白色链霉菌PL菌株产聚赖氨酸发酵条件研究报告Word格式.docx
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7H2O0.003g·
L-1、ZnSO4·
7H2O0.008g·
L-1。
在优化培养基下，ε-PL摇瓶产量达到4.05g·
L-1，比优化前提高了25%。
采用D152弱酸性阳离子交换树脂（H型>
对发酵法生产的ε-聚赖氨酸进行了分离提取。
参考文献设计了合理的工艺流程。
离心分离发酵（pH3.2>
，调节滤液的pH值到8.5，过滤除去沉淀。
滤液通过D152离子交换柱（H型>
，用水和0.2N醋酸洗涤，用0.1N的盐酸洗脱。
用1N的NaOH调节洗脱液的pH值到6.5，加入活性炭脱色后浓缩到小体积。
加入乙醇和乙醚的混合物（体积比2:
1>
后，析出白色晶体。
关键词：
ε-聚赖氨酸白色链霉菌发酵条件提取离子交换
TitleThestudyonfermentconditionofStreptomyces
albulusPL3-6producedε-PL
Abstract
ε-Poly-L-Lysineiscomprisedoflysinelinkedbyamidebondthroughmicrobialfermentation.IthasexcellentantibacterialactivityagainstGram-positiveandGram-negativebacteria,yeastandsomekindsofviruses.Inadditionalε-Poly-L-Lysineissolubleandattractiveheatstable.ThefermentationmediumofStreptomycesalbulusproducingε-poly-L-Lysinewasoptimizedbyorthogonalexperiments.Theoptimalmediumconsistedof3.0g·
L-1glucose,0.5g·
L-1yeastextract,1.2g·
L-1（NH4>
2SO4，0.20g·
L-1KH2PO4,0.12g·
L-1K2HPO4,0.05g·
L-1MgSO4·
7H2O,0.003g·
L-1FeSO4·
7H2Oand0.008g·
L-1ZnSO4·
7H2O.Theyieldofε-PLreached4.05g·
L-1withoptimalmedium,whichincreased25%comparedtoinitialmedium.
Theseparationandextractionofε-Poly-L-Lysinefromfermentationliquidbyusingweakacidanion-exchangeresinD152.Theculturebroth（pH3.2>
wasfilteredandthefiltratewasadjustedtopH8.5.Then,theprecipitateformedwasremovedbyfiltration.Thefiltratewasappliedonacolumnofweakacidanion-exchangeresinD152（H+-from>
andwashedwith0.2Naceticacidandwater,successively.Thesubstancewaselutedwith0.1Nhydrochloricacid.Theeluatewasneutralizedwith1Nsodiumhydroxideanddecolorizedwithactivecharcoal,andthenevaporatedtoasmallvolume.Thesubstancewasprecipitatedasawhitepowderbyadditionofanethanolandether（2:
mixture.
Keywords:
ε-Poly-L-Lysine。
Streptomycesalbulus。
fermentcondition。
extractionionexchangeresins
目次
1引言………………………………………………………………………………1
