构建载体个人总结ooWord文档下载推荐.docx
《构建载体个人总结ooWord文档下载推荐.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《构建载体个人总结ooWord文档下载推荐.docx（19页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。
而高盐的3mol／LNaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。
前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
TE（pH8.0）
Tris.HCl（pH8.0）10mM
EDTA（pH8.0）1mM
（2）试验中用到的抗生素和酶
氨苄青霉素（ampicillin）：
其主要是通过抑制细胞壁的合成杀死正在生长的大肠杆菌。
氨苄青霉素抗性基因（ampr）：
合成β-内酰胺酶，在氨苄青霉素进入细胞之前将其水解（使用浓度100µ
g/ml）；
卡那霉素（Kanamycinsulfate）：
核糖体结合抑制蛋白质的合成（使用浓度：
50µ
RNaseA:
C或U的3’－P与相邻的5’－OH处切开。
配制：
一般以10mg/ml溶于TE中，然后在沸水中煮15分钟，分装成小份储存于－20℃。
Note：
在具体配置抗性LB时候，一般按照千分之一的比例加入，即350mlLB中加入350ul抗性溶液（于-20℃保存）；
2）具体步骤
一般地，先打电转获得含有相应载体的大肠杆菌菌液：
1.取含有相应载体的大肠杆菌菌液于含有相应抗生素的LA培养基上涂布或划线分离单菌落（37℃过夜培养）；
2.用枪头or无菌牙签挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中，（250r/min，37℃摇床过夜培养）；
（在具体的操作过程中，直接刮取质粒）
3.吸取1.5ml菌液，12000g离心1分钟，收集菌体，倒掉菌液；
吸取1.5ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净（尽量使用2ml离心管）；
4.加入300l溶液I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：
应彻底打匀沉淀或碎块），可以使用牙签便于震荡，但菌体较少时不要使用；
5.加入300l溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟；
6.加入300l溶液III，颠倒混匀，放于冰上10分钟（-20℃），使杂质充分沉淀；
7.12000g离心10分钟；
8.吸取800l上清液（注意：
不要吸取到飘浮的杂质）至另一离心管中，加入2/3体积的异丙醇，-20℃保存过夜；
9.12000g常温离心15分钟；
10.倒尽上清，加75％乙醇浸洗除盐，（放置片刻后倒去上清；
或离心5分钟）
11.加20ul-30ul灭菌超纯水或TE溶解，一般在室温放置一段时间（不易过长，质粒易降解），便于溶解；
12.分两份保存，-20℃（长期保存，不要反复冻融）和4℃（近期使用）[也可以保存菌液于-70℃，节省时间]
B．质粒的质量检测
1）质量定量检测
（a）检测260nm、280nm吸光值，紫外分光光度计A260/A280=1.8－1.9；
1.8最佳，低于1.8说明有蛋白质，大于1.8说明有RNA。
先用ddH2O清洗打点器两次（每次吸取1ul的ddH2O），用干净的卫生纸吸干；
再用1ulddH2O调零；
（一般载体浓度在100ng/ul-200ng/ul为佳）
（b）分光光度计：
1OD＝50g/mlDS-DNA
1OD＝40g/mlRNAorSS－DNA
2）质量定性检测
琼脂糖凝胶电泳：
一般有三条带（超螺旋、开环、线型三种构型），点样孔附近无DNA带（无染色体DNA污染）。
（1）原理
在pH值为8.0－8.3时，核酸分子带负电，在电泳时由负极向正极移动。
采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。
核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
（2）影响因素
1.DNA分子大小：
迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。
分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。
分子越大，迁移越慢。
2.琼脂糖浓度：
logU=logU0-Kr胶浓度，U为迁移率，U0为DNA的自由电泳迁移率，为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。
不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA
Agarose：
0.5%：
1-30kb；
