微生物工程重点纲要Word文档下载推荐.docx
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（2）按发酵形式来区分•固态发酵、深层液体发酵
（3）按发酵产物区分•氨基酸发酵、有机酸发酵•抗生素发酵•酒精发酵•维生素发酵•酶制剂发酵
（4）按发酵工艺流程区分•分批发酵•连续发酵•流加发酵
（5）按发酵过程中对氧的不同需求来分•厌氧发酵•通风发酵
8发酵产品的类型
工业上的发酵产品，有四个主要类别：
以菌体为产品、以微生物的酶为产品、以微生物的代谢产物为产品、生物转化过程-----将一个化合物经过发酵改造化学结构工业生产的微9生物菌体，可分为二种：
1·
供制备面包用的酵母；
2·
作为人类或动物的食物的微生物细胞（单细胞蛋白质）
10微生物的酶
工业上，曾由植物、动物和微生物生产酶。
微生物的酶可以用发酵技术大量生产，是其最大的优点。
比如淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶等
11.初级代谢产物：
氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、脂类和碳水化合物等。
次级代谢产物：
有些微生物的稳定期培养物中所含有的化合物，并不在营养期时出现，而且未见到对细胞代谢功能有明显的影响。
例如，抗生素。
二、发酵工业的发展简史
1.天然发酵阶段（古代～1900年）
2.纯培养技术的建立（1905年～）
3.通气搅拌发酵技术的建立（1940年～）
4.开拓发酵原料时期（1960年～）
5.基因工程阶段（1979～）
1.第一个阶段（19世纪以前）
产品只限于含酒精饮料和醋；
古埃及已经能酿造啤酒；
17世纪能在容量为1500桶（一桶相当于110升）的木质大桶中进行第一次真正的大规模酿造；
在1757年已应用温度计；
1801年就有了原始的热交换器；
18世纪中期，证实了酒精发酵中的酵母活动规律；
18世纪后期，Hansen在Calsberg酿造厂建立酵母纯种培养技术；
在20世纪初，在酿酒和制醋工业中已建立起过程控制的概念。
2.第二个阶段（1900年~1940年）
主要的新产品是酵母、甘油、柠檬酸、乳酸、丁醇和丙酮；
在面包酵母的生产中首先采用了分批补料培养技术；
在一次大战时，Weizmann开拓了丁醇丙酮发酵，并建立了真正的无杂菌发酵
3.第三个阶段（1940年以后）
这一阶段的标志是，在纯种培养技术下，以深层培养生产青霉素；
解决向培养基中通入大量无菌空气和高粘度培养液的搅拌问题
4.第四个阶段（1960年以后）
以烃为碳源生产微生物细胞作为饲料蛋白质的来源；
出现了不需要机械搅拌的高压喷射和强制循环的发酵罐；
工业上普遍采用分批培养和分批补料培养法
5.第五个阶段（1979年以后）
这个阶段以基因工程产品的生产为标志。
目前，世界上已经批准上市的基因工程药物就有几十种，如：
胰岛素、人生长激素等等。
6.现代生物技术的发展
★1974年Boyer和Cohen：
基因转移
★1975年Kohler和Milstein：
杂交瘤技术
★1977年Boyer：
基因操作与克隆技术
★1978年Gilbert：
鼠胰岛素克隆
★众多基因工程药物
第二章菌种的来源及选育
1、微生物的特性
有些微生物能在厌氧的条件下生长、有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身
的生长、有些微生物能进行复杂的代谢、有些微生物能利用较复杂的化合物、有些微生物能在极端的环境下生长
二、微生物的特点
体积小；
种类多；
分布广；
繁殖快；
便于培养；
容易发生变异；
在生产中不易受时间、季节、地区的限制
三、发酵工业常用微生物的形态特征
球形、杆形、弧形、螺旋形、
菌落：
指微生物细胞在一定条件下，在固体培养基表面形成的肉眼可见的微生物群体。
若来自一个细胞，则为纯培养或称克隆。
菌苔：
大量细菌的菌落连成一片。
四、工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物；
有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强；
遗传性能要相对稳定；
不易感染它种微生物或噬菌体；
