生物化学第四版课后参考答案Word格式.docx

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　　1．用于测定蛋白质多肽链N端、C端的常用方法有哪些？

基本原理是什么？

（1）N-末端测定法：

常采用―二硝基氟苯法、Edman降解法、丹磺酰氯法。

　　①―二硝基氟苯（DNFB或FDNB）法：

多肽或蛋白质的游离末端氨基与―二硝基氟苯（―DNFB）反应（Sanger反应），生成DNP―多肽或DNP―蛋白质。

由于DNFB与氨基形成的键对酸水解远比肽键稳定，因此DNP―多肽经酸水解后，只有N―末端氨基酸为黄色DNP―氨基酸衍生物，其余的都是游离氨基酸。

　　②丹磺酰氯（DNS）法：

多肽或蛋白质的游离末端氨基与与丹磺酰氯（DNS―Cl）反应生成DNS―多肽或DNS―蛋白质。

由于DNS与氨基形成的键对酸水解远比肽键稳定，因此DNS―多肽经酸水解后，只有N―末端氨基酸为强烈的荧光物质DNS―氨基酸，其余的都是游离氨基酸。

　　③苯异硫氰酸脂（PITC或Edman降解）法：

多肽或蛋白质的游离末端氨基与异硫氰酸苯酯（PITC）反应（Edman反应），生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质。

在酸性有机溶剂中加热时，N―末端的PTC―氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上掉下来，除去N―末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的。

　　④氨肽酶法：

氨肽酶是一类肽链外切酶或叫外肽酶，能从多肽链的N端逐个地向里切。

根据不同的反应时间测出酶水解释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，就能知道该蛋白质的N端残基序列。

（2）C―末端测定法：

常采用肼解法、还原法、羧肽酶法。

　　肼解法：

蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解，反应中除C端氨基酸以游离形式存

　　在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。

　　②还原法：

肽链C端氨基酸可用硼氢化锂还原成相应的α―氨基醇。

肽链完全水解后，代表原来C―末端氨基酸的α―氨基醇，可用层析法加以鉴别。

　　③羧肽酶法：

是一类肽链外切酶，专一的从肽链的C―末端开始逐个降解，释放出游离的氨基酸。

被释放的氨基酸数目与种类随反应时间的而变化。

根据释放的氨基酸量（摩尔数）与反应时间的关系，便可以知道该肽链的C―末端氨基酸序列。

　　2．测得一种血红蛋白含铁0.426%，计算其最低相对分子质量。

一种纯酶按质量计算含亮氨酸1.65%和异亮氨酸2.48%，问其最低相对分子质量是多少？

3．指出下面pH条件下，各蛋白质在电场中向哪个方向移动，即正极，负极，还是保持原点？

（1）胃蛋白酶（pI1.0），在pH5.0；

（2）血清清蛋白（pI4.9），在pH6.0；

　　（3）α-脂蛋白（pI5.8），在pH5.0和pH9.0；

（1）胃蛋白酶pI1.0＜环境pH5.0，带负电荷，向正极移动；

（2）血清清蛋白pI4.9＜环境pH6.0，带负电荷，向正极移动；

　　（3）α-脂蛋白pI5.8＞环境pH5.0，带正电荷，向负极移动；

　　α-脂蛋白pI5.8＜环境pH9.0，带负电荷，向正极移动。

　　4．何谓蛋白质的变性与沉淀？

二者在本质上有何区别？

蛋白质变性的概念：

天然蛋白质受物理或化学因素的影响后，使其失去原有的生物活性，并伴随着物理化学性质的改变，这种作用称为蛋白质的变性。

　　变性的本质：

分子中各种次级键断裂，使其空间构象从紧密有序的状态变成松散无序的状态，一级结构不破坏。

　　蛋白质变性后的表现：

①?

生物学活性消失；

②?