1.1ε-聚赖氨酸…………………………………………………………………………………1
1.2物理和化学性质……………………………………………………………………………1
1.3聚赖氨酸的发酵生产………………………………………………………………………2
1.4研究价值……………………………………………………………………………………3
2材料与方法……………………………………………………………………………………5
2.1材料…………………………………………………………………………………………5
2.1.1菌种………………………………………………………………………………………5
2.1.2试剂………………………………………………………………………………………6
2.1.3相关溶液及其配制………………………………………………………………………6
2.1.4实验仪器…………………………………………………………………………………7
2.2方法……………………………………………………………………………………………7
2.2.1菌种的分离与纯化………………………………………………………………………7
2.2.2培养方法…………………………………………………………………………………8
2.2.3分析方法…………………………………………………………………………………8
2.2.4提取方法…………………………………………………………………………………9
2.2.5验证方法…………………………………………………………………………………9
3结果与讨论……………………………………………………………………………………10
3.1ε-PL标准曲线的绘制………………………………………………………………………10
3.2碳氮源优化实验……………………………………………………………………………10
3.3无机盐优化实验…………………………………………………………………………12
3.4ε-PL的提取…………………………………………………………………………………14
3.4.1发酵液的预处理…………………………………………………………………………14
3.4.2离子交换树脂的预处理…………………………………………………………………15
3.4.3离子交换提取……………………………………………………………………………16
3.4.4发酵液的紫外吸收波长的测定…………………………………………………………16
3.4.5ε-聚赖氨酸组成定性分析………………………………………………………………17
结论……………………………………………………………………………………18
致谢……………………………………………………………………………………19
参考文献……………………………………………………………………………20
1引言
随着人们生活水平的提高和健康意识的加强，对食品品质提出了更高的要求，除了食品的营养、感官和外观包装外，食品的食用安全性更为人们所关注。
由于食品的特殊性，对其防腐保鲜一直是食品研究中的重要方面。
长期以来，由于受到经济环境和开发水平的制约，几乎所有的食品都采用化学合成防腐剂来延长食品的保质期。
化学防腐剂如果超剂量使用会产生累积毒素和致癌作用，存在局限性。
因此，安全、广谱、高效及经济实用的天然食品防腐剂的开发和生产成为食品防腐领域发展的趋势和要求。
微生物食品防腐剂是天然防腐剂中的一大类，其是指通过微生物发酵的方法，从发酵液中提取分离得到有抑菌作用的物质，主要为多肤类物质。
目前，国际上批准使用的微生物食品防腐剂仅有乳酸链球菌素（Nisin>
和纳他霉素（Natamycin>
。
我国分别于1990年和1996年批准上述两种微生物防腐剂用于食品防腐保鲜。
另外，ε-聚赖氨酸也是一种抑菌效果明显的微生物食品防腐剂，其在日本应用广泛，在我国的研究才刚刚起步。
由于这三种微生物防腐剂安全无毒、抑菌作用强，因此具有广阔的应用前景。
1．1ε-聚赖氨酸
1977年日本学者S.shima和H.sakai[1]从放线菌培养过滤液中提取出一种含有25～30个赖氨酸残基的同型单体聚合物。
这种赖氨酸聚合物是赖氨酸残基通过α-梭基和ε-氨基形成的酞胺键连接而成，故称为ε-多聚赖氨酸（ε-PL>