产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）；
生产特性要符合工艺要求
一、发酵工业微生物菌种
微生物发酵生产水平由三个因素：
生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件和生产设备。
二、菌种的制备原理和方法
菌株获得的主要方法：
向菌种保藏机构索取；
从自然界分离筛选;
从某些发酵制品中分离
从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处：
经济性、指导性
从自然界筛选目标菌株的方法与步骤
含微生物样品的采集（土壤）；
（含微生物样品的富集培养）；
微生物的分离；
野生型目的菌株的筛选；
鉴定
微生物的分离划线法；
稀释涂布法
三、从自然界筛选目标菌株的方法与步骤：
样品的采集、富集培养、分离、野生型目的菌株的筛选、鉴定。
目的微生物富集的一些基本方法
富集的目的：
让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。
第三节菌株选育、分子改造
一、方法基因突变：
自然选育、诱变育种
基因重组：
杂交、原生质体融合、基因工程
基因的直接进化：
点突变、易错PCR、同序法等
1、自然选育
自然突变有两种情况：
一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰
退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。
另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。
自然选育操作步骤：
单细胞（孢子）悬液的制备；
平板分离；
挑选单菌落（注意形态的观察）；
发酵试验
2、诱变育种
目的：
提高目的物产量；
改善菌种特性、提高产物质量；
简化工艺条件；
开发新品种
用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种。
诱变剂：
能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂；
物理：
紫外线，快中子，射线
化学：
硫酸二乙酯，亚硝基胍
2、诱变育种基本步骤
①出发菌株的选择:
具备一定生产能力或某种有利性状；
纯种；
已发生过其他突变；
对诱变剂敏感的增变变异株；
②出发菌株的纯化③单细胞悬液的制备；
④诱变剂及诱变剂量的选择⑤诱变处理方式（单因子、复合因子）⑥诱变菌株的筛选
3、筛选的方法随机筛选形态筛选生化筛选
三、原生质体育种和基因组改组育种
1、原生质体的特征对外界变化更敏感；
对诱变剂更敏感；
对某些噬菌体失去敏感；
2、原生质体再生育种①出发菌株的选择②菌体的活化③原生质体的制备④原生质体再生⑤菌株的分离⑥筛选
3、原生质体诱变育种原生质体技术＋诱变育种技术
出发菌株的选择；
菌体的活化；
原生质体的制备；
诱变育种；
原生质体再生；
菌株的分离；
筛选
4、原生质体转化技术整条染色体DNA、片段DNA或者质粒DNA转化原生质体获得转化子的育种技术；
转化；
筛选
5、原生质体融合技术两亲株原生质体混合于高渗透压的稳定剂中，在促融剂的诱导作用下，接触融合成异核体，经核融合成杂合二倍体，再经染色体交换产生重组体，称融合子；
物理方法：
电融合、激光融合
化学方法：
PEG
出发菌株的选择（具有较大遗传差异的近亲菌株）；
原生质体融合；
四、基因工程育种基因工程育种是指重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌（细胞），实现遗传物质的重新组合，并使得目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术；
1、主要步骤目标DNA的获得；
目的基因与载体的重组；
将重组基因转入宿主细胞；
重组子的筛选
2、基因工程菌的发酵特性不稳定性：
重组质粒发生DNA片段脱落；
质粒丢失；
表达产物不稳定；
应对措施：
施加选择压力；
控制基因过量表达；
控制培养条件
第4节菌种的保藏
1、菌种的退化和防止
菌种退化：
菌株由于移接传代或保藏之后，群体中某些生理特征或形态特征逐渐减退或完全丧失的现象，主要表现为生长速度变慢和目标产物生产能力的下降；
