完整版海岛棉GbMFT2基因在烟草中的遗传转化毕业设计Word格式.docx
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Abstract:
Angiospermsharingaconservedphosphatidylethanolamine-bindi-
ng(PEBP)domainhavebeenshowntobeinvolvedinthecontroloffloweringtime.Thefamilyisdividedintothreesubfamilies,FT-like,TFL1-likeandMFT-like.EvolutionanalysisshowedthatMOTHEROFFTANDTFL1(MFT)istheancestralformofallPEBPgenesinplant,GbMFT2genehasaPEBPconservedmotif.InconsistencywithalmostallMFT-likeproteins,GbMFT2hasaconservedprolineresidueneartheC-terminussimilaritiessimilarwithAtMFTandtheyallbelongtothesameclade.Exogenousabscisicacid(ABA)ofdifferentconcentrationsresultedinsignificantchangeinGbMFT2expressioningerminatingseeds,indicatingthattheexpressionofthisgeneisregulatedbyABA.Tofurtherstudythefunctionofthegene,Itransformedtheover-expressionvectorofp35S:
GbMFT2intotobacco.7p35S:
GbMFT2transformedtobaccoplantswereacquired.Analysisshowedthatthep35S:
GbMFT2transformedtobaccoshowedlatterflowerphenotypethannon-transgenicwildtypeplants.Besides,throughsalttoleranceanalysisIfoundthatthep35S:
GbMFT2transformedtobaccoshowedstrongersalttolerancethannon-transgenicwildtypeplants.SointhefurtherwecanusetheGbMFT2geneforregulatingthetimeoftheflowersandthesalttoleranceofthecrops.
Keyword:
PEBPfamily;
GbMFT2gene;
salttolerangce;
lateflowering
前言
金鱼草CENTRORADIALIS(CEN)基因的突变造成正常的无限花序被破坏,茎端形成顶花,克隆研究表明CEN蛋白与动物的磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine-bindingproteins,PEBP)很相似[1]。
利用CEN基因作为异源探针从拟南芥中克隆了一个同源基因TERMINALFLOWER1(TFL1),tfl1突变体开花提早,顶端分生组织由无限生长变成有限生长,表明TFL1具有维持顶端分生组织无限生长的能力[2]。
FLOWERINGLOCUST(FT)是拟南芥中的一个开花位点的控制基因,FT和TFL1氨基酸序列相似性为71%,二者同属PEBP基因家族[3]。
FT和TFL1蛋白晶体结构分析表明二者高度相似,形成一个包含阴离子结合位点的口袋,口袋入口处的关键氨基酸对于FT和TFL1功能的转变起着重要作用[4]。
TFL1的His88/Asp144在结合口袋的入口处形成氢键,而FT的Tyr85/Gln140不能形成氢键,这在决定蛋白的特定功能上起着关键作用,把这个口袋里的单个氨基酸改变,就可以使FT变成TFL1,相反也是这样[5]。