理化性质改变：

溶解度下降，黏度增加，紫外吸收增加，侧链反应增强，对酶的作用敏感，易被水解。

　　蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。

如果在蛋白质溶液中加入适当的试剂，破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。

沉淀机理：

破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。

　　蛋白质的沉淀可以分为两类：

（1）可逆的沉淀：

蛋白质的结构未发生显著的变化，除去引起沉淀的因素，蛋白质仍能溶于原来的溶剂中，并保持天然性质。

如盐析或低温下的乙醇（或丙酮）短时间作用蛋白质。

（2）不可逆沉淀：

蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质变性而沉淀，不再能溶于原溶剂。

如加热引起蛋白质沉淀，与重金属或某些酸类的反应都属于此类。

　　蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在，并不析出。

因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已经变性。

　　5．下列试剂和酶常用于蛋白质化学的研究中：

CNBr，异硫氰酸苯酯，丹磺酰氯，脲，6mol/LHClβ-巯基乙醇，水合茚三酮，过甲酸，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，其中哪一个最适合完成以下各项任务？

（1）测定小肽的氨基酸序列。

（2）鉴定肽的氨基末端残基。

　　（3）不含二硫键的蛋白质的可逆变性。

若有二硫键存在时还需加什么试剂？

　　（4）在芳香族氨基酸残基羧基侧水解肽键。

　　（5）在甲硫氨酸残基羧基侧水解肽键。

　　（6）在赖氨酸和精氨酸残基侧水解肽键。

（1）异硫氰酸苯酯；

（2）丹黄酰氯；

（3）脲；

-巯基乙醇还原二硫键；

（4）胰凝乳蛋白酶；

（5）CNBr；

（6）胰蛋白酶。

　　6．由下列信息求八肽的序列。

（1）酸水解得Ala，Arg，Leu，Met，Phe，Thr，2Val。

（2）Sanger试剂处理得DNP-Ala。

　　（3）胰蛋白酶处理得Ala，Arg，Thr和Leu，Met，Phe，2Val。

当以Sanger试剂处理时分别得到DNP-Ala和DNP-Val。

　　（4）溴化氰处理得Ala，Arg，高丝氨酸内酯，Thr，2Val，和Leu，Phe，当用Sanger试剂处理时，分别得DNP-Ala和DNP-Leu。

由

（2）推出N末端为Ala；

由（3）推出Val位于N端第四，Arg为第三，而Thr为第二；

溴化氰裂解，得出N端第六位是Met，由于第七位是Leu，所以Phe为第八；

由（4），第五为Val。

所以八肽为：

Ala-Thr-Arg-Val-Val-Met-Leu-Phe。

　　7．一个α螺旋片段含有180个氨基酸残基，该片段中有多少圈螺旋？

计算该α-螺旋片段的轴长。

180/3.6=50圈，50×

0.54=27nm，该片段中含有50圈螺旋，其轴长为27nm。

　　8．当一种四肽与FDNB反应后，用5.7mol/LHCl水解得到DNP-Val及其他3种氨基酸；

当这四肽用胰蛋白酶水解时发现两种碎片段；

其中一片用LiBH4（下标）还原后再进行酸水解，水解液内有氨基乙醇和一种在浓硫酸条件下能与乙醛酸反应产生紫（红）色产物的氨基酸。

试问这四肽的一级结构是由哪几种氨基酸组成的？

（1）四肽与FDNB反应后，用5.7mol/LHCl水解得到DNP-Val，证明N端为Val。

（2）LiBH4还原后再水解，水解液中有氨基乙醇，证明肽的C端为Gly。

　　（3）水解液中有在浓H2SO4条件下能与乙醛酸反应产生紫红色产物的氨基酸，说明此氨基酸为Trp。

说明C端为Gly－Trp...