防止退化的方法：
尽量减少传代；
经常进行纯化；
创造良好的培养条件；
单核细胞的移植传代；
采用有效的保藏方法；
2、菌种的复壮
在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找到尚未衰退的个体，以达到恢复该菌种原有性状的措施；
方法：
纯种分离（单细胞分离）；
淘汰法；
3、工业微生物菌种的保藏
1、斜面保藏法；
2、液体石蜡油保藏法；
3、真空冷冻干燥保藏法；
4、液氮超低温保藏法；
5、甘油低温保存；
第三章微生物的代谢调节与代谢工程
现代发酵工业要研究的主要是通过改变培养条件和遗传特性，使微生物的代谢途径改变或代谢调节失控而获得某一发酵产物的过量产生。
分为两类：
改变产生菌的基因型而改变代谢途径；
改变控制代谢速率，即影响基因型的表达
代谢调节是指微生物的代谢速度和方向按照微生物的需要而改变的一种作用。
微生物代谢的控制是指运用人为的方法对微生物的代谢调节进行遗传改造和条件的改变，以期按照人们的愿望，生产有用的微生物制品。
一、代谢调节的方式
1、细胞透性的调节细胞质膜的透性直接影响物质的吸收和代谢产物的分泌，从而影响到细胞内代谢的变化。
细胞质膜的透性的调节是微生物代谢调节的重要方式，由它控制着营养物质的吸收。
2、代谢途径区域化微生物细胞结构虽然简单，但也划分出不同的区域，对于某一代谢途径有关的酶系则集中某一区域，即代谢活动是区域化的，以保证这一代谢途径的酶促反应顺利进行，避免了其他途径的干扰，其实质是控制酶与底物接触，使各个反应有序地进行。
3、代谢流向的调控微生物在不同条件下可以通过控制各代谢途径中某个酶促反应的速率来控制代谢物的流向，从而保持机体代谢的平衡。
它包括两种形式：
（1）由一个关键酶控制的可逆反应同一个酶可以通过不同辅基（或辅酶）控制代谢物的流向。
例如，谷氨酸脱氢酶以NADP+为辅酶时，主要是催化谷氨酸的合成，当以NAD+为辅酶时，则催化谷氨酸的分解。
因此微生物可以通过不同的辅基来控制代谢物的流向；
（2）由两种酶控制的逆单向反应逆单向反应是在生物体代谢的关键部位的某些反应，它是由两种各自不同的酶来催化的。
即在一个“可逆”反应中，其中一种酶催化正反应，而另一种酶则催化逆反应。
例如，葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖是由己糖激酶催化的
，而其逆反应则是由6-磷酸葡萄糖酯酶催化的。
6-磷酸果糖转化为1，6-二磷酸果糖是由磷酸果糖激酶催化的，逆反应则由1，6-二磷酸果糖酯酶催化。
4、代谢速度的调控在不可逆反应中，微生物通过调节酶的活性和酶量来控制代谢物的流量。
微生物在不同条件下能按照需要，通过激活或抑制原有酶的活性或通过诱导或阻遏酶的合成来自我调节其代谢速度，使之高度经济有效地利用能量和原科进行生长繁殖。
2、初级代谢的调节
（一）提高初级代谢产物产量的方法
1、使用诱导物；
2、除去诱导物——选育组成型产生菌；
3、降低分解代谢产物浓度，减少阻遏的发生；
4、筛选抗分解代谢阻遏突变株；
5、筛选抗生素抗性突变株；
6、选育条件抗性突变株
三、微生物的次级代谢
（一）次级代谢的概念是指微生物在一定的生长时期（一般是稳定生长期），以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动没有明确功能的物质的过程。
这一过程的产物即为次级代谢产物。
（二）根据产物的作用区分类型抗生素；
激素；
生物碱；
毒素；
色素；
维生素
次级代谢产物的合成是以初级代谢产物为前体，进入次级代谢产物合成途径后，大约经过三个步骤，合成次级代谢产物：
前体聚合：
前体单元在合成酶催化下进行聚合；
结构修饰：
聚合后的产物再经过修饰反应如环化、氧化、甲基化、氯化等；
不同组分的装配。
（四）次级代谢的调节
1、次级代谢物合成的特点次级代谢物合成过程远较初级代谢产物复杂；
次级代谢产物则需要复杂的营养条件；
在分批培养条件下，次级代谢产物一般都是在菌体生长的峰值出现后才大量合成。
2、提高次级代谢产物产量的方法
（1）补加前体类似物在合成途径已基本清楚的条件下，向发酵培养基中补加前体是增加次级产物的有效方法。
（2）加入诱导物把一些对次级代谢产物产生有诱导作用的物质加入发酵培养基中会增加产量。
