食品酶学实验指导书汇总Word文件下载.docx
《食品酶学实验指导书汇总Word文件下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《食品酶学实验指导书汇总Word文件下载.docx（21页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
离心管；
温度计；
试管；
试管架；
玻璃烧杯；
比色管。
四、操作步骤
（一）温度对果胶酶活力的影响
1．取9支比色管，分别放入约10毫升橘汁，再分别加入1%浓度的果胶酶（0、0.1、1）毫升，再补加蒸馏水至总体积22毫升。
充分摇匀，置恒温水浴中于35、45、55℃温度下反应2h。
2．反应结束后，将反应液放入离心管中进行离心分离（3000rpm，5min）。
3．取上清液用蒸馏水稀释5倍后于721分光光度计于600nm处测吸光值。
4．计算
果汁澄清度（%）=（OD对照-OD）÷
OD对照×
100
式中：
OD对照——对照的吸光值（用蒸馏水代替酶液，与反应液同样操作）；
OD——酶反应液的吸光值。
5．根据在三个温度下果汁的澄清度的比较，取澄清度最高的温度为最适温度（见表1-1）。
表1-1温度对果胶酶活力的影响
实验序号
温度（℃）
果汁澄清度（%）
结果
1
35
—
2
3
4
45
5
6
7
55
8
9
（二）pH值对果胶酶活力的影响
1．取9支比色管，分别放入约10毫升橘汁，再分别加入1%浓度的果胶酶（0、0.1、1）毫升，每3个比色管分别补加pH为3、4和5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液至总体积22毫升。
充分摇匀，置恒温水浴中于45℃温度下反应2小时。
5．根据在三个pH下果汁的澄清度的比较，取澄清度最高的pH为最适pH（见表1-2）。
（三）加酶量对果汁澄清的影响
以横坐标为添加的酶量，纵坐标为澄清度，作坐标图。
用上述方法测定时，果汁的澄清度与酶量之间的关系在澄清度80%以下时，基本上近似直线，澄清度在80%时，肉眼也能看到几乎是透明的，因此将此作为反应终点。
把添加0.1毫升和1毫升分别的澄清度，在坐标图上连接起来。
找出澄清度达到80%时的最少使用酶量作为所需酶量。
（四）果胶酶活力的确定
在（三）的条件下，能使1毫升果汁有80%澄清的酶活力定为1单位。
酶澄清果汁的活力（μ/ml）=d÷
V×
d——酶的稀释倍数；
V——所需酶量（ml）。
（五）果汁中果胶的检验
分别取在不同条件下作用2小时的果汁2.5毫升置比色管中，加入95%乙醇至总体积10毫升，振荡。
因果胶不溶于乙醇中，如有果胶存在，则有浑浊和沉淀生成，比较浑浊生成量，可知果汁经果胶酶澄清效果。
表1-2pH值对果胶酶活力的影响
pH
五、附录：
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1mol/L），3.0—6.2
0.1mol/L柠檬酸：
含C6H8O7.H2O21.01g/1000ml；
0.1mol/L柠檬酸三钠：
含Na3C6H5O7.2H2O29.40g/1000ml。
0.1mol/L
柠檬酸
（xml）
柠檬酸三钠
（yml）
3.0
3.2
3.4
3.6
3.8
4.0
4.2
4.4
4.6
82.0
77.5
73.0
68.5
63.5
59.0
54.0
49.5
44.5
18.0
22.5
27.0
31.5
36.5
41.0
46.0
50.5
55.5
4.8
5.0
5.2
5.4
5.6
5.8
6.0
6.2
40.0
35.0
30.5
25.5
21.0
16.0
11.5
8.0
60.0
65.0
69.5
74.5
79.0
84.0
88.5
92.0
实验二多酚氧化酶和抗坏血酸氧化酶活力的测定
一、目的