拟南芥基因组的PEBP基因家族还包括ArabidopsisthalianaCENTRORADIALIS(ATC)、BROTHEROFFTANDTFL1(BFT)、MOTHEROFFTANDTFL1(MFT)和TWINSISTEROFFT(TSF)[6]。
系统进化研究表明,PEBP家族基因主要分为MFT-like,FT-like和TFL1-like3个亚家族,该基因家族成员起着开花促进因子或开花抑制因子的作用。
FT是一个开花促进因子,它整合来自不同途径的信号从而控制开花,已经证明FT蛋白是一个从叶片到顶端分生组织的长距离运输信号,是拟南芥的成花素[11]。
水稻中的HEADINGDATE3a(Hd3a)是拟南芥FT的同源基因,Hd3a蛋白即水稻中的成花激素[7],Hd3a基因在叶片中表达并通过微管组织运输到顶端分生组织,同成花素受体14-3-3蛋白结合,然后又附着到另一种转录因子OsFD1上形成成花素激活复合体,使开花基因OsMADS15功能活跃起来[8]。
近年来研究发现,除了对开花的控制功能外,FT-like和TFL1-like还涉及到很多不同功能,如马铃薯块茎的形成、茎的伸长、杨树芽的休眠、顶端分生组织生长前的衰减[9]等。
相对于FT-like和TFL1-like基因,MFT-like基因的研究仍然很有限。
进化分析认为MFT是植物PEBP家族基因的祖先[10]。
MFT基因也具有促进开花的作用,但失去功能的mft突变体在正常生长条件下没有明显的表型[9]。
ABA和GA是种子适应外界环境的生物和非生物胁迫调节种子发芽的2个重要的拮抗激素,近年来的研究表明,MFT参与了ABA和GA信号通道在种子发芽过程中起着重要的调节作用[11]。
拟南芥MFT在种子萌发过程中的胚根和下胚轴的转变区特异表达,MFT的转录分别受到ABA信号通道中的2个关键的转录因子ABA-INSENSITIVE3(ABI3)和ABI5的调节,并且DELLA蛋白RGA-LIKE2(RGL2)可以明显地促进MFT的转录。
Hedman等[10]研究发现被子植物MFT-like含有两个亚家族:
A亚家族和B亚家族,A亚家族在双子叶植物和单子叶禾本科植物都存在,B亚家族仅在双子叶植物中存在,在MFT-like基因的进化过程中其中一类MFT-like基因发生了丢失,而A亚家族基因一般羧基末端都含有保守的脯氨酸残基Pro,B亚家族基因一般都含有保守的谷氨酸残基Glu。
棉花是重要的经济作物,开花早晚和产量、品质性状之间存在显著相关,并且影响霜前皮棉产量、纤维长度等。
相对于拟南芥和水稻等植物,棉花的PEBP基因家族的功能研究报道较少。
东锐等[12]从陆地棉中克隆了一个FT-like基因GhFTL1,该基因具有FT-like基因的结构,且在拟南芥中过量表达,长日照下明显的促进早花。
顾超等[13]从棉花中克隆得到了一个MFT类似基因并命名为GbMFT1,用不同浓度的ABA处理棉花种子发现GbMFT1基因的表达不受ABA的调节。
本研究从海岛棉中克隆得到了一个MFT类似基因并命名为GbMFT2,对棉花种子用不同浓度ABA胁迫,分析GbMFT2的表达情况,发现GbMFT1基因的表达受ABA的调节,此外,将过表达载体p35S:
GbMFT2叶盘法转入烟草,统计转基因烟草与野生型烟草的开花时间,并且进一步探索该基因的功能,对T2代转基因烟草进行盐胁迫处理,对其耐盐性进行分析,为进一步完善棉花PEBP基因家族的功能奠定了基础。
1.材料与方法
1.1实验材料
1.1.1植物材料
普通烟草(Nicotianatabacum)为本实验室保存。
1.1.2菌种、载体及试剂
含有重组质粒p35S:
GbMFT2的甘油农杆菌为本实验室保存;
TrisBase、EDTA、CTAB等生化试剂,均购自上海生工生物工程有限公司;
10×
ExTaqBuffer、2.5mmol/LdNTPMixture、rTaq酶、5×
PrimeScriptBuffer、RNaseInhibitor、PrimeScriptTranscriptase均购自TaKaRa公司;
Trizol试剂盒购自invitrogen公司;
DNA分子量Marker购自东盛公司;
所用引物均由北京华大基因有限公司合成。
1.1.3培养基
LB固体/液体培养基:
胰蛋白胨(Tryptone)10g/L;
酵母提取物(Yeastextract):