实际上多聚赖氨酸的合成是早在1947年由K.L.Eprain首先完成的[2]但是化学法合成的聚赖氨酸为α型，其赖氨酸残基之间的酞胺键是由α-氨基和α-梭基缩合而成，研究也证明了α-PL比ε-聚赖氨酸抑菌活性差且有毒性，因此目前在国际市场上。
ε-聚赖氨酸作为食品防腐剂已经取代了α-多聚赖氨酸[3]。
1．2物理和化学性质
ε-聚赖氨酸是一种含有25～30个赖氨酸残基的同型单体聚合物多肽。
赖氨酸残基通过α-羧基和ε-氨基形成的酰胺键连接[4]。
具有高抑菌活性ε-聚赖氨酸的分子量在3600～4300之间，当分子量低于1300时，ε-聚赖氨酸失去抑菌活性。
红外光谱分析表明:
ε-聚赖氨酸在1680～1640cm-1和1580～1520cm-1有强吸收峰[5]。
H-[NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH-CO]n-OH
ε-聚赖氨酸结构式NH2
ε-聚赖氨酸带正电荷，可以和阴离子物质发生结合；
没有固定的熔点，250℃以上开始软化分解；
易溶于水、乙醇，但不溶于乙酸乙醋、乙醚等有机溶剂；
能够承受一般食品加工过程中的热处理，热稳定性高，120℃加热10min仍具有抑菌活性[17]，可以随原料一同进行灭菌处理，防止二次污染；
ε-聚赖氨酸经6NHCl酸解24h后，测其赖氨酸的旋光度为＋23.8°
，表明每个残基上携带1molHCl和水[6]。
ε-PL抑菌的最适pH5～8，也就是说其在中性和微酸性环境中有较强的抑菌性，而在酸性和碱性条件下，抑菌效果不太理想。
可能由于聚赖氨酸作为赖氨酸的聚合物，在酸性和碱性条件下易分解[7]。
ε-PL作为一种浓缩胶质溶液的交联剂，它的效力对pH和胶质分布有依赖性。
在胶质中，阳离子电荷与阴离子缩氨酸聚合物的平衡导致了胶体的不透明性和最终导致网络结构的崩溃。
在pH接近中性的时候，L-聚赖氨酸可以作为一种有效的胶质网络交联剂[8]。
1．3聚赖氨酸的发酵生产
最初用野生的S.albulus346进行发酵的研究中，ε-PL在最优化的培养基中的积累浓度是0.5g/L。
在发酵过程中，ε-PL的最大积累浓度开始于pH值6.0。
当细胞生长达到稳定状态，培养基pH值的降低是ε-PL生产的关键（pH值3.0～5.0>
在发酵过程中，在培养基中添加L-赖氨酸对ε-PL的生产没有影响后，Shima等发现给静止的细胞中添加葡萄糖和硫酸铵作为培养基，且在酸性pH值的条件下，ε-PL的积累量可达4～5g/L。
ε-PL在pH值5.0～6.0时产量迅速下降，说明S.albulus中含有ε-PL降解酶。
为了提高ε-PL的生产力，Hiraki等在S.albulus346中筛选出对S-2-氨乙基半胱氨酸和甘氨酸（Glycine>
有抵抗力的变种。
在野生种346中，L-赖氨酸会导致天冬氨酸激酶合成的部分抑制，这种酶是L-赖氨酸生物合成的关键酶，而甘氨酸可以抑制这种酶的活性。
S-2-氨乙基半胱氨酸是L-赖氨酸的类似物，在2mg/mLS-2-氨乙基半胱氨酸存在的情况下，S.albulus346的生长不会被抑制；
进一步增加甘氨酸到1mg/mL会抑制其生长。
在对S-2-氨乙基半胱氨酸和甘氨酸耐受性的菌种中，90%是ε-PL的高产菌。
其中之一（11011A>
在测试管中的最大生产量是2.11mg/mL，是野生种346的10倍。
这个变种有很高的天冬氨酸激酶活性。
在3L摇瓶发酵罐中，以pH控制、葡萄糖和硫酸铵流加补料的方法，S.aLbuLus11011A在120h内靠吸收葡萄糖的收益可达20mg/mL（8.9%>
。
Kahar等论证了利用S.albulus410生产ε-PL中严格控制pH值和葡萄糖浓度的重要性[9]。
在ε-PL发酵生产中，培养基的pH值通常会从最初的6.8降到36h后的4.2，然后96h内逐渐降到3.2。
在pH值低于4.2后，ε-PL开始逐渐在培养基中积累，所以在ε-PL的生产中严格控制pH值是有必要的。
pH值的控制分2个阶段，第1阶段为菌体的生长阶段，pH值大于5.0（培养过程pH值自然下降，当低于5.0时，用氨水调节>
；
第2阶段为产物积累阶段，pH值控制在4.0。
在发酵过程中，发酵液的葡萄糖浓度控制在10g/L，当葡萄糖浓度低于10g/L时，流加碳源和氮源（含有80%葡萄糖和8%硫酸铵的培养基>
，使葡萄糖浓度维持在10g/L（一般在48h后>