掌握多酚氧化酶及抗坏血酸氧化酶的测定方法。
二、原理
测定果实、蔬菜保鲜中氧化酶的动态，对了解植物的代谢情况及其与环境条件的关系有重要意义。
抗坏血酸氧化酶会使抗坏血酸氧化而变成黄褐色的脱氢抗坏血酸；
多酚氧化酶使焦儿茶酚（邻苯二酚）氧化产生黑素类，使果实蔬菜在不适宜的贮藏条件下品质变劣。
抗坏血酸氧化酶的测定是在该酶的最适pH及适宜温度下，向反应瓶中加入一定量底物（抗坏血酸及酶液）。
根据抗坏血酸的消耗量计算酶活力。
抗坏血酸消耗量可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来测定。
KIO3十5KI＋2H3PO4→3I2十2K3PO4十3H2O
抗坏血酸十I2→脱氢抗坏血酸十2HI
在氧的存在下，多酚氧化酶将邻苯二酚氧化为醌类，醌又进一步氧化抗坏血酸为脱氢抗坏血酸。
向反应系统中加入焦儿茶酚和抗坏血酸，可由抗坏血酸的消耗量间接求得多酚氧化酶的活力。
三、材料、仪器和试剂
l．材料
新鲜的马铃薯或苹果等。
2．仪器
电冰箱，组织捣碎机，恒温水浴锅，离心机，三角瓶50毫升（×
6），刻度吸管5毫升（×
1）、2毫升1（×
2）、1毫升（×
2），微量滴定管（×
2），秒表。
3．试剂
（1）pH6、0.05M磷酸盐缓冲液（0.2MNa2HPO412.3ml，0.2MNaH2PO487.7ml，稀释4倍）
（2）0.1%抗坏血酸使用当天配制。
（3）0.02M焦儿茶酚（邻苯二酚）称取0.22克焦儿茶酚溶于100毫升水中，使用当天配制。
（4）10%偏磷酸
（5）1%淀粉溶液
（6）0.005M碘液碘化钾2.5克溶于200毫升蒸馏水中，加冰醋酸1毫升，再加0.1M碘酸钾（0.3567克碘酸钾溶于水，定容至100毫升）12.5毫升，用蒸馏水定容至250毫升。
四、操作
1.酶液制备
将新鲜马铃薯或苹果8克（去皮），切碎后置组织捣碎机内，加入约60毫升左右pH6的磷酸盐缓冲液（预先置冰箱内冷却），捣碎3分钟后将全部材料用缓冲液洗入100毫升容量瓶内，并定容至刻度。
在20℃水浴上浸提30分钟，中间摇动数次。
将匀浆离心（2500转/分，10～15分钟），取出上清液（酶液）备用。
2.测定
取6个50毫升干燥的三角瓶，标号后按下表准确加入试剂。
抗坏血酸氧化酶和多酚氧化酶测定试剂加量表
试剂（毫升）
瓶号
蒸馏水
抗坏血酸
焦儿茶酚
酶液
偏磷酸
备注
①
抗坏血酸氧化酶
②
③
空白
④
抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶
⑤
⑥
向各瓶内加水、抗坏血酸。
向④、⑤、⑥号瓶加焦儿茶酚。
向③、⑥号加偏磷酸。
于20℃水浴预热3～5分钟后分别测定。
向底物中加入酶液2毫升，立刻记时，混匀。
20℃保温3分钟后立即加入1毫升偏磷酸（③、⑥号不必再加）杀酶。
加淀粉溶液3滴，用0.005M碘液滴定至浅兰色为止。
记录各号之滴定值。
五、计算
以每克鲜样品每分钟氧化抗血酸的毫克数表示酶活力。
抗坏血酶氧化酶活力（单位／克）=[③-（①+②）/2]×
0.44×
n÷
W÷
（3×
2）
多酚氧化酶活力（单位/克）=[（⑥-（④+⑤）/2）-（2③-①-②）/2]×
式中
0.44——每毫升0.005M碘液氧化抗坏血酸毫克数。
n——酶提取液体积（毫升）。
W——鲜样品重量（克）。
由于酶液中同时存在以上两种酶，所以测定多酚氧化酶的反应系统中（④、⑤、⑥号）的抗坏血酸的消耗量是两种酶作用的结果。
在计算中要减去抗坏血酸氢化酶的底物消耗量。
实验三 碱性磷酸酶活性功能基团的化学修饰
1.使学生了解与掌握酶化学修饰的方法；
2.使学生了解酶化学修饰后的性质变化。
N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）在一定条件下能比较专一地与蛋白质分子中色氨酸残基侧链基团起反应，从而改变咪唑基的化学性质。
