华南理工大学-西华大学.docx

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附件1

西华大学

“大学生创新创业训练计划”

项目申报书

学校名称：

西华大学

基于智能工程的食品枯草芽孢

项目名称：

项目类型：

杆菌高密度发酵过程控制

□创新训练项目√

□创业训练项目

□创业实践项目

负责人：

赵钺沁

指导教师：

刘 义

申报日期：

二〇一五 年五月

西华大学教务处 制

填 写 须 知

一、项目分类说明：

1.创新训练项目是本科生个人或团队，在校内导师指导下，自主完成创新性实验方法的设计、设备和材料的准备、实验的实施、数据处理与分析、总结报告撰写等工作。

2.创业训练项目是本科生团队，在校内导师指导下，团队中每个学生在项目实施过程中承担一个或多个具体的角色，通过编制商业计划书、开展可行性研究、模拟企业运行、进行一定程度的验证试验，撰写创业报告等工作。

3.创业实践项目是学生团队，在学校导师和企业导师共同指导下，采用前期创新训练项目（或创新性实验）的成果，提出一项具有市场前景的创新性产品或者服务，以此为基础开展创业实践活动。

二、申报书请按顺序逐项填写，填写内容必须实事求是，表达明确严谨。

空缺项要填“无”。

三、申请参加大学生创新项目人数含负责人在内不超过5名，创业训练、创业实践项目人数含负责人在内不超过6名。

四、表格中的字体小四号仿宋体，1.5倍行距；需签字部分由相关人员以黑色钢笔或水笔签名。

均用A4纸双面打印，于左侧装订成册。

五、OA推荐上报计划项目

项目名称

起始时间：

2015年 9月

项目类型

（√）创新训练项目 （ ）创业训练项目 （ ）创业实践项目

申请经费

起止时间

年 月 至 年 月

负责人

姓名

年级

学院

学号

联系电话

E-mail

赵钺沁

2013

食品与生物

工程学院

3120130503114

18408248

514

2567739059@

项目组成员

米粱波

2013

食品与生物

工程学院

3120130503118

15198208

397

1107657607@

指导教师

姓名

刘义

职务/职称

讲师

所在单位

食品与生物工程学院

联系电话

15108389732

E-mail

myputer@

校外导师

姓名

职务/职称

所在单位

联系电话

E-mail

11

一、项目简介（包括自身/团队具备的知识、条件、特长、兴趣、前期准备、项目可行性分析等）

枯草芽孢杆菌是一种食品安全菌，在食品基因工程领域具有重要的应用。

当前，许多食品上重要的微生物蛋白或酶类都是由枯草芽孢杆菌生产的，要实现商业化生产，除了构建重组菌株、摇瓶规模的培养基和条件优化以及相应生理生化分析外，在实验室小型发酵罐乃至工业生产规模下，开展相应的发酵过程优化和控制研究并在此基础上建立集成型、智能型以及稳定高效的目标蛋白生产表达的控制工艺具有十分重要的意义。

近年来，关于如何结合控制工程、智能工程提高枯草芽孢杆菌生产外源蛋白的发酵性能成为研究的热点。

高细胞密度发酵（highcelldensitycultivation，HCDC）是指在一定条件和培养体系下，获得最多的细胞量，由此更多地或更高效地获得目的产物。

即利用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著提高，最终提高产物的比生产率（单位体积单位时间内产物的产量）。

实现高密度发酵不仅可以减少培养体积，强化下游分离提取，还可以缩短生产周期、减少设备投资，从而降低生产成本。

在工业生产微生态中受原材料和其他成本的控制，大家都把高密度发酵引进到实际生产中。

现在高密度发酵技术不仅是控制成本的关键，也是每个公司技术实力的象征。

本人及团队是食品与生物工程学院大二学生，学习过微生物、生物化学、发酵工程、生化工程、酶工程等完成此项目必备的知识；并且对于微生物发酵生物，尤其是结合诸多数学算法、控制论

