辣椒各组分含量测定Word文档格式.docx

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4,所取糖液浓度在1-2.5mg/100ml之间

（一）菲林试剂

1、试剂

费林试剂：

甲液：

称取15g硫酸铜（CuS045H2O及0.05g亚甲基蓝，溶于蒸馏水中并稀释到1000mL

乙液：

称取50g酒石酸钾钠及75gNaOH溶于蒸馏水中，再加入4g亚铁氰化钾]K4Fe（CN6],完全溶解后，用蒸馏水稀释到1000mL贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。

0.1%葡萄糖标准溶液：

准确称取I.OOOg经98〜100C干燥至恒重的无水葡萄糖，加蒸馏水溶解后移入1000mL容量瓶中，加入5mL浓HCl（防止微生物生长），用蒸馏水稀释到1000mL

6mol/LHCl:

取250mL浓HCl（35%〜38%用蒸馏水稀释到500mL

碘—碘化钾溶液：

称取5g碘，10g碘化钾溶于100mL蒸馏水中。

6mol/LNaOH:

称取120gNaOH溶于500mL蒸馏水中。

0.1%酚酞指示剂。

2、材料辣椒，淀粉

3、器材

试管3.0x20cm（x1）；

移液管5mL（x2）;

烧杯100mL（x1）；

250mL

锥形瓶；

调温电炉；

滴

定管25mL（x1）。

（2）样品中还原糖的提取

准确称取1g辣椒粉，放在100mL烧杯中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加入约40mL蒸馏水，混匀，于50C恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出混。

过滤，将滤液全部收集在50mL的容量瓶中，

用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。

（3）样品中总糖的水解及提取

准确称取1g淀粉，放在大试管中，加入6mol/LHCI10mL，蒸馏水15mL,在沸水浴中加热0.5h，取出1〜2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。

如已水解完全，则不呈现蓝色。

水解毕。

冷却

至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6mol/LNaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100mL,过滤取滤液10mL于100mL容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。

（4）空白滴定

准确吸取费林试剂甲液和乙液各5.00mL,置于250mL锥形瓶中，加蒸馏水10mL从滴定管滴加约9mL葡萄糖标准溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2s1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶

液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。

记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。

平行操作3次，取其平均值，按下式计算：

式中：

F――10mL费林试剂（甲液和乙液各5.00mL）相当于葡萄糖的

量，mg

C葡萄糖标准溶液的浓度，mg/mL

V―—标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL。

（五）样品糖的定量测定

（1）样品溶液预测定：

吸取费林试剂甲液及乙液各5.00mL,置于250mL锥形瓶中，加蒸馏水10mL加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品溶液，滴定时要保持溶液呈沸腾状态。

待溶液由蓝色变浅时，以每2s1滴的速度滴定，直至溶液的蓝色刚好褪去为终点。

记录样品溶液消耗的体积。

⑵样品溶液测定：

吸取费林试剂甲液及乙液各5.00mL,置于锥形瓶中，加蒸馏水10mL,加玻璃珠3粒，从滴定管中加入比与测试样品溶液消耗的总体积少1mL的样品溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2s1滴的速度继续滴加样液，直至蓝色刚好褪去为终点。

记录消耗样品溶液的总体积。

平行操作3次，取其平均值。

（六）结果处理

其中：

m样品重量，g;

V―—标定时平均消耗还原糖或总糖样品溶液的总体积，mL

V1——还原糖或总糖样品溶液的总体积，mL；

1000mg换算成g的系数。

注意事项

（1）费林试剂甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾

钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂

有效浓度降低。

（2）滴定必须是在沸腾条件下进行，其原因一是加快还原糖与Cu2+的反应速度；

二是亚甲基蓝的变色反应是可逆的，还原型的亚甲基蓝遇空气中的氧时会再被氧化为氧化型。

此外，氧化亚铜也极不稳定，易被空气中的氧所氧化。

保持反应液沸腾可防止空气进入，避免亚甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加消耗量。

（3）滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。

二、维生素C的含量-----钼蓝比色分光光度法，

原理：

因为磷钼酸铵经还原剂维生素C还原后，可以生成亮蓝色的络合物，通过分光比色可以测定青椒中还原维生素C[6]。

本法快速、准确、灵敏度高。

仪器与实验材料

紫外-可见分光光度计（UV-1600,日本岛津）；

6%的钼酸铵溶液：

准确称取钼酸铵30.0000g,加适量蒸馏水溶解后定容至500mL;

草酸-EDTA溶液：

准确称取含结晶水的草酸6.5000g,EDTA0.0600g,充分溶解定容至1000mL;

偏磷酸-醋酸溶液：

溶解20g片状偏磷酸于40mL醋酸中，稀释至500mL,用滤纸过滤，取滤液备用；

标准Vc溶液：

准确称取Vc0.0500g;

