单克隆抗体的制备方.docx

单克隆抗体的制备方.docx

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单克隆抗体的制备方

一、单克隆抗体的概念和原理

免疫反应是人类对疾病具有抵抗力的重要因素。

当动物体受抗原刺激后可产生抗体。

抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇，各种抗原分子具有很多抗原决定簇，因此，免疫动物所产生的抗体实为多种抗体的混合物。

用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限，且动物抗体注入人体可产生严重的过敏反应。

此外，要把这些不同的抗体分开也极困难。

近年，单克隆抗体技术的出现，是免疫学领域的重大突破。

（1）单克隆抗体的基本概念抗体主要由B淋巴细胞合成。

每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。

动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。

当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。

被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。

如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。

单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。

（2）单克隆抗体技术的基本原理要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。

而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。

这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。

其制备原理示意如下：

二、基本方法

1.抗原提纯与动物免疫

对抗原的要求是纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。

如为细胞抗原，可取1×107个细胞作腹腔免疫。

可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。

选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8～12周，雌雄不限。

为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。

免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得高效价抗体为最终目的。

免疫间隔一般2～3周。

一般被免疫动物的血清抗体效价越高，融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大，而且单克隆抗体的质量（如抗体的浓度和亲和力）也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。

末次免疫后3～4天，分离脾细胞融合。

2.骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备

选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。

如待融合的是脾细胞，各种骨髓瘤细胞株均可应用，但应用最多的是SP2/0细胞株。

该细胞株生长及融合效率均佳，此外，该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。

细胞的最高生长刻度为9×105/ml，倍增时间通常为10～15h。

融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应大于95％）。

骨髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养，在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2×105/ml，次日一般即为对数生长期细胞。

在体外培养条件下，细胞的生长依赖适当的细胞密度，因而，在培养融合细胞或细胞克隆化培养时，还需加入其他饲养细胞（feedercell）。

常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞，制备方法为用冷冻果糖液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞，其中在巨噬细胞和其他细胞。

亦有用小鼠的脾细胞、大鼠或豚鼠的腹腔细胞作为饲养细胞的。

在制备饲养细胞时，切忌针头刺破动物的消化器官，否则所获细胞会有严重污染。

饲养细胞调至1×105/ml，提前一天或当天置板孔中培养。

3.细胞融合

细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。

其后用培养液稀释PEG，消除PEG的作用。

将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。

融合过程中有几个问题应特别注意。

①细胞比例：

骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1:

2到1:

10不等，常用1:

4的比例。

应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。

②反应时间：

在两种细胞的混合细胞悬液中，第1min滴加4.5ml培养液；间隔2min滴加5ml培养液，尔后加培养液50ml。

③培养液的成分：

对融合细胞，良好的培养液尤其重要，其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。

如融合效率降低，应随时核查培养基情况。

4.有限稀释法

筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株，所以只有融合的细胞才能待续存活一周以上。

融合细胞呈克隆生长，经有限稀释后（一般稀释至0.8个细胞/孔），按Poisson法计算，应有36％的孔为1个细胞/孔。

细胞培养至覆盖0％～20％孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。

首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，尔后进行抗原特异的ELISA测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。

5.单克隆抗体的制备和冻存

筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染色体丢失和细胞死亡的机率增加。

抗体制备有两种方法。

一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。

该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。

最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。

选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。

通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。

该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。

此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。

接种细胞的数量应适当，一般为5×105/鼠，可根据腹水生长情况适当增减。

选出的阳性细胞株应及早冻存。

冻存的温度越低越好，冻存于液氮的细胞株活性仅有轻微的降低，而冻存在－70℃冰箱则活性改变较快。

细胞不同于菌种，冻存过程中需格外小心。

二甲基亚砜（DMSO）是普遍应用的冻存保护剂。

冻存细胞复苏后的活性多在50％～95％之间。

如果低于50％，则说明冻存复苏过程有问题。

6.单克隆抗体的纯化

单克隆抗体的纯化方法同多克隆抗体的纯化，腹水特异性抗体的浓度较抗血清中的多克隆抗体高，纯化效果好。

按所要求的纯度不同采用相应的纯化方法。

一般采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化目的，也有采用较简单的酸沉淀方法。

目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和纯化法，多用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体（最常用Sepharose）交联，制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱，回收率可达90％以上。