5g/L;
氯化钠(NaCl)10g/L,若配制LB固体培养基需加入15g/L琼脂粉(AgarA)。
若配制LB(Kan+Rif)双抗培养基,则需加入经过过滤灭菌的卡那霉素(Kan)和利福平(Rif)母液,使其工作浓度分别为50mg/L、25mg/L。
1/2MS培养基:
蔗糖(Sucrose)30.0g/L;
MS(Murashige&
SkoogMedium)2.2g/L;
MES0.5g/L;
琼脂(AgarA)8.0g/L。
MS培养基:
SkoogMedium)4.4g/L;
烟草培养基:
基本培养基MS(Murashige和Skoog1962),附加不同浓度的植物激素和抗生素,蔗糖含量为3%,琼脂粉含量为0.8%,pH5.8。
具体如表1:
表1植物培养基一览表(mg/L)
培养基类型
编号
6-BA
NAA
Carb
IAA
预培养培养基
MS1
2.0
1.0
选择分化培养基
MS2
0.1
300
选择生根培养基
MS3
1.1.4实验引物
表2引物序列及名称
引物名称
引物序列(5′→3′)
GbMFT2-F
GGGGTACCATGGCTGCCTCCGTTGATCCTCTCG
GbMFT2-R
CGGGATCCTCAACGCCTTCGGCTGACGGGCTCT
GbMFT2-RTF
CTTTGGTGATGACTGACCCTGATGC
GbMFT2-RTR
GTTGGAACAGCACCAGTATGTAGCG
UBQ7F
AGAGGTCGAGTCTTCGGACA
UBQ7R
GCTTGATCTTCTTGGGCTTG
1.2实验方法
1.2.1MFT蛋白序列的比对及分析
登录NCBI网站,通过blastp()比对获得其他物种的MFT蛋白序列;
使用Meg-Align软件,选择ClustalW方法进行比对分析,并保存为.msf格式文件,再用GeneDoc软件进一步分析处理。
1.2.2MFT家族蛋白系统进化树的构建
用MEGA5.10软件构建系统进化树[14]。
蛋白序列比对利用ClustalW程序进行,进化树利用Neighbor-Joining方法构建,其中进行1000次Bootstrap分析以使得分枝的结果更可靠。
1.2.3GbMFT2蛋白三维结构的预测
用同源模建法构建GbMFT2蛋白质三维结构[14],提交GbMFT2基因所编码的蛋白序列到SWISS-MODEL服务器()进行自动建模(AutomatedMode),即可得到其同源三维结构,下载其.pdb格式文件,并用Swiss-PdbViewer4.1.0软件进行进一步的构建和分析GbMFT2蛋白质的三维结构以及氢键。
1.2.4p35S:
GbMFT2在烟草中的遗传转化
1.2.4.1烟草种子的处理及萌发
70%酒精消毒2min,再加入20%NaClO消毒7min,水洗3次,最后一次留少量水,用移液器吸出,均匀点种在含有1/2MS培养基的平板上,至于暗培养箱中黑暗培养2天,再放入25℃光照培养箱培养,两个星期后将无菌烟草幼苗的转接到1/2MS培养基上,放入25℃组培室光照培养30天。
1.2.4.2叶盘法转化烟草
(1)将保存的含有重组质粒p35S:
GbMFT2的甘油农杆菌涂板:
取约10μL均匀涂布于含有Kan和Rif的双抗LB固体培养基上,28℃恒温箱培养48h,直至长出单菌落。
(2)农杆菌的活化:
从平板上挑取单菌落,接种到40ml含有Kan和Rif的双抗LB液体培养基上,置于28℃,200rpm摇床上,培养至OD600为0.6-0.8。
(3)活化的农杆菌侵染烟草:
将培养好的农杆菌菌液转入10ml离心管中,4℃,4000rpm离心5min收集菌体;
倒去上清,用MS侵染液悬浮菌体,200rpm振荡培养30min;
把无菌烟草叶片剪切成1cm2左右的小片放入悬浮液中,200rpm振荡培养浸染15min;
取出叶片,用无菌滤纸吸干菌液,置于含有MS1共培养培养基上,28℃培养箱暗培养两天。
(4)MS2培养基上形成愈伤组织:
将暗培养两天后的烟草叶片转入MS2选择培养基上,尽量使烟草愈伤浸入到培养基内部,25℃组培室培养约15天至愈伤形成。
(5)继代培养:
将形成愈伤组织的烟草叶片转入新的MS2选择培养基,培养约两周形成大量的丛芽。
(6)生根培养:
无菌操作的情况下,将侵染烟草叶片的愈伤组织再分化形成的芽用剪刀或镊子取下转入MS3生根培养基中进行生根培养2周。