　　（4）根据胰蛋白酶的专一性，得知N端片段为Val－Arg（Lys）...，以

（1）、

（2）、（3）结果可知道四肽的顺序：

N－Val－Arg（Lys）－Trp－Gly－C。

　　9．概述测定蛋白质一级结构的基本步骤。

（1）测定蛋白质中氨基酸组成。

（2）蛋白质的N端和C端的测定。

　　（3）应用两种或两种以上不同的水解方法将所要测定的蛋白质肽链断裂，各自得到一系列大小不同的肽段。

　　（4）分离提纯所产生的肽，并测定出它们的序列。

　　（5）从有重叠结构的各个肽的序列中推断出蛋白质中全部氨基酸排列顺序。

　　如果蛋白质含有一条以上的肽链，则需先拆开成单个肽链再按上述原则确定其一级结构。

如是含二硫键的蛋白质，也必须在测定其氨基酸排列顺序前，拆开二硫键，使肽链分开，并确定二硫键的位置。

拆开二硫键可用过甲酸氧化，使胱氨酸部分氧化成两个半胱氨磺酸。

3核酸

　　1．①电泳分离四种核苷酸时，通常将缓冲液调到什么pH？

此时它们是向哪极移动？

移动的快慢顺序如何?

②将四种核苷酸吸附于阴离子交换柱上时，应将溶液调到什么pH？

③如果用逐渐降低pH的洗脱液对阴离子交换树脂上的四种核苷酸进行洗脱分离，其洗脱顺序如何？

为什么？

①电泳分离4种核苷酸时应取pH3.5的缓冲液，在该pH时，这4种单核苷酸之间所带负电荷差异较大，它们都向正极移动，但移动的速度不同，依次为：

UMP>

GMP>

AMP>

CMP；

②应取pH8.0，这样可使核苷酸带较多负电荷，利于吸附于阴离子交换树脂柱。

虽然pH11.4时核苷酸带有更多的负电荷，但pH过高对分离不利。

③当不考虑树脂的非极性吸附时，根据核苷酸负电荷的多少来决定洗脱速度，则洗脱顺序为CMP>

GMP>

UMP，但实际上核苷酸和聚苯乙烯阴离子交换树脂之间存在着非极性吸附，嘌呤碱基的非极性吸附是嘧啶碱基的3倍。

静电吸附与非极性吸附共同作用的结果使洗脱顺序为：

CMP>

AMP>

UMP>

GMP。

　　2．为什么DNA不易被碱水解，而RNA容易被碱水解?