蛋白可与IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3结合，同时还结合少量的IgM。

洗脱液中的抗体浓度可用紫外光吸收法粗测，小鼠IgG单克隆抗体溶液在A280nm时，1.44（吸光单位）相当于1mg/ml。

经低pH洗脱后在收集管内预置中和液或速加中和液对保持纯化抗体的活性至关重要。

三、操作流程

（一）脾细胞

1．材料

（1）免疫过的血清抗体滴度高的BALB/c小鼠。

（2）1640培养液

（3）2.5％FCS－1640营养液

2．操作方法

（1）拉颈或用CO2处死小白鼠。

（2）将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。

（3）把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。

（4）用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。

（5）直立小试管3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。

以2.5％FCS—1640充满离心管，并以400g离心7min～10min（与此同时应开始制备骨髓瘤细胞）。

（7）把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。

重复⑹、⑺步骤。

（9）计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。

（二）骨髓瘤细胞

骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。

选择骨髓瘤细胞的条件：

1该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；

2骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外；

3骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml；

4生长速度快，繁殖时间短。

目前常用的BALB/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：

①S194/5XXO·BU·1；②SP2／0—Ag14（简称SP20）；③P2—X？

—Ag8·6·5·3（简称653）；④FO

以653最为常用，它是由矿物油4－甲基－15烷（Pristane，降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（MinerolOilplasmacytoma，MOPC）并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。

骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，试验时复苏、增殖、传代即可。

由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要胰酶处理。

为了防止出现返祖现象，在融合前，可将培养基内加入15μg/ml8－氮鸟嘌呤。

取约1×107～6×107对数生长期（即培养15h～20h）的骨髓瘤细胞，在室温离心（400g）10min，沉淀以2.5％FCS—1640液再悬浮并计数。

（三）饲养细胞

在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feedercell）。

在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。

许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。

应用腹腔渗出细胞的好处是：

一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。

腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。

也可以是其他种类的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。

1．材料

（1）小鼠（BALB/c或C57小白鼠）若干只。

（2）11.6％蔗糖溶液（经10磅30min高压灭菌）。

2．操作方法

（1）拉颈处死小鼠。

（2）70％酒精浸泡消毒10min。

（3）用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。

（4）用注射器将4ml11.6％蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。

（5）1000r／min离心10min。

（6）取上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液。

台盼蓝染色计数活细胞，使每毫升含40万个活细胞。

（7）以1ml吸管将细胞种入微量培养皿，每孔0.05ml，含2万个细胞，放入CO2培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。

如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。

（四）融合细胞

1.融合剂

细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法，如仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。

聚乙二醇（PEG），在分子量为200～700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起作用。

用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4000者，常用浓度为50％，pH8.0～pH8.2（用10％NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。

50％浓度，pH偏碱时融合效应最高。

也有采用30%～50％浓度的PEG加上10％二甲亚砜。

不同批号的PEG，即使分子量相同，但融合率却有明显差异，选用时必须注意。

每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。

要买高纯度的，一般选供气相色谱用的PEG。

2.融合过程

融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。

融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:

1至10:

1不等。

3:

1或5:

1最为常用。

1>．试剂与材料

（1）供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。

（2）1640培养液100ml。

（3）完全1640液100ml。

（4）2.5％FCS－1640液50ml。

（5）HAT培养液100ml。

50％PEG：

取分子量4000，高纯度的（日本进口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前用预热于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚红检查pH，一般不必调pH。