0.7%：
0.8-12kb
1.2%：
0.4-7kb；
1.5%：
0.2-3kb
3.DNA构象：
一般迁移速率超螺旋环状>
线状DNA或单链开环。
当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。
4.所加电压：
低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。
使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm
5.碱基组成与温度：
4-30℃一般影响不大
6.嵌入染料（Hoechst33258，EB）的存在：
降低线性DNA迁移率，（不提倡加在电泳液中）
7.电泳缓冲液的组成及其离子强度：
影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×
TAE，1×
TBE，1×
TPE（均含EDTApH8.0）
（3）实验步骤
1.将洗净、干燥的制胶板放入制胶槽中，水平放置在工作台上；
2.调整好梳子的高度；
3.称取0.4g琼脂糖于40ml1×
TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，先封胶，冷却至温热时倒胶（小心产生气泡）；
4.凝胶凝固后，小心拔去梳子
5.将DNA样品与上样缓冲液（loadingbuffer）混合后将样品依次加入点样孔中；
上样缓冲液（loadingbuffer）：
含甘油或蔗糖，利于DNA样品沉入点样孔中；
含有电泳指示剂，以指示电泳的进程，
电泳指示剂：
核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenolblue,Bb）呈蓝紫色；
二甲苯晴（xylenecyanol,Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。
6.将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动（注意点样孔在电泳槽的负极一端）；
7.电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5µ
g/ml的溴化乙锭（EB）中浸泡10－15min（EB使用时间较长时，可以适当延长时间；
当做回收的胶时候，EB时间不宜过长，最好使用新的EB，浸泡5min左右），然后在水中清洗以消除背景，在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录。
EB：
溴化乙锭，可嵌入DNA分子中，受紫外光激发而发出荧光，利用它可检测DNA，是诱变剂，可引起插入突变，并有中度毒性，操作时应注意防护。
操作时应戴手套，尽量减少台面污染。
1000×
贮存液（0.5mg/mL），使用时按1：
1000稀释配制染色液（1/2深度DDH2O，再加50ul左右的EB即可）
C．载体与外源DNA的限制性内切酶消化
1）试剂特性
（1）限制性内切酶
1.有特定的识别序列，通常为4－6碱基的回文对称序列。
2.切割位点位于识别序列内的固定位置上，切割后在5’末端有磷酸基团，3’末端有羟基。
3.切割后形成粘性末端或平末端，前者又分为3’突出端（如PstI）和5’突出端（如EcoRI）两种
4.其活性发挥只需Mg2＋作辅酶。
5.限制酶的一个活性单位（1U）：
原则上指在50µ
l反应体系中，37℃下，经过1小时的反应将1µ
g的DNA完全分解所需要的酶量。
6.限制酶的star活性：
限制酶在极端非标准条件下使用时对底物DNA的特异性可能降低，即可将与原来识别的特定DNA序列不同的碱基序列切断，这种现象叫限制酶的star活性。
引起star活性的主要因素：
高浓度的甘油（>
5％）；
酶过量（>
100U/ug）；
低离子强度（<
25mM）；
高pH（>
pH8.0）；
有机溶剂（DMSO，乙醇，乙二醇，二甲基乙酰胺；
用其他二价阳离子代替Mg2+（Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+）
不同的酶对上述因素的敏感程度不同
（2）碱性磷酸酶（CIP）
1.细菌碱性磷酸酶（BAP）,牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）以及小虾碱性磷酸酶（SAP）都能催化磷酸单脂键的水解（包括DNA、RNA、dNTP和NTP上的5’－磷酸残基），不能催化磷酸三脂的水解。
2.比较而言，CIAP的活性比BAP的高10－20倍,CIAP经加热处理，容易失活但不能完全失活,若要使酶完全失活，不论是BAP还是CIAP还需要经苯酚处理。
而SAP经65⁰C加热15分钟就可完全失活。
3.活性定义：
在37⁰C、pH9.8的条件下，1分钟内水解对硝基苯磷酸盐（ρ-nitrophenylphosphate）生成1μM的对硝基苯（ρ-nitrophenol）所需的酶量定义为1个活性单位（U）.