因为RNA的核糖上有2（-OH基，在碱作用下形成2（,3（-环磷酸酯，继续水解产生2（-核苷酸和3（-核苷酸。

DNA的脱氧核糖上无2（-OH基，不能形成碱水解的中间产物，故对碱有一定抗性。

　　3．一个双螺旋DNA分子中有一条链的成分[A]=0.30，[G]=0.24，①请推测这一条链上的[T]和[C]的情况。

②互补链的[A]，[G]，[T]和[C]的情况。

①[T]+[C]=1-0.30-0.24=0.46；

②[T]=0.30，[C]=0.24，[A]+[G]=0.46。

　　4．对双链DNA而言，①若一条链中（A+G）/（T+C）=0.7，则互补链中和整个DNA分子中（A+G）/（T+C）分别等于多少？

②若一条链中（A+T）/（G+C）=0.7，则互补链中和整个DNA分子中（A+T）/（G+C）分别等于多少？

　　解答：

①设DNA的两条链分别为α和β则：

Aα=Tβ，Tα=Aβ，Gα=Cβ，Cα=Gβ，因为：

（Aα+Gα）/（Tα+Cα）=（Tβ+Cβ）/（Aβ+Gβ）=0.7，所以互补链中（Aβ+Gβ）/（Tβ+Cβ）=1/0.7=1.43；

在整个DNA分子中，因为A=T，G=C，所以，A+G=T+C，（A+G）/（T+C）=1；

②假设同

（1），则Aα+Tα=Tβ+Aβ，Gα+Cα=Cβ+Gβ，所以，（Aα+Tα）/（Gα+Cα）=（Aβ+Tβ）/（Gβ+Cβ）=0.7；

在整个DNA分子中，（Aα+Tα+Aβ+Tβ）/（Gα+Cα+Gβ+Cβ）=2（Aα+Tα）/2（Gα+Cα）=0.7

　　5．T7噬菌体DNA（双链B-DNA）的相对分子质量为2.5×

107，计算DNA链的长度（设核苷酸对的平均相对分子质量为640）。

0.34×

（2.5×

107/640）=1.3×

104nm=13μm。

　　6．如果人体有1014个细胞，每个体细胞的DNA含量为6.4×

109个碱基对。

试计算人体DNA的总长度是多少？

是太阳―地球之间距离（2.2×

109km）的多少倍？

已知双链DNA每1000个核苷酸重1×

10-18g，求人体DNA的总质量。

每个体细胞的DNA的总长度为：

6.4×

109×

0.34nm=2.176×

109nm=2.176m，人体内所有体细胞的DNA的总长度为：

2.176m×

1014=2.176×

1011km，这个长度与太阳―地球之间距离（2.2×

109km）相比为：

2.176×

1011/2.2×

109=99倍，每个核苷酸重1×

10-18g/1000=10-21g，所以，总DNA6.4×

1023×

10-21=6.4×

102=640g。

　　7．有一个X噬菌体突变体的DNA长度是15μm，而正常X噬菌体DNA的长度为17μm，计算突变体DNA中丢失掉多少碱基对？

（17-15）×

103/0.34=5.88×

103bp

　　8．概述超螺旋DNA的生物学意义。

①超螺旋DNA比松弛型DNA更紧密，使DNA分子的体积更小，得以包装在细胞内；

②超螺旋会影响双螺旋分子的解旋能力,从而影响到DNA与其他分子之间的相互作用；

③超螺旋有利于DNA的转录、复制及表达调控。

　　9．为什么自然界的超螺旋DNA多为负超螺旋？

环状DNA自身双螺旋的过度旋转或旋转不足都会导致超螺旋，这是因为超螺旋将使分子能够释放由于自身旋转带来的应力。

双螺旋过度旋转导致正超螺旋，而旋转不足将导致负超螺旋。

虽然两种超螺旋都能释放应力，但是负超螺旋时，如果发生DNA解链（即氢链断开，部分双螺旋分开）就能进一步释放应力，而DNA转录和复制需要解链。

因此自然界环状DNA采取负超螺旋，这可以通过拓扑异构酶的操作实现。

　　10．真核生物基因组和原核生物基因组各有哪些特点?

不同点:

①真核生物DNA含量高，碱基对总数可达1011，且与组蛋白稳定结合形成染色体，具有多个复制起点。

原核生物DNA含量低，不含组蛋白，称为类核体，只有一个复制起点。

②真核生物有多个呈线形的染色体；

原核生物只有一条环形染色体。

③真核生物DNA中含有大量重复序列，原核生物细胞中无重复序列。

④真核生物中为蛋白质编码的大多数基因都含有内含子（有断裂基因）；

原核生物中不含内含子。

⑤真核生物的RNA是细胞核内合成的，它必须运输穿过核膜到细胞质才能翻译，这样严格的空间间隔在原核生物内是不存在的。

⑥原核生物功能上密切相关的基因相互靠近，形成一个转录单位，称操纵子，真核生物不存在操纵子。

⑦病毒基因组中普遍存在重叠基因，但近年发现这种情况在真核生物也不少见。

相同点:

都是由相同种类的核苷酸构成的的双螺旋结构，均是遗传信息的载体，均含有多个基因。

　　11．如何看待RNA功能的多样性?

它的核心作用是什么?