，经过4～7d的发酵，ε-PL的产率最高达48.3g/L。
迄今为止ε-聚赖氨酸的微生物发酵在日本已实现工业化，年销售量为1000t。
但在我国还处于实验室阶段，小试和中试采用易操作的分批发酵。
1．4研究价值
随着人们对食品安全性的认识和要求的逐步提高，化学防腐剂受到严峻挑战，食品防霉防腐剂的天然化已成为今后的发展趋势。
天然防霉防腐剂是近年来国内外倡导、开发和寻求的新型产品，开发抗菌性强、安全无毒的天然防霉防腐剂已成为各国科技工作者的研究热点。
它不但对人体健康无害，有的还具有一定的营养价值，是今后开发的方向。
目前，国外食品防腐剂行业已相当成熟，开发出了数十种天然食品防腐剂，建立了完备的法规。
国内对天然食品防腐剂的研究起步较晚，目前尚属初级阶段，为适应市场需求，国内学者也做了大量的工作。
21世纪是"
绿色"
的世纪，是追求食品安全与可持续发展的世纪。
因此，开发绿色食品、有机食品成为提高经济效益，增加市场竞争力，提高人民生活质量的重要举措。
随着人民生活水平的进一步提高，天然食品防腐剂在食品加工保藏过程中将被广泛使用。
生物技术的飞速发展，为开发、应用天然食品防腐剂开辟了一条崭新的途径。
至今ε-PL发酵生产的研究已历经几十年，目前虽然ε-PL发酵生产已在日本实现工业化，ε-PL作为一种天然、无毒、可生物降解的聚氨基酸，不仅在食品工业有广泛的应用，而且其在医药、环保、农业中的应用也将不断拓开。
ε-聚赖氨酸在目前的日本添加剂目录表中属于一种天然添加剂，1989年日本窒素公司首先用生物技术方法工业化生产聚赖氨酸，同年，日本在添加剂目录表中把ε-PL归属于一种天然添加剂，并允许使用。
以后韩国也允许作为食品添加剂使用。
在美国和欧洲，主要是使用山梨酸作为防腐剂，但自2003年7月10日FDA收到日本窒素公司的申请后，目前已正式批准（GRASNoticeNo．GRN000135．>
该公司生产的的ε-PL作为天然食品添加剂。
该公司还将逐步把ε-PL的应用拓展至纤维、化妆品及其他货品，甚至把ε-PL作为抗菌材料用于厨房及浴室用具中。
国内对ε-聚赖氨酸的应用处于研发阶段，有关ε-PL在医药和基因芯片领域的应用研究开展得较多，在食品方面目前尚未列入使用卫生标准。
因此，ε-聚赖氨酸的研究及食品防腐剂的应用具有广阔的前景和发展空间，ε-PL独特的物理化学性质可以应用到除了食品工业以外的其他很多领域，所以将来ε-PL会有巨大的需求。
今后的研究重点是筛选到产聚赖氨酸的菌株，对其进行改造，大幅度提高产量；
并加强基础研究，揭示其抑菌机理，同时加强应用研究。
2材料与方法
2．1材料
2.1.1菌种
白色链霉菌<
Streptomycesalbulus）实验室保藏菌株。
2.1.2试剂
药品名称
生产厂商
无水葡萄糖
中国派尼化学试剂厂·
郑州
（NH4>
2SO4
天津市化学试剂三厂
酵母膏
北京双旋微生物培养基制品厂
蛋白胨
牛肉膏
北京奥博星生物技术责任有限公司
ZnSO4·
7H2O
洛阳市化学试剂厂
FeSO4·
上海第二钢铁厂
MgSO4·
NaH2PO4
Na2HPO4
天津市科密欧化学试剂开发中心
KH2PO4
K2HPO4
甲基橙
天津市化学试剂一厂
盐酸
醋酸
开封化学试剂总厂
乙醇
洛阳吴华化学试剂有限公司
磷酸
开封开化有限公司
NaOH
天津市化学试剂厂
丙酮
甲醛
茚三酮
天津科密欧化学试剂开发中心
ε-聚赖氨酸
SIGMA（固体标准品>
2.1.3相关溶液及其配制[10]
<
1）0.1mol/L磷酸钠缓冲溶液的配置
取62.5mL的0.2mol/L的NaH2PO4溶液和37.5mL的0.2mol/L的Na2HPO4混合即得到0.1mol/L磷酸钠缓冲溶液。
2）1mmol/L甲基橙溶液
称取0.0327g甲基橙定容于100mL磷酸钠缓冲溶液中。
3）1mol/L和0.1mol/L盐酸溶液
1mol/LHCl：
量取90mL的36%-37%浓度的HCl定容于1000mL蒸馏水中。
0.1mol/LHCl：
量取9mL的36%-37%浓度的HCl定容于1000mL蒸馏水中。
4）1N和5N的NaOH溶液
1N的NaOH溶液：
称取40gNaOH固体定容于1000mL蒸馏水中。
5N的NaOH溶液：
称取10gNaOH固体定容于50mL蒸馏水中。
5）0.2N的醋酸溶液