若色氨酸残基是酶活力所必需的，经NBS修饰后，酶活力完全丧失。
并在278nm处的紫外吸收值下降。
碱性磷酸酶（ALPase）酶活性中心含有一个色氨酸残基，是酶活力表现所必需的。
在NBS修饰过程中，随着NBS浓度增大酶活力逐渐下降，最终完全失活。
酶的紫外吸收光谱特征发生了明显的变化，278nm特征吸收峰随着NBS浓度的增大而逐渐下降至消失。
三、实验材料
1.仪器
恒温水浴锅，722分光光度计，50μL微量进样器，秒表，贝克曼UV-650分光光度计。
2.试剂
（1）0.1mol/LNaAc-HAc缓冲液（pH4.5）：
0.1mol/LNaAc48mL+0.1mol/LHAc52mL。
（2）2mmol/LNBS：
准确称取178mgNBS溶于50mLpH4.5、0.1mol/LNaAc-HAc中。
（3）1mmol/LNBS。
（4）测定碱性磷酸酶活力试剂：
（底物溶液的终浓度含0.05mol/LNa2CO3-NaHCO3缓冲液，pH10.1，2mmol/LMgCl2，5mmol/LpNPP）
（5）0.1mol/LNaOH。
（6）0.01mol/LTris-HCl（pH7.5）。
（7）0.1mol/Na2CO3-NaHCO3pH10.1缓冲液：
分别取0.1mol/LNa2CO3溶液（取28.6gNa2CO3·
10H2O溶于1000mL蒸馏水中）70mL和0.1mol/LNaHCO3溶液（取8.4gNaHCO3溶于1000mL蒸馏水中）30mL混匀，用酸度计准确调节pH10.1。
（8）0.5mol/L醋酸镁溶液：
称取醋酸镁107.25g溶于蒸馏水中，稀释至1000mL。
（9）0.1mol/L醋酸钠溶液：
称取醋酸钠8.2g溶于蒸馏水中，稀释至1000mL。
（10）0.01mol/L醋酸镁-0.01mol/L醋酸钠溶液：
取0.5mol/L醋酸镁20mL及0.1mol/L醋酸钠100mL，混匀后加蒸馏水稀释至1000mL。
（11）底物溶液（5mmol/LpNPP）：
按以下比例混匀（7）:
（8）:
（10）:
H2O=1:
0.2:
0.5:
0.28。
（12）20mmol/LMgCl2：
称取1.904gMgCl2溶于1000mL蒸馏水中。
3.材料
牡蛎碱性磷酸酶液
四、实验步骤
1、NBS对酶的修饰作用
取6支试管，编号。
按表2-1方法操作：
表2-1
管号
ALPase酶液/mL
各管加入1mL
0.1mol/LNaAc-HAc/mL
3.75
3.50
3.25
2.75
1mmol/LNBS/mL
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
NBS终浓度/mmol/L
0.05
0.10
0.15
0.20
按上表顺序加入后，混匀，室温放置5min进行修饰作用。
分别得到1~6号的不同NBS浓度修饰的酶液（其中1号为对照）。
然后再测定酶的剩余活力。
2、NBS对酶修饰后剩余活力测定
取19支试管，编号。
0号为空白对照管，用于仪器调零；
1~6号为测定管，重复3组，作平行实验。
按表2-2操作：
表2-2
测活底物
各管1.9mL
预热
37℃预热5min
修饰酶液
∕
对应加入已修饰的酶液0.1mL
反应时间
精确反应10min
0.1mol/LNaOH
各管加入2mL
空白管补加酶液
0.1mL
OD405
相对酶活力/%
以空白管校正仪器，在722分光光度计测定波长405nm的OD值（OD405）。
3、数据处理
通过405nm的OD值（OD405）计算各管的酶活力，以1号管的酶活力为100%，其他管核算为相对活力。
以修饰剂NBS浓度为横坐标，各管的剩余酶活力为纵坐标绘制酶活力与[NBS]的关系图。
说明NBS对碱性磷酸酶的修饰作用。
4、NBS修饰后酶的紫外特征吸收峰的变化情况
在贝克曼UV-650型分光光度计自动扫描记录天然酶液（无经NBS处理，即1号酶）和经不同浓度NBS处理的酶液的紫外吸收光谱。