RNA的功能主要有:

①控制蛋白质合成；

②作用于RNA转录后加工与修饰；

③参与细胞功能的调节；

④生物催化与其他细胞持家功能；

⑤遗传信息的加工；

⑥可能是生物进化时比蛋白质和DNA更早出现的生物大分子。

其核心作用是既可以作为信息分子又可以作为功能分子发挥作用。

　　12．什么是DNA变性？

DNA变性后理化性质有何变化？

DNA双链转化成单链的过程称变性。

引起DNA变性的因素很多，如高温、超声波、强酸、强碱、有机溶剂和某些化学试剂（如尿素，酰胺）等都能引起变性。

DNA变性后的理化性质变化主要有：

①天然DNA分子的双螺旋结构解链变成单链的无规则线团，生物学活性丧失；

②天然的线型DNA分子直径与长度之比可达1∶10，其水溶液具有很大的黏度。

变性后，发生了螺旋-线团转变，黏度显著降低；

③在氯化铯溶液中进行密度梯度离心，变性后的DNA浮力密度大大增加，故沉降系数S增加；

④DNA变性后，碱基的有序堆积被破坏，碱基被暴露出来，因此，紫外吸收值明显增加，产生所谓增色效应。

⑤DNA分子具旋光性，旋光方向为右旋。

由于DNA分子的高度不对称性，因此旋光性很强，其[a]=150。

当DNA分子变性时，比旋光值就大大下降。

　　13．哪些因素影响Tm值的大小？

影响Tm的因素主要有：

①G-C对含量。

G-C对含3个氢键，A-T对含2个氢键，故G-C对相对含量愈高，Tm亦越高（图3-29）。

在0.15mol/LNaCl,0.015mol/L柠檬酸钠溶液（1×

SSC）中，经验公式为：

（G+C）%=（Tm-69.3）×

2.44。

②溶液的离子强度。

离子强度较低的介质中，Tm较低。

在纯水中，DNA在室温下即可变性。

分子生物学研究工作中需核酸变性时，常采用离子强度较低的溶液。

③溶液的pH。

高pH下，碱基广泛去质子而丧失形成氢键的有力，pH大于11.3时，DNA完全变性。

pH低于5.0时，DNA易脱嘌呤，对单链DNA进行电泳时，常在凝胶中加入NaOH以维持变性关态。

④变性剂。

甲酰胺、尿素、甲醛等可破坏氢键，妨碍碱堆积，使Tm下降。

对单链DNA进行电泳时，常使用上述变性剂。

　　14．哪些因素影响DNA复性的速度？

影响复性速度的因素主要有：

①复性的温度，复性时单链随机碰撞，不能形成碱基配对或只形成局部碱基配对时，在较高的温度下两链重又分离，经过多次试探性碰撞才能形成正确的互补区。

所以，核酸复性时温度不宜过低，Tm-25℃是较合适的复性温度。

②单链片段的浓度，单链片段浓度越高，随机碰撞的频率越高，复性速度越快。

③单链片段的长度，单链片段越大，扩散速度越慢，链间错配的概率也越高。

因面复性速度也越慢，即DNA的核苷酸对数越多，复性的速度越慢，若以C0为单链的初始浓度，t为复性的时间，复性达一半时的C0t值称C0t1/2，该数值越小，复性的速度越快。

④单链片段的复杂度，在片段大小相似的情况下，片段内重复序列的重复次数越多，或者说复杂度越小，越容易形成互补区，复性的速度就越快。

真核生物DNA的重复序列就是复生动力学的研究发现的，DNA的复杂度越小，复性速度越快。

　　15．概述分子杂交的概念和应用领域。

在退火条件下，不同来源的DNA互补区形成双链，或DNA单链和RNA单链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程称分子杂交。