称取质量分数大于99.5%的浓醋酸定容与500mL蒸馏水中。
6）0.1%磷酸溶液
量取质量分数为85%的磷酸定容于1000mL蒸馏水中。
2.1.4实验仪器
仪器名称
723N可见分光光度计
上海申安医疗器械厂
752紫外光栅分光光度计
上海精密科学仪器有限公司
PYX—DHS—40X50—BS—Ⅱ电热恒温培养箱
上海跃进医疗器械厂
GZX—GF—MBS—1<
9053A）电热鼓风干燥箱
LD5-2A型低速离心机
北京医用离心机厂
pHSJ-4A型数字PH计
上海雷磁仪器厂
LDZX—50FB立式高压蒸汽灭菌锅
TGL—16C台式离心机
上海安亭科学仪器厂
FA12048电子天平
上海精密科技有限公司
THZ-30℃恒温培养摇床
上海-恒科学仪器有限公司
超净工作台
苏州净化设备有限公司
SW—CJ—2F型双人双面净化工作台
立式压力蒸汽灭菌器
2.1.5培养基[11]
1）高氏一号培养基
可溶性淀粉2g，K2HPO40.05g，MgSO4•7H2O0.05g，KNO30.1g，NaCL0.05g，FeSO4•7H2O0.001g，琼脂1.5g，水1000mL，PH值7.2
2）牛肉膏蛋白胨培养基
牛肉膏2g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15g，水1000mL
3）贝特纳培养基
葡萄糖1g/L，，蛋白胨0.2g/L，酵母膏0.1g/L，琼脂1.5g/L，pH值7.5
4）种子培养基
葡萄糖5g/L，酵母膏0.5g/L，（NH4>
2SO41g/L，KH2PO40.6g/L，K2HPO40.8g/L，MgSO4•7H2O0.02g/L，FeSO4•7H2O0.02g/L，pH值6.8
（5）发酵培养基
基本组成与种子培养基相同。
在培养基碳氮源的优化实验中，碳氮源含量按照正交实验设计进行，无机盐的含量同种子培养基。
在碳氮源最有条件下进行无机盐优化，在无机盐的优化实验中，碳氮源按正交实验设计最有条件配制。
2．2方法
2.2.1菌种的分离与纯化[11]
1）保藏菌种的活化与稀释涂布
取一环实验室保藏菌株按10-1用无菌水进行
适当的稀释，吸取不同浓度的菌悬0.1mL装有15mL
左右的贝特纳培养基的平板上，30℃倒置培养3～4d。
再挑取菌落较大的进行划线分离。
如图1：
2）抑菌圈法图1聚赖氨酸划线平板
底层铺10mL下层培养基，将培养好的单菌落点接至培养基上，30℃下培养2d，将上层培养基冷却至50℃左右，加入10%敏感菌培养液摇匀，去10mL铺于底层培养基上。
点解菌落间距要足够大，以免抑菌圈互相重叠。
将平板于30℃恒温培养24h，出现边缘清晰的抑菌圈。
3）单菌落分离纯化
挑选抑菌圈较大的菌落转接到贝特纳斜面培养基，
30℃恒温培养7d，待斜面完全被孢子覆盖，冰箱<
4℃）
保存备用。
如图2：
2.2.2培养方法
1）种子培养液的制备图２PL3-6菌株斜面
取1环斜面菌种于装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，于30℃、220r·
min-1菌培养24h得到种子培养液。
如图3、图4：
图３种子培养液图４培养后的种子液
2）发酵培养
以1%的接种量将种子液转接到装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，在30℃，220rmin-1条件下培养72h。
如图5、图6：
图５发酵培养基 图６发酵完成液
2.2.3分析方法
1）发酵液pH的测定
将发酵液4000r/min离心8min，上清液采用pHSJ-4型pH计测定。
（2）ε-PL产量的测定
发酵液中ε-PL产量的测定：
采用Itzhaki方法[12]测定ε-PL产量。
测定前先将从水中重结晶的甲基橙溶于pH值为6.6的0.1mol/L磷酸盐缓冲液配制成浓度为1mmol/L的溶液。
将1.9mL的磷酸盐缓冲液和2.0mL、1mmol/L甲基橙溶液依次加入到0.1mL发酵液上清液中，所得混合物在30℃条件下剧烈震荡，反应30min；
然后4000r/min离心15min，除去产生的ε-PL与甲基橙形成的复合物。
取上清液1mL用磷酸
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