等多学科交叉的智能型发酵控制非常感兴趣。

项目拟在具有江南大学发酵工程专业博士学位的刘义老师的指导下完成。

刘老师在酶学、发酵工程、智能控制领域有着丰富理论和积累。

刘老师已共发表11篇SCI，第一作者4篇SCI。

食品与生物工程也具备相应的硬性条件，因此本项目具有可行性。

二、项目方案（包括计划、技术路线、人员分工等）

项目内容：

高密度发酵枯草芽孢杆菌技术控制

高生产率和高细胞密度发酵生物技术研究者追求的两个主要目标，一是新型生物产品的开发，另一就是为传统的或新生生物产品，寻求更经济的生产方式。

而我们研究的重点是第二种。

1培养基的设计与优化

目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。

培养基设计的基本步骤是：

①根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分；

②通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；

③当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。

这些实验往往基于多因子实验，包含均匀设计、正交实验设计、响应面分析等。

1.1枯草芽孢杆菌生长环境的优化

要提高细胞密度和生产率，首先需要对微生物生长的物理和化学环境进行优化，包括生长培养基的组成，培养物理参数（pH、温度和搅拌）及产物诱导条件。

优化这些参数的目的在于保证细胞生长处于最适的环境条件之下，避免营养物过量或不足、防止产物降解以及减少有毒产物的形成。

1.2培养基组成的优化

培养基中通常含有碳（能）源、氮源，以及微营养物如维生素和微量元素，这些营养物的浓度与比例，对实现生产枯草芽孢杆菌的高密度发酵是很重要的。

例如，枯草芽孢杆菌发酵液含菌量的

3个重要因子依次为玉米粉、碳酸钙和豆饼粉。

调整培养基中各物质的配比,可以改善细菌的生长条件,提高发酵液含菌量。

1.3特殊营养物的添加

比如玉米浆，它主要成分是氨基酸和多肽类,还有丰富的维生素和生长因子,玉米浆的总氮量约

为2.5%～4.5%，氨基氮含量为0.6%～1.8%,氨态氮含量为0.3%～0.7%,还原糖含量1.2%～11%，乳酸含量5%～15%，醋酸等挥发酸含量0.1%～0.3%，灰分含K、Mg、Ca、Fe、P等无机元素，含量达9%～12%，其中溶磷按干物质计，可以达到2000～17000γ/g，这些营养物质为枯草芽孢杆菌前期生产提供很好的氮源和生长促进剂。

2培养模式

由于许多营养物在高浓度下对细胞有抑制作用，而为了达到高细胞密度，又必须供给大量的营养物质，因此，浓缩营养物必须以与其消耗速率成比例的速度加入反应器中。

为此产生了多种形式的补料策略，它可以简单到线性补料，也可以复杂到利用数学模型计算得出的策略来控制补料速率。

具体来说，培养模式的选择主要依赖于以下三个因素∶

（1）所培养细胞的具体代谢行为；

（2）利用抑制性底物合成目的产物的潜力；（3）诱导条件以及测量细胞培养各项参数的能力。

2.1分批补料发酵

补料分批发酵是指在微生物分批发酵过程中，以某种方式向发酵系统中补加一定物料，但并不连续地向外放出发酵液的发酵技术，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术。

补料分批发酵和传统的分批发酵相比，流加发酵可以解除底物抑制、葡萄糖效应、代谢阻退等问题，得到较高的转化率、染菌和退化的概率小、对发酵过程可实现优化控制等优点。

2.2枯草芽孢杆菌发酵中碳源、氮源、和无机盐流加控制

目前,生产上枯草芽孢杆菌的发酵培养基配方的主要成分有玉米粉、葡萄糖、豆饼粉、鱼粉以及其它一些微量元素。

但由于配比的不合适使得发酵液含菌量不高。

发酵培养基的成分对微生物发酵液含菌量有很大的影响。

调整培养基中各物质的配比,可以改善细菌的生长条件,提高发酵液含菌量，一般工业培养枯草芽孢杆菌会流加玉米粉，不会像葡萄糖等快速利用的碳源分解产生阻遏效应。

在高密度发酵中培养基氮源多采用一些无机氨盐，发酵中氨盐浓度的变化不仅与菌体的生长息息相关，而且会影响表达产物的合成。

发酵中氨盐浓度应保持在一个合适的范围内，过高过低的无机氮含量都会不利于蛋白酶的分泌。

因此，也会影响到枯草芽孢杆菌的增殖，所以，高密度发酵过程中，进行无机氨态氮的监测具有非常重要的意义，可以通过控制发酵过程中氨基氮的含量，改善并提高蛋白酶的表达。

要求控制的主要工艺参数有培养液温度、搅拌速度、培养液的pH值和溶解氧（DO）浓度以及培养罐内的压力、液位等等。

这些工艺参数的控制中pH值和DO浓度尤为重要。

溶氧浓度是高密度发酵过程中影响菌体生长的重要因素之一。

枯草芽孢杆菌的生长代谢过程

需要氧气的参与，溶解氧浓度对菌体的生长和产物生成的影响很大，溶解氧的浓度过高或过低都会影响细菌的代谢。

在高密度发酵过程中，由于菌体密度高，发酵液的摄氧量大，一般通过增大搅拌转速和增加空气流量及培养罐压力以增加溶氧量。

随着发酵时间的延长，菌体密度迅速增加，溶氧浓度随之下降。

因此在高密度发酵的后期，需要维持较高水平的溶氧浓度。

稳定的pH值是使菌体保持最佳生长状态的必要条件。

由于外界的pH值变化会改变菌体细胞内的pH值，从而影响细菌的代谢反应，进而影响细胞的生物量。

传统微生物发酵过程中借助于外加酸性或碱性物质来调节pH值，容易引起培养液局部pH值过高或过低并造成渗透压增加。

因此在高密度发酵过程中采用DO和PH与补料关联来控制DO和PH值是一种较好的方法。

DO低于某一个范围时可以通过控制补碳源的量来控制DO的恶化，当DO高于某个范围时则可以提高碳源的补加量；同样当PH低于某一个范围时减少流加碳源的量或是增加氮源量来调节PH，高于某一个范围时则可以提高补碳量或是减少补氮量。