波长范围为230-300nm（在石英比色杯中，空白对照管为1mLTris·
HCl缓冲液代替酶液，其他加入量同3.1表）。
解释酶的紫外吸收光谱的变化情况。
5、NBS修饰后酶的紫外差示光谱的变化情况
在一对含隔板的石英比色杯中，空白对照管的两室为1、2室，样品测定管的两室为3、4室。
按表2-3加样：
表2-3
室号
0.5
0.1mol/LTris.HCl/mL
0.1mol/LNaAC-HAc/mL
2mmol/LNBS/mL
上述3室的酶也在NBS浓度为1mmol/L下处理，在紫外分光光度计自动扫描记录波长范围为230-300nmOD值。
解释酶的紫外差吸收光谱的变化情况。
五、作业
1.如何用化学修饰方法研究酶活性中心功能基团的性质？
2.酶的化学修饰实验应注意什么事项？
3.如何判断NBS是作用于色氨酸残基的？
附：
（1）碱性磷酸酶：
广泛存在于微生物界。
碱性磷酸酶能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖等磷酸受体上。
在磷的生物和化学循环过程中，碱性磷酸酶起了及其重要的作用。
在生物体内碱性磷酸酶与磷的代谢直接相关，参与磷与钙物质的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化过程。
碱性磷酸酶的作用最适pH碱性区域，一般在pH9.0~10.5范围内。
Mg2+对该酶的活力有显著的激活作用。
（2）碱性磷酸酶酶活力分析：
通常是以对-硝基磷酸二钠（pNPP）为底物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液（含2mmol/LMg2+）的测活体系中检测酶催化pNPP水解产生黄色的对硝基苯酚（pNP）的量。
产物pNP在405nm处有最大的吸收峰，可以根据OD405的值的增加计算酶活力的大小。
酶活力定义为：
在37℃下，以5mmol/LpNPP为底物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液含2mmol/LMg2+的测活体系中每分钟催化产生1mmol/LpNP的酶量定义为1个酶活力单位。
酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。
实验四超氧化物歧化酶的制备及活力测定
一、前言
超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase简称SOD）是一种重要的氧自由基清除剂，属金属酶，它在生物界分布极广，它催化的化学反应是：
O2-+O2-+2H+→H2O2+O2
由于SOD能专一清除生物氧化产生的超氧阴离子（D2-）而起保护细胞的作用，故引起国内外医药界和生化界的极大关注。
在食品工业中，可以作为一种天然的抗氧化剂而广泛应用。
通过本实分掌握以猪血为原料制备SOD的方法。
用SOD抑制连苯三酚在空气中自氧化速率的方法测其活性。
SOD是一种酸性蛋白，在酶分子上共价连接金属辅基，因此它对热、pH及某些理化性质表现出异常的稳定性，如离于强度非常低，即使加热到95℃，SOD活性丧失也很少，是迄今发现热稳定性最高的球蛋白之一。
利用此性质将猪红血球中其它蛋白质沉淀除去，再用DEAE－SephadexA－50进行离子交换层析，因为DEAE－SephadexA－50是弱碱性阴离子交换树脂，可吸附SOD，然后用磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集具有SOD活性的洗脱液，浓缩，冻干即可得SOD成品。
（－）材料
新鲜猪血。
（二）仪器
大烧杯500毫升及1000毫升；
电热恒温水浴锅；
层析柱1×
17厘米；
自动部分收集器；
超过滤器；