（3）连接酶
（4）Buffer
氯化镁：
氯化钠/钾：
Tris盐酸盐：
β－巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）：
牛血清白蛋白（BSA）：
2）酶切体系
50l反应体系，用500ultube，冰上操作
DNA35l（保证反应体系中含有3-4ugDNA）
EnzymeI（10U/µ
l）1l
EnzymeII（10U/µ
l）1l
10×
buffer5l
ddH2O8l
（1）双酶切可以查询双酶切表，注意在双酶切表中，1.5T的意思是终浓度是1.5；
（2）如果需要加BSA，其在反应体系中与Buffer等量；
（3）在某些酶切反应中，可以采用不完全酶切，从而达到保存全长的作用；
（4）酶量在DNA量的1-2倍范围之内；
分别取5l酶切产物用0.8％－1.2%凝胶检测酶切效果
3）酶切不完全的原因
1.DNA不干净，反应体系中存在酶的抑制剂；
2.操作不当，酶或DNA加至管壁上，反应体系没完全混合；
3.反应条件不合适，用错了缓冲液或温度不合适；
4.酶的活力不够
5.DNA样品中抑制酶活的污染物主要有：
DNA样品中的蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高浓度的盐等均能抑制酶切活性
解决办法：
1.增加酶作用的单位数（10-20U/µ
gDNA）
2.增大反应体积以稀释可能的抑制剂
3.延长反应时间
4.消化基因组DNA时，加入终浓度1-2.5mmol/L多聚阳离子亚精胺可改善酶切效果，其作用是结合带负电荷的污染物。
5.纯化DNA
4）酶切反应的终止
1.加入终农度为12.5mmol/L的EDTA以鳌合镁离子而终止酶的反应
2.多数酶在65°
C10分钟可被不可逆灭活，少数65°
C不失活的酶在75°
C15分钟也能失活
3.若酶对热具完全抗性，可通过酚抽提乙醇沉淀来纯化
5）酶切产物的纯化
1.加入ddH2O150l（扩大体积），加入200µ
l氯仿/异戊醇（24:
1），颠倒混匀后离心10min；
2.吸出上清，加1/10体积3MNaAc和两倍体积乙醇，-20℃放置15分钟以上；
3.12000rpm4℃冷冻离心15分钟；
4.倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，风干后BACDNA溶于10lddH2O，pUC18DNA溶于20lddH2O（1.5mltube中）；
6）酶切产物的回收纯化
当一个体系中有多种DNA分子，而我们只需要其中的某种DNA时或者反应体系中含有目的DNA分子以外的其它分子如各种工具酶、dNTPs、引物及矿物油等时，可以利用凝胶电泳分离各种DNA，然后挖胶回收目的DNA带
柱式DNA胶回收试剂盒
1.在琼脂糖凝胶（1%）中，使用12孔细齿（可尽量制厚胶，每个胶孔中加入40ul-50ul左右的酶切产物）；
2.紫外灯下用干净的刀片切下含目的DNA带的胶块放入1.5ml离心管中；
（注意：
不含DNA的胶尽可能切除，在长波长的紫外灯下切胶，并尽量缩短DNA暴露在紫外光下的时间，可预先在紫外灯下划出胶块线，然后在外面用牙签挑取）
3.按胶的3-6质量体积比（尽量保证每个1.5ml管中胶块质量在300mg左右，这样可以加入900ulBindingBufferII）加入BindingBufferII,50-60º
C水浴中10分钟左右，使胶融化完全，每2-3分钟颠倒一次；
如果片段小于500kb（适于回收RNAi片段），加入1/3BufferII体积的异丙醇；
4.将融化的胶溶液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，放置5分钟（便于胶液浸润UNIQ-10柱的过滤部分），8000rpm离心1分钟；
5.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管内的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管内，加入600μlWashSolution,8000rpm室温离心1分钟；
6.重复5步一次，
7.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管内的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管内，12000rpm室温离心15秒；
8.将UNIQ-10柱放入一个新的1.5ml离心管内，放置超净台吹干或者在烘箱中烘干，同时将ElutionBuffer在60º
C中预热（一般加20-30ul），这样有利于提高DNA的洗脱效率；
在吸附柱的中央加入预热的ElutionBuffer，在室温下静置30min（可以延长至1hrs）；
9.12000rpm室温离心1分钟，离心管中的溶液即为回收的DNA片段；
10.4º
C中保存回收DNA溶液；
11.回收DNA电泳检测（3ulDNA+4ulddH2O+3ulloadingbuffer）；
1.首次使用前，必须在WashSolution中加入4倍体积的无水乙醇，充分摇匀后使用，每次使用后将瓶盖拧紧，以保持WashSolution中的乙醇含量。
2.ElutionBuffer为2.0mmol/LTris-HCl,pH8.5.4º
C保存。
也可用PH8.0的TE或PH≥7.0的水代替。
D．载体的去磷酸化
1）反应体系：
DNA20l
SAP（TaKaRa）1-2ul
10SAPbuffer5l
ddH2Oupto50ul
37℃反应15min→65℃反应15min；
2）去磷酸化产物的纯化
1.加2.5l3M的NaCl；