碳酸钙是多数芽孢杆菌发酵培养基中不可缺少的一种成分,对发酵液含菌量的变化有显著影响效应,与多数研究报道相符。

碳酸钙的主要作用可能是促进芽孢的形成和调节培养基pH值，但也有报道称钙离子增多会使枯草芽孢杆菌更容易感染噬菌体，所以碳酸钙在培养基中的含量是要通过大量实验找出其中的平衡点，也有研究表明，后期流加碳酸钙效果更好。

3发酵过程的智能控制

一个好的流加控制系统必须避免两种倾向∶一是流加过量，补料组分在反应器中积累从而对细胞生长和产物形成产生抑制；二是流加不足，这可能会导致细胞必需营养物的缺乏。

计算机技术的迅猛发展，为流加培养的控制提供了更有效的手段。

近年来，应用计算机技术来监测和控制发酵过程的研究屡见报道。

由于现代计算机技术的帮助，人们能够采用多种生长参数和数学模型来控制流加培养中营养物的添加，从而使复杂的控制系统得以实现。

在各种人工智能技术中，模糊推理是应用最广的一种。

模糊逻辑控制部分依赖于数学生长模型，也采用“语言定义的规则系统”来帮助系统响应发酵过程的非线性和动态行为。

图1反馈控制

经过的发酵经验积累，指数流加法是高密度发酵有效方法之一。

根据生化动力学monod方

程得出流加模型，流加速度与菌体的比生长速率，限制性底物浓度有密切的联系。

工业上采用这种方法获得了非常好的效果。

基于此，提出了枯草芽孢杆菌指数流加策略，预期会大大量提高发酵制剂的生物量。

支持向量机

图2支持向量机判别发酵过程关键因子的分类

温度=15 甘油=15% DO=30%

图3结合SVM向量机模糊控制枯草芽孢杆菌发酵过程

采用支持向量机的优点：

1）采用支持向量机（SVM）算法构建分类器，能够有效避免过训练的问题，提高分类器的泛化能力；2）将两个独立的SVM分类器按照二叉树结构组合，用来识别发酵过程的三种状态模式；3）采用模糊推理的方法确定报警界限/阈值，最终确定发酵状态的类

别。

对高密度发酵原料，物质和水电成本，操作人员进行成本核算。

根据实际产量和经济效益两方面确定相对合适的工艺条件，枯草芽孢杆菌的高密度发酵关键技术研究。

采用 Matlab线性优化方法（linprog）获得最佳的发酵成本与生物量配比，综合考量获得最大的经济效益。

人员分工：

A枯草芽孢杆菌高密度发酵培养基的设计与优化

B枯草芽孢杆菌高密度发酵培养模式的设计与优化

C枯草芽孢杆菌高密度发酵发酵过程的智能控制

三、项目特色与创新点

本项目将控制工程和数学工程的前馈控制、支持向量机结合模糊控制的智能控制方法应用在食品工程领域枯草芽孢杆菌的高密度发酵过程控制。

当前，将智能工程结合食品枯草芽孢杆菌的高密度发酵只有零星的报道。

将工艺优化和控制工程结合将会很大程度上提高我院在食品发酵领域的水平。

四、项目进度安排

年度计划：

2015.9-2016.9

枯草芽孢杆菌高密度发酵培养基和培养模式的设计与优化

2016.9-2017.9

枯草芽孢杆菌高密度发酵发酵过程的智能控制

五、项目经费预算

科目名称

预算经费

（单位：

万元）

备注（预算依据与说明）

实验材料

1.8

高密度发酵培养基，各种微量元素，生长因子，控制工程理论书籍；菌种、载体、

分子生物学试剂购买等

文章发表

0.2

文章发表费

六、项目完成预期成果

1掌握高密度发酵工艺；

2掌握控制工程的基本思想和应用

3发表中文核心1-3篇

七、项目责任人承诺

在获得立项后，本人将与项目组成员团结一致，努力做好该项目的研究工作，实现制定的目标。

如果因主观原因导致项目执行不力，未达到预期目标，本人与项目组成员愿意承担相应损失。

负责人签名：

年 月 日

八、指导教师意见：

签

名：

年

月

日

九、申报单位意见：

签名盖章：

年

月

日

十、学校审核意见：

审核盖章：

年

月

日