（3）筛选耐前体或前体类似物的突变株加入前体有提高次级产物产量的效果；
但过量对菌体又会有毒。
筛选对前体育抗性的突变株以减少或消除前体的反馈阻遏，从而可获得高产。
（4）选育抗抗生素突变株
4、高浓度微生物的培养
微生物液体发酵大都采用分批培养，其缺点是：
发酵液中最终细胞浓度不高。
高浓度的细胞会产生高浓度的发酵产物，提高发酵设备的利用率，降低生产成本。
高浓度细胞培养的方法流加培养、高细胞浓度连续培养、菌体循环利用等
1、流加培养优势：
实现对发酵过程的控制，如控制代谢途径、菌体比生长速率等；
无需增添设备；
解除底物抑制；
解除分解代谢阻遏；
解除葡萄糖效应
流加培养的控制方式：
恒速流加、变速流加、指数流加
2、高浓度细胞连续培养
无菌培养基以一定速度连续补入发酵液，同时采用离心、膜过滤等方法，回收排出液中的细胞，使之重新进入发酵液中，这样微生物就可以在发酵液中高浓度地积累。
高浓度的细胞产生大量的发酵产物，这些产物随排出液排出进入提取过程，同时对细胞生长起抑制作用的代谢产物也被排出。
3、菌体循环利用分批发酵终了将菌体与发酵液分离，收集的菌体经去杂菌等处理后返回发酵罐，再加入无菌培养基进行第二批发酵，因发酵液中菌体浓度很高，故发酵时间可大大缩短。
第二批发酵终了，进行同样处理，然后再开始第三批发酵；
这种技术与前面所述两种技术原理不同，但也能起到缩短发酵时间、提高设备利用率的作用。
第四章培养基的制备与灭菌
培养基：
是指一切可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料，也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。
发酵培养基的作用：
满足菌体的生长促进产物的形成
发酵培养基的要求
①培养基能够满足产物最经济的合成；
②发酵后所形成的副产物尽可能的少；
③培养基的原料应因地制宜，价格低廉；
且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应；
④所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。
第一节培养基的类型及功能
培养基按其组成物质的纯度、状态、用途可分为三大类型
一、按纯度
合成培养基:
原料其化学成分明确、稳定适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律；
培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业生产；
天然培养基:
采用天然原料原料来源丰富（大多为农副产品）、价格低廉、适于工业化生产；
原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性。
二、按状态
固体培养基:
适合于菌种和孢子的培养和保存;
半固体培养基:
主要用于微生物的鉴定。
液体培养基:
是发酵工业大规模使用的培养基。
三、按用途（从发酵生产应用考虑）
培养基按其用途可分为孢子（斜面）培养基、种子培养基和发酵培养基三种。
第二节发酵培养基的成分及来源
五大元素：
一、碳源
提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分；
提供合成目的产物所必须的碳成分。
2、来源糖类、油脂、有机酸、正烷烃。
二、氮源
氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。
1、无机氮源
种类：
氨盐、硝酸盐和氨水
特点：
吸收快，速效氮源。
但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化
无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质。
若微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺；
若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。
所以选择合适的无机氮源有两层意义：
满足菌体生长；
稳定和调节发酵过程中的pH。
无机氮源的影响：