台式离心浓缩干燥器，pH计，752型紫外分光光度计。
（三）试剂
1.0.9%氯化钠溶液。
2.95%乙醇。
3.氯仿。
4.丙酮。
5.磷酸缓冲液（pH7.6、2.5mM－50mM）。
6.试剂SOD。
7.45mM连苯三酚缓冲液。
8.pH8.2、50mMTris－HCl缓冲液。
9.10mM盐酸。
（一）猪血SOD的制备
1.取新鲜猪血，离心（3000转／分，20分钟）除去黄色血浆，红血球用0.9%氯化钠清洗二次，接着用两倍量的水搅拌溶血半小时。
2.在溶血后的血液中缓慢加入0.25倍体积的95%乙醇和0.15倍体积的氯仿，搅拌15分钟，离心除去血红蛋白得到清液。
3.向清液中缓慢加入丙酮出现沉淀，离心后得沉淀。
4.使沉淀溶于水，然后置恒温水浴中于55～65℃，进行热处理15分钟以使杂蛋白变性沉淀，离心去沉淀得清液。
清液可再加丙酮进行第二次沉淀，离心分离得沉淀供层析用。
5.用DEAE－SephadexA－50装好层析柱（1×
17厘米），以沉淀上层析柱，用pH7，2.5mM－50mM的磷酸缓冲液进行梯度洗脱，每4毫升收集一管，前20管不含SOD活性，收集具有SOD活性的洗脱液。
6．把具有SOD活性的洗脱液通过超过滤浓缩（SOD分子量约为32000），然后冷冻干燥，可得淡蓝绿色成品。
在各制备环节测定酶的总回收率和比活力。
计算后将结果填入下表。
测定结果统计表
纯化
步骤
酶活力
（单位/毫升）
蛋白质浓度
（毫克/毫升）
总体积
（毫升）
比活力
（单位/毫克）
酶活力总回收率（%）
除血红蛋白
丙酮沉淀
（一）
热变性
丙酮沉淀
（二）
柱层析
（二）活力测定——连苯三酚氧化法
1.连苯三酚自氧化速率的测定
取3支试管分别标号0、1、2，加入3毫升50M的Tris一HCl缓冲液（内含1mM/L乙二胺四乙酸二钠），在25℃下保温15分钟，试管1加入预热的45mM连苯三酚10微升左右，记时，速以0号试管溶液做空白对照用752或754分光光度计在325nm处测定4分钟内每分钟OD值变化为△A325连。
2.SOD或粗酶提取液活力的测定
在2号试管中加入预热酶液10微升，摇匀，再加入预热的45mM连苯三酚10微升，计时，仍以0号管作对照在325处测定4分钟内每分钟的OD值的变化为△A325酶。
3.酶活力计算
酶活力定义：
在25℃时，1毫升反应液中每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达50%时的酶量为一个活力单位。
单位活力（μ/ml）=（△A325连－△A325酶）÷
△A325连÷
50%×
100×
反应液总体积×
酶液稀释倍数÷
加酶体积
五、注意事项
①严格控制连苯三酚的自氧化率在0.07OD/min。
只有控制连苯三酚最终浓度在0.07～0.10范围内，SOD对自氧化抑制程度才基本不变，如果连苯三酚浓度大于0.10mM不仅自氧化速率线性范围减小，而且要大大降低SOD对连苯三酚自氧化的抑制程度。
②SOD对连苯三酚自氧化抑制应控制在50%左右，这样测得的酶单位才可靠。
实验表明，随着SOD加样量的增加，相应酶液的酶单位数却减少。
也就是说，以SOD对连苯三酚自氧化抑制50%为标准，如大于这个数值，则实际测得的数据偏低；
反之，若酶量过小，测得的数据偏高。
因此要适当调节样液的释稀倍数。
③连苯三酚和被测样液的加入量采用微量进样，只有10微升左右，故在整个反应系统中这个量可以忽略不计。
实验五过氧化物酶活力的测定
掌握过氧化物酶活力的测定方法。
过氧化物酶的活力与果蔬的成熟度间接地成正相关，故常称其为“成熟酶”。
在用加热方法杀灭食品中有害的酶时，也常以过氧化物酶作指标酶，因为该酶耐热。
过氧化物酶能将愈创木酚（邻甲氧基苯酚）氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚。
在470毫微米波长处测定消化值，即可求酶活力。
升级会员 