，这样可与其她氨基酸和ε-DNP赖氨酸分开。

再经双向滤纸层析或柱层析，可以鉴定黄色DNP氨基酸。

丹磺酰氯法是更敏捷办法。

蛋白质末端氨基与5-（二甲胺基）萘-1-磺酰氯（DNS-Cl）反映，生成DNS-蛋白质。

DNS-氨基酸有强荧光，激发波长在360nm左右，比DNFB法敏捷100倍。

当前应用最广泛是异硫氰酸苯酯（PITC）法。

末端氨基与PITC在弱碱性条件下形成相应苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中与酸作用发生环化，生成相应苯乙内酰硫脲衍生物而从肽链上掉下来。

产物可用气-液色谱法进行鉴定。

这个办法最大长处是剩余肽链仍是完整，可依照此法重复测定新生N末端氨基酸。

当前已有全自动氨基酸顺序分析仪，可测定含20个以上氨基酸肽段氨基酸顺序。

缺陷是不如丹磺酰氯敏捷，可与之结合使用。

N末端氨基酸也可用酶学办法即氨肽酶法测定。

（2）C末端

a）C末端氨基酸可用硼氢化锂还原生成相应α氨基醇。

肽链水解后，再用层析法鉴定。

有断裂干扰。

b）另一种办法是肼解法。

多肽与肼在无水条件下加热，可以断裂所有肽键，除C末端氨基酸外，其她氨基酸都转变为相应酰肼化合物。

肼解下来C末端氨基酸可用纸层析鉴定。

精氨酸会变成鸟氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。

c）也可用羧肽酶法鉴定。

将蛋白质在pH8.0,30℃与羧肽酶一起保温，按一定期间间隔取样，用纸层析测定释放出来氨基酸，依照氨基酸量与时间关系，就可以懂得C末端氨基酸排列顺序。

羧肽酶A水解除精氨酸、赖氨酸和脯氨酸外所有肽键，羧肽酶B水解精氨酸和赖氨酸。

2.二硫键拆开和肽链分离

普通状况下，蛋白质分子中肽链数目应等于N末端氨基酸残基数目，可依照末端分析来拟定一种蛋白质由几条肽链构成。

必要设法把这些肽链分离开来，然后测定每条肽链氨基酸顺序。

如果这些肽链之间不是共价交联，可用酸、碱、高浓度盐或其她变性剂解决蛋白质，把肽链分开。

如果肽链之间以二硫键交联，或肽链中具有链内二硫键，则必要用氧化或还原办法将二硫键拆开。

最普遍办法是用过量巯基乙醇解决，然后用碘乙酸保护生成半胱氨酸巯基，防止重新氧化。

二硫键拆开后形成个别肽链，可用纸层析、离子互换柱层析、电泳等办法进行分离。

3.肽链完全水解和氨基酸构成测定。

在测定氨基酸顺序之前，需要懂得多肽链氨基酸构成和比例。

普通用酸水解，得到氨基酸混合物，再分离测定氨基酸。

当前用氨基酸自动分析仪，2－4小时即可完毕。

蛋白质氨基酸构成，普通用每分子蛋白质中所含氨基酸分子数表达。

不同种类蛋白质，其氨基酸构成相差很大。

4.肽链某些水解和肽段分离

当肽链氨基酸构成及N末端和C末端已知后，随后环节是肽链某些水解。

这是测序工作核心环节。

这一步通惯用专一性很强蛋白酶来完毕。

最惯用是胰蛋白酶（trypsin），它专门水解赖氨酸和精氨酸羧基形成肽键，因此生成肽段之一C末端是赖氨酸或精氨酸。

用丫丙啶解决，可增长酶切位点（半胱氨酸）；用马来酸酐（顺丁烯二酸酐）保护赖氨酸侧链氨基，或用1,2-环己二酮修饰精氨酸胍基，可减少酶切位点。

经常使用尚有糜蛋白酶，水解苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等疏水残基羧基形成肽键。

其她疏水残基反映较慢。

用溴化氰解决，可断裂甲硫氨酸羧基形成肽键。

水解后甲硫氨酸残基转变为C末端高丝氨酸残基。

以上三种办法经常使用。

胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶。

前者水解疏水残基之间肽键，后者水解疏水残基氨基形成肽键。

金葡菌蛋白酶，又称谷氨酸蛋白酶或V8蛋白酶，水解谷氨酸和天冬氨酸羧基形成肽键，但受缓冲液影响。

在醋酸缓冲液中只水解谷氨酸，在磷酸缓冲液中还可水解天冬氨酸。

梭状芽孢杆菌蛋白酶，水解精氨酸羧基形成肽键，又称精氨酸蛋白酶。

耐变性剂，可经受6M尿素2小时。

可用于水解不易溶解蛋白。

凝血酶，水解Arg-Gly肽键。

羟胺可水解Asn-Gly，但Asn-Leu和Asn-Ala也能某些裂解。

以上办法中，酶不能水解脯氨酸参加形成肽键。

多肽某些水解后，降解成长短不一小肽段，可用层析或电泳加以分离提纯。

经惯用双向层析或电泳分离，再用茚三酮显色，所得图谱称为肽指纹谱。

5.多肽链中氨基酸顺序测定

从多肽链中某些水解得到肽段可用化学法或酶法测序，然后比较用不同办法获得两套肽段氨基酸顺序，依照它们彼此重叠某些，拟定每个肽段恰当位置，拼凑出整个多肽链氨基酸顺序。

6.二硫键位置拟定

普通用蛋白酶水解带有二硫键蛋白质，从某些水解产物中分离出含二硫键肽段，再拆开二硫键，将两个肽段分别测序，再与整个多肽链比较，即可拟定二硫键位置。

惯用胃蛋白酶，因其专一性低，生成肽段小，容易分离和鉴定，并且可在酸性条件下作用（pH2），此时二硫键稳定。

肽段分离可用对角线电泳，将混合物点到滤纸中央，在pH6.5进行第一次电泳，然后用过甲酸蒸汽断裂二硫键，使含二硫键肽段变成一对含半胱氨磺酸肽段。

将滤纸旋转90度后在相似条件下进行第二次电泳，多数肽段迁移率不变，处在对角线上，而含半胱氨磺酸肽段因负电荷增长而偏离对角线。

用茚三酮显色，分离，测序，与多肽链比较，即可拟定二硫键位置。

四、多肽合成

多肽人工合成有两种类型，一种是由不同氨基酸按照一定顺序排列控制合成，另一种是由一种或两种氨基酸聚合或共聚合。

控制合成一种困难是进行接肽反映所需试剂，