硫酸铵>
硝酸铵>
硝酸钠>
尿素
三、无机盐和微量元素
1、作用：
酶活中心的组成部分；
维持生物大分子和细胞结构的稳定性；
调节并维持细胞的渗透压平衡；
控制细胞的氧化还原电位；
作为某些微生物生长的能源物质。
2、来源：
C、N源，以盐的形式补充
3、用量：
根据具体的产品，以实验决定。
四、生长因子、前体、产物促进剂和抑制剂
1、生长因子凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基
酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。
2、前体前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。
作用：
前体有助于提高产量和组份
3、产物促进剂产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。
4抑制剂：
能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白质变性的物质；
可用透析或超滤的方式去除；
五、水水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性
固体、污染程度以及矿物质组成和含量。
6、发酵工业原料的选择原则
因地制宜，就地取材；
营养丰富，浓度恰当；
资源丰富，容易收集；
易于储藏；
理化性质稳定，成分间无反应；
不影响通气、搅拌、产物分离，废物处理方便；
不含毒副作用的物质；
价格低廉。
七、原料的预处理和加工
淀粉质原料的预处理和加工
预处理：
原料除杂、粉碎；
加工：
液化淀粉→糊精、低聚糖；
糖化产生葡萄糖
淀粉颗粒受热并吸水膨胀，体积迅速增大，固态结构被破坏，形成粘稠的液体，称为糊化；
糊化的淀粉在酶的作用下，分子链被切断，相对分子量变小，粘度迅速降低的过程称为液化；
经液化后的料液中加入一定量的糖化酶（葡萄糖淀粉酶），使糊精或低聚糖水解为葡萄糖，称之为糖化。
第3节发酵培养基的设计和优化
一、培养基成分选择的原则
根据生产菌株的营养特征配置培养基；
营养成分的配比适当（合适的C、N比）；
渗透压适宜；
pH值适当；
各成分的加入次序及步骤适当
二、培养基设计和优化步骤
①根据前人的经验和培养基成分初步确定可能的培养基成分；
②通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；
③各成分最适的浓度（正交实验设计）。
第四节培养基及设备的灭菌
一、常见灭菌方法：
高温灭菌、过滤灭菌、辐射灭菌、化学灭菌、熏蒸灭菌
1、高温灭菌
1）干热灭菌烘箱内热空气灭菌：
160℃，2小时或火焰灼烧
2）湿热灭菌巴斯德消毒、煮沸消毒、间歇灭菌（丁达尔灭菌）、常规高压灭菌：
121℃，15分钟；
115℃，30分钟；
2、过滤除菌对不耐热液体培养基和空气灭菌进行过滤除菌；
硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜
3、辐射灭菌紫外线：
诱导核酸形成胸腺嘧啶二聚体，从而干扰了核酸的复制；
X射线和γ射线能使其它物质氧化或产生自由基破坏和改变生物大分子的结构，以抑制或杀死微生物。
4、化学药品灭菌：
杀菌剂、消毒剂、防腐剂；
高锰酸钾、漂白粉、乙醇、双氧水
5、熏蒸灭菌：
甲醛硫磺
二、发酵培养基灭菌
实罐灭菌（实消）（分批灭菌）
优点：
设备简单、投资少、灭菌效果可靠。
不足：
耗时长、罐利用率低、培养基营养成分破坏较多。
连续灭菌（连消）
优点：
设备体积小、杀菌所需时间短、对营养物质的破坏少；
不足：
设备复杂，投资较大。
套管式加热器
又称塔式加热器；
由多孔的蒸汽导管和外套管组成；
一般塔有效高度2－3m，
料停留时间20－30s；
设备高大，噪声大。
喷射式加热器
预热的料由泵从进料口打入，饱和蒸汽由物料管外的环隙打入，二者瞬间混匀并达到灭菌温度，挡流板加大其混匀效果；
结构简单、占地面积小，噪音小，运行稳定；
需注意物料管与喷嘴口的同心问题。
第五章发酵工艺的控制
一、温度变化及其控制
温度对生长的影响不同微生物的生长对温度的
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