用上述配好的草酸-EDTA溶液定容于100mL的容量瓶中，使标准液浓度达到0.5mg?

mL;

6%的硫酸溶液。

准确称取一定量的市售青椒，加入草酸-EDTA溶液，用搅碎机捣碎后移入250mL容量瓶中，定容，过滤，滤液即为待测样品的提取液。

吸取上述青椒的提取液1mL于25mL的容量瓶中，加入9.00mL草酸-EDTA溶液1.00mL偏磷酸-醋酸溶液和3.00mL的硫酸，最后再加入3.00mL钼酸铵,显色。

三、测微量元素Fe、Cuzn、MgNaCa、Mn----吸光光度法试剂：

HN03HC104蒸馏水，均为分析纯。

仪器：

TAS—986型原

子吸收分光光度计，DT一100型光电天平，DOB2000型恒温烤箱.

1样品处理将青辣椒、红辣椒自然晾干、粉碎。

放人恒温箱80C恒温干燥至恒重，精确称取0.500g样品置于50mL带塞锥形瓶中，加入

混合液（HN03）+V（HC104）=2+110m盖上塞子，放人70~C的恒温烤箱

内进行消化8h，然后去塞，并按下列程序控温消化赶酸：

100C30min,

120C30min,150C120min。

消化赶酸完成时，溶液为淡黄色清亮液体，稍冷即为无色，冷却后，用20%的稀硝酸定容至50mL的容量瓶中，待测。

同时作试剂空白对照。

2测定方法原子吸收分光光度法测定青辣椒、红辣椒中Fe、Cuzn、

MgNa、Ca、Mn的含量。

采用计算机程序控制，以非线性校正方式测定。

四、考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量

（1）原理：

考马斯亮蓝G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）

测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。

其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；

其结合物在室温下1h内保持稳定。

该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0〜1000卩g/mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

（2）材料、主要仪器和试剂

1.实验材料

新鲜辣椒

2.主要仪器

（1）分析天平、台式天平

（2）刻度吸管

（3）具塞试管、试管架

（4）研钵

（5）离心机、离心管

（6）烧杯、量筒

（7）微量取样器

（8）分光光度计

3.试剂

（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：

准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000卩g/mL的原液。

（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制：

称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50mL90%乙醇中，加入85%（V/V）的磷酸100mL,最后用蒸馏水定容到1000mL。

此溶液在常温下可放置一个月。

（3）乙醇

（4）磷酸（85%）

（3）操作步骤

1.标准曲线制作

（1）0~100卩g/mL标准曲线的制作：

取6支10mL干净的具塞试管，按表1取样。

盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD95nm，并做标准曲线。

表1低浓度标准曲线制作

管号123456

1000ag/mL标准蛋白

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

液（mL）

蒸馏水（mL

1.00

0.98

0.96

0.94

0.92

0.90

考马斯亮蓝G-250试剂

5

（ml）

蛋白质含量（ag）

20

40

60

80

100

OD595

（2）0~1000ag/mL标准曲线的制作：

另取6支10mL具塞试管，按表2取样。

其余步骤同

（1）操作，做出蛋白质浓度为0~1000ag/mL的标准曲线。

表2高浓度标准曲线制作

管号

7

8

9

10

11

12

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

蒸馏水（mL）

（mL）

蛋白质含量（ag）

200

400

600

800

1000

OD95nm

2.样品提取液中蛋白质浓度的测定

（1）待测样品制备：

称取新鲜辣椒2g放入研钵中，加2mL蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5~1h以充分提取，然后在4OOOr/min离心20min,弃去沉淀，上清液转入10mL容量瓶，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。

（2）测定：

另取2支10mL具塞试管，按下表取样。

吸取提取液0.1mL（做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录光密度0®

5nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白

质的含量X（ag）。

以标准曲线1号试管做空白。

把x、y数据分别输入上下二行中，点击这个数据表中任一单元格，

然后插入-图表，图表类型选xy散点图，子图表可任选一个自已需要的，再按提示一路下一步，最后点完成。

在生成的图中右击数据线，在出现的下拉快捷菜单中点击添加趋势线，在类型中选线性（因你的方程是一次线性方程），在选项中选显示公式（还可勾选“显示R平

方值，这是相关系数，表示线性程度）最后按确定，ok了。

这时在

图出现的公式就是你要的回归方程。

当然，你也可不用图表的方式，可用函数LINEST,INTERCEP来分别求出A、B值，但本人用下来这个方法最方便。

1、输入数据后，单击“图表向导”，启动“图表向导”后，选择绘制“xy散点图”；

2、完成后，执行“图表/添加趋势线/"

根据散布图的线的变化趋势，结合函数图像，选择相应的线形；

3在选项标签中，选中“显示公式”，单击确定。

A,B和表达式全有了！

五、辣椒素含量测定---高相液相色谱