通常对天然或人工合成的DNA或RNA片段进行放射性同位素或荧光标记，做成探针，经杂交后，检测放射性同位素或荧光物质的位置，寻找与探针有互补关系的DNA或RNA。

直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交，因未改变核酸所在的位置，称原位杂交技术。

将核酸直接点在膜上，再与探针杂交称点杂交，使用狭缝点样器时，称狭缝印迹杂交。

该技术主要用于分析基因拷贝数和转录水平的变化，亦可用于检测病原微生物和生物制品中的核酸污染状况。

杂交技术较广泛的应用是将样品DNA切割成大小不等的片段，经凝胶电泳分离后，用杂交技术寻找与探针互补的DNA片段。

由于凝胶机械强度差，不适合于杂交过程中较高温度和较长时间的处理，Southern提出一种方法，将电泳分离的DNA片段从凝胶转移到适当的膜（如硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，在进行杂交操作，称Southern印迹法，或Southern杂交技术。

随后，Alwine等提出将电泳分离后的变性RNA吸印到适当的膜上再进行分子杂交的技术，被戏称为Northern印迹法，或Northern杂交。

分子杂交广泛用于测定基因拷贝数、基因定位、确定生物的遗传进化关系等。

Southern杂交和Northern杂交还可用于研究基因变异，基因重排，DNA多态性分析和疾病诊断。

杂交技术和PCR技术的结合，使检出含量极少的DNA成为可能。

促进了杂交技术在分子生物学和医学领域的广泛应用。

DNA芯片技术也是以核酸的分子杂交为基础的。

　　16．概述核酸序列测定的方法和应用领域。

DNA的序列测定目前多采用Sanger提出的链终止法，和Gilbert提出的化学法。

其中链终止法经不断改进，使用日益广泛。

链终止法测序的技术基础主要有：

①用凝胶电泳分离DNA单链片段时，小片段移动，大片段移动慢，用适当的方法可分离分子大小仅差一个核苷酸的DNA片段。

②用合适的聚合酶可以在试管内合成单链DNA模板的互补链。

反应体系中除单链模板外，还应包括合适的引物，4种脱氧核苷三磷酸和若干种适量的无机离子。

如果在4个试管中分别进行合成反应，每个试管的反应体系能在一种核苷酸处随机中断链的合成，就可以得到4套分子大小不等的片段，如新合成的片段序列为-CCATCGTTGA-，在A处随机中断链的合成，可得到-CCA和-CCATCGTA两种片段，在G处中断合成可得到-CCATCG和-CCATCGTTG两种片段。

在C和T处中断又可以得到相应的2套片段。

用同位素或荧光物质标记这4套新合成的链，在凝胶中置于4个泳道中电泳，检测这4套片段的位置，即可直接读出核苷酸的序列。

在特定碱基处中断新链合成最有效的办法，是在上述4个试管中按一定比例分别加入一种相应的2（,3（-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），由于ddNTP的3（位无-OH，不可能形成磷酸二酯键，故合成自然中断。

如上述在A处中断的试管内，既有dATP，又有少量的ddATP，新合成的-CCA链中的A如果是ddAMP,则链的合成中断，如果是dAMP，则链仍可延伸。

因此，链中有几个A，就能得到几种大小不等的以A为末端的片段。

如果用放射性同位素标记新合成的链，则4个试管中新合成的链在凝胶的4个泳道电泳后，经放射自显影可检测带子的位置，由带子的位置可以直接读出核苷酸的序列。

采用T7测序酶时，一次可读出400多个核苷酸的序列。

近年采用4种射波长不同的荧光物质分别标记4种不同的双脱氧核苷酸，终止反应后4管反应物可在同一泳道电泳，用激光扫描收集电泳信号，经计算机处理可将序列直接打印出来。

采用毛细管电泳法测序时，这种技术一次可测定700个左右核苷酸的序列，一台仪器可以有几十根毛细管同时进行测序，且电泳时间大大缩短，自动测序技术的进步加快了核酸测序的步伐，现已完成了包括人类在内的几十个物种的基因组测序。

　　RNA序列测定最早采用的是类似蛋白质序列测定的片段重叠法，Holley用此法测定酵母丙氨酸tRNA序列耗时达数年之久。

随后发展了与DNA测序类似的直读法，但仍不如DNA测序容易，因此，常将RNA反转录成互补DNA（cDN