2.加入125ul冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟；
3.12000rpm，4℃冷冻离心15分钟；
4.倒去上清，用200ul75％乙醇浸洗沉淀，风干后溶于10lddH2O（0.5mltube中）
E．载体与外源DNA片段的连接
1）试剂的特性
T4DNA
Ligase
E.coliDNALigase
T4RNALigase
Ligasesofthermophilicbacteria
最适pH
辅酶
7.2-7.8
ATP
7.5-8.0
NAD
7.2-8.4
平滑末端
可能
*
不能
NO
DNA5’P末端和RNA3’OH末端
RNA5’P末端和DNA3’OH末端
RNA和RNA
少数可能
2）反应体系
外源DNA7l
载体1l
10buffer1l
T4ligase（1U/l）1l
Total10l
16º
C水浴保温过夜；
（也可采用5ul连接体系）
连接的时间可以适当延长，亦可以在4º
C中进行连接；
F．制备感受态细胞
1）实验步骤
1.前夜接种受体菌（DH5），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；
2.取1ml过夜培养物于100mlLB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（300rpm）；
3.将菌液迅速置于冰上，同时10%的甘油置于冰上预冷；
以下步骤需在超净工作台和冰上操作
4.吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；
5.4℃下3000g低温离心5-10分钟；
6.弃去上清，加入1500l预冷的10％的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；
7.4℃下3000g低温离心5-10分钟；
8.弃去上清，加入750l预冷预冷的10％的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；
9.4℃下3000g低温离心5-10分钟；
10.弃去上清，加入20l预冷预冷的10％的甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮
11.超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
2）注意事项
1.使用的培养基最好用NaCl减半的LB培养基（1/2LB）；
2.密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。
DH5菌株OD600为0.5时细胞密度是5×
107/ml）；
3.制备感受态细胞及配制试剂所用的水应达到18MΩ,即使用超纯水；
化学试剂应是分子生物学级；
4.所使用的枪头和器皿都应是新的，干净无菌的；
5.无菌操作；
6.低温（冰上）进行。
G．电转化
1）具体步骤（大肠杆菌：
DH10B，TOP10；
农杆菌：
EHA105）
1.制备选择性培养基平板：
在融化的250mlLA培养基中250lAmp，40lX-gal，4lIPTG，混匀后倒入灭菌培养皿中；
2.取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化,并将电转杯在冰上预冷；
3.每管感受态细胞中加入约20ng质粒DNA（连接产物1ul，质粒0.5ul，转化农杆菌时加0.1ul），3管分别加连接产物、标准超螺旋质粒DNA（阳性对照）及不加入任何DNA（阴性对照），用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置1分钟；
4.电转化仪输出电压选择1800V（1mm转化杯），电击时间5毫秒；
5.将要转化的混合物（本实验室40ul的感受态细胞液）加入预冷的1mm转化杯中，将转化杯插好，立即按下按钮电击；
6.立即（<
30秒）加入350ulSOC或LB培养基于转化杯中重悬细胞；
7.将细胞转入合适的培养管中37℃培养40-45min；
（农杆菌在28℃）
8.吸取合适体积的菌液涂布已倒好的选择培养基平板上；
（农杆菌需要极稀浓度便于单克隆生长）
9.37℃培养过夜（农杆菌在28℃，封口，48h生长），观察结果：
（1）氨苄抗性载体：
蓝色菌落：
载体自连
白色菌落：
含外源片段
现象原因
无菌落长出转化方面的问题，感受态细胞效率低
长出菌落很多，但白色菌落很少感受态细胞转化效率较高，但连接反应有问题，大多数是载体自连产生的蓝色菌落
长出菌落很少，且白色菌落少外源片段与载体的量都太少，连接子很少；
外源片段与载体的比例不合适；
连接缓冲液稀释倍数不对；
连接时间不够长；
体系中有抑制因子导致连接失败；
外源片段插入了载体，但没有打破LacZ的阅读框，产生的菌落仍为蓝色；
2）影响因素
1.细胞的生长状态非常重要，快速生长的细胞最适于制备感受态细胞；
2.细胞转化效率与所加电场的强度和脉冲持续时间有关。
细胞上穿孔的数目和孔径大小随着所加电场的强度和脉冲持续时间的增加而增加，但超过了一定的限度，就会对细胞造成伤害。
不同的细胞最适的电压不同，从450v/cm（昆虫细胞）到高于12.5kv/cm（细菌细胞），同时也与所使用的电转化杯有关，对于大肠杆菌而言，0.1cm的杯子使用1.8kv（1812.5kv/cm），0.2cm的杯子使用2.5kv（12.5kv/cm）。
时间一般设置为5毫秒
3.外源分子的纯度，杂质在转化过程中会转入细胞造成不可预知的影响，且常常增加细胞的死亡率；
4.制备感受态细胞所用的水应达到18MΩ即使用MilliQ级的超纯水，化学试剂应是分子生物学级；
5
升级会员 