如pH有改变，可用HCl或NaHCO3调整。

（7）10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。

40孔塑料培养盘。

2>．操作方法

⑴准备好脾细胞。

⑵在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml2.5％FCS－1640液。

⑶室温400g离心3min，使细胞沉淀。

⑷移去上清液。

⑸轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于40℃水浴中，使其达融合温度。

⑹加预热至40℃的50％PEG0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求持续2min。

⑺加1ml1640液，边加边摇动，持续1min。

⑻重复⑺一次。

⑼加1ml1640液，边加边摇动，持续0.5min。

⑽重复⑼一次。

⑾加1640液15ml。

⑿室温，400g离心1min，使细胞沉淀。

⒀去上清，轻敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。

⒁往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液，每孔1滴（约0.05ml）。

⒂轻摇后，放入5％CO2饱和湿度的37℃温箱中培育。

⒃第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。

注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加入适量的饲养细胞。

⒄于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。

在每次换液前用倒置显微镜观察，大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。

大多数杂交瘤细胞在10~20天内出现，但也有在1个月左右才能出现的。

杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查抗体。

⒅对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。

在传代过程中，依情况取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS－1640液。

同时保存于液氮和进行克隆化，在这期间每代都要检查抗体，以防止产生抗体细胞的变异和丢失。

3.细胞融合的关键

1>．技术上的误差常常导致融合的失败。

例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。

这必然要失败的。

2>．融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。

四、杂交瘤细胞的保存

（一）保存

当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。

另外在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭。

所以必须冷藏保存一部分。

保存方法如下：

1．材料

（1）细胞：

取对数生长期的细胞。

（2）10％二甲基亚砜保护液（二甲基亚砜能损坏滤器，而又被高压所破坏，所以不能过滤或高压消毒。

其本身就是毒品，无菌）：

含10％二甲基亚砜、20％灭活胎牛血清，70％RPMI—1640液。

（3）20％FCS—1640培养液：

含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml。

（4）灭菌的2ml安瓶等

2．操作方法

（1）去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入10％FCS—1640液，使细胞悬浮。

（2）1000r/min离心10min，去上清。

细胞沉淀用10％二甲基亚砜保护液制成悬液，使成1.0×107细胞／ml。

（3）取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95％以上。

（4）用注射器将细胞分装安瓶，每瓶0.5ml～1.0ml，熔封安瓶。

（5）放4℃2h。

放液氮罐气态部分（-70℃）15h。

（7）转入液氮部分。

（二）复苏

1．从液氮罐中取出安瓶立即放37℃水浴中速溶。

2．无菌操作打开安瓶，取出细胞悬液，转入组织培养瓶。

3．逐滴缓慢加入20％FCS－1640培养液3.5ml，这个过程延续3min。

4．5％CO2饱和湿度，37℃培养。

5．4h后弃去培养液上清，加入新鲜的20％FCS－1640培养液。

6．继续培养，换液，以至形成单层。

动物的选择与免疫

1．动物的选择　纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。

目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALB/C小鼠。

2．免疫方案　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。

一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。

常用佐剂：

福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。

初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）

↓3周后

第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）

↓3周后

第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）

↓2～3周

加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）

↓3天后

取脾融合

　　目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：

①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。

②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。

③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。

（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。

以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。

初次免疫1×107/0.5mlip

↓2～3周后

第二次免疫1×107/0.5mlip

↓3周后

加强免疫（融合前三天）1×107/0.5mlip或iv

↓

取脾融合

细胞融合

1．细胞融合前准备

（1）骨髓瘤细胞系的选择：

骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。

常用的骨髓瘤细胞系见表2-4。

表2-4用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系

名称

来源

耐受药物

Ig链

HL

P3/X63-Ag8（X63）

BALB/C骨髓瘤MOPC-21

8-氮鸟嘌呤

r1　K

P3/X63-Ag8.653（X63-Ag8.653）

P3/X63-Ag8

8-氮鸟嘌呤

－－

P3/NSI-1-Ag4-1（NS-1）

P3/X63-Ag8

8-氮鸟嘌呤

－K（不分泌型）

P3/X63-Ag8.Ul（P3Ul）

（X63×BALB/C脾细胞）杂交瘤

8-氮鸟嘌呤

－－

SP2/0-Ag14（SP2/0）

（X63×BALB/C脾细胞）杂交瘤

8-氮鸟嘌呤

－－

F0

BALB/C骨髓瘤

8-氮鸟嘌呤

－－

S194/5.XXO.BU.1

P3/X63-Ag8

5-溴脱氧尿嘧啶核苷

－－

MPC11-45.6TG1.7

BALB/C骨髓瘤MPC-11

6-巯鸟嘌呤

r2b　K

210.RCY3.Ag1.2.3

LOU大鼠骨髓瘤R210

8-氮鸟嘌呤

－　K

GM15006TG-A12

人骨髓瘤GM1500

6-巯鸟嘌呤

r1　K

U-266AR

人骨髓瘤U-266

8-氮鸟嘌呤

ε　　λ

　　骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。

小牛血清的浓度一般在10%～20%，细胞浓度以104～5×105/ml为宜，最大浓度不得超过106/ml。

当细胞处于对数生长的中期时，可按1：

3～1：

10的比例传代。

每3～5天传代一次。

细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。

（2）饲养细胞：

在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。

在制备McAb的过程中，许多环节需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。

常用的饲养细胞有：

小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。

也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。

饲养细胞的量为一般为2×104或105细胞/孔。

2．细胞融合的步骤

（1）制备饲养细胞层：

一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。

与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周

↓

拉颈处死，浸泡在75%酒精内，3～5min

↓

用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

↓

用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液（严禁刺破肠管）

↓

反复冲洗，吸出冲洗液

↓

冲洗液放入10ml离心管，1200rpm/分离5～6min

↓

用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数至1×105/ml

↓

加入96孔板，100μl/孔

↓

放入37℃CO2孵箱培养

（2）制备免疫脾细胞

最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死

↓

无菌取脾脏，培养液洗一次

↓

脾脏研碎，过不锈钢筛网

↓

离心，细胞用培养液洗2次

↓

计数

↓

取108脾淋巴细胞悬液备用

（3）制备骨髓瘤细胞

取对数生长骨髓瘤细胞离心

↓

用无血清培养液洗2次

↓

计数，取得1×107细胞备用

（4）融合

　　①将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：

10或1：

5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm,8min;弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG）浓度。

轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。

　　②90s内加入37℃预温的1ml45%PEG（分子量4000）溶液，边加边轻微摇动。

37℃水浴作用90s。

　　③加37。

C预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

　　④离心，800rpm,6min。

　　⑤充上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。

　　⑥将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。

一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。

　　⑦将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。

选择杂交瘤细胞及抗体检测

1．HAT选择杂交瘤细胞　　

脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。

在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。

　　在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。

在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。

在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。

2．抗体的检测　　

检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。

　　常用的方法有：

（1）放射免疫测定（RIA）可用于