(7)炼苗和移栽:
将已经生根的烟草和野生型烟草,去掉封口膜,在组培室内炼苗三天;
将驯化好的烟草植株,栽培到经过高压灭菌的土:
蛭石=1:
1的营养土里,做好编号,放入植物生长间培养8h光照和16h黑暗的光照培养间里培养。
1.2.5CTAB法提取DNA分子检测转基因植株
(1)取烟草的叶片约1cm2,用研磨棒充分研磨后,每管加入700µ
LCTAB提取缓冲液,65℃水浴30min,期间震荡3~5次;
加入等体积的氯仿,剧烈震荡之后,12000rpm,室温离心10min;
取上清,加入2倍体积的异丙醇,-20℃放置2小时,12000rpm,室温离心10min;
弃上清,加入0.5mL70%的乙醇洗涤两次,待充分吹干后加入50µ
LDEPC-H2O溶解DNA,-20℃保存。
(2)PCR扩增时,以叶片的DNA为模板,在20μL的反应体系中加入DNA模板2μL,10×
PCRBuffer2μL,dNTPmix(2.5mMeach)2µ
L,正反向引物(GbMFT2-F/GbMFT2-R,见表2)(10μM)0.5µ
L,0.2uLrTaqDNA聚合酶,ddH2O补齐。
PCR反应程序为:
94℃,2min,后94℃40s,55℃40s,72℃45s,35个循环后72℃延伸10min。
经琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
1.2.6棉花GbMFT2基因在ABA胁迫下的表达分析
(1)处理棉花种子:
分别播种在含不同浓度ABA(0、0.5、1、5和10μmolL–1)的1/2MS固体培养基,其成分含有1%的葡萄糖,2.2gL–1MS培养基(DuchefaBiochemieNetherland),0.05%的MES(Amersham,America),0.8%Agar,pH5.8。
将播种后培养皿放入28℃的恒温培养箱内培养,20h胚根已经伸出种壳,此时收集不同处理的棉花种子,并将棉花种子立即浸于液氮中,–80℃保存备用。
(2)提取烟草RNA:
100mg棉花种子经液氮研磨后加入抽提液1ml,65℃水浴10min,其间剧烈震荡2-3次;
4℃,12000rpm离心10min后,取上清加入等体积酚:
氯仿:
异戊醇(25:
24:
1),4℃,12000rpm离心15min;
取上清,加入等体积的氯仿,1/10体积的5mol/L醋酸钾(pH4.8),1/10体积的无水乙醇,混匀,4℃,12000rpm离心15min。
取上清,加入等体积的氯仿,4℃,12000rpm离心10min;
取上清,加入1/4体积的10mol/LLiCl,0℃过夜沉淀;
4℃,12000rpm离心15min后,弃上清,质量完好的RNA置于-80℃保存备用。
加入1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.2),2.5倍体积的无水乙醇,-70℃,沉淀至少30min;
离心4℃,13000rpm离心15min后,弃上清,70%乙醇洗沉淀2次;
干燥后用无RNAse的水溶解。
总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测。
(3)cDNA第一链的合成
参照TaKaRa公司提供的试剂盒将棉花组织总RNA反转录,获得cDNA第一链。
反应物
用量
RNA
4µ
L
Oligo(dT)18primer(0.5µ
g/µ
L)
1µ
DEPC-H2O
65℃,温育5min,冰上放置2min,再加入以下反应液
5×
M-MLVBuffer
2µ
dNTPMix(10mmol/L)
0.5µ
RNaseInhibitor(20U/µ
0.25µ
RNaseM-MLV(200U/µ
(5)半定量RT-PCR分析目的基因的表达情况:
基因特异引物是GbMFT2-RTF和GbMFT2-RTR,内参基因为ubiquitin7,进行半定量RT-PCR。
以UBQ7F和UBQ7R扩增内参,GbMFT2-RTF和GbMFT2-RTR为扩增目的基因的特异性引物。
PCR反应体系(20µ
L):
10×
PCRbuffer2µ
L、dNTPmix(2.5mMeach)2µ
L、引物-F/R(10μM)0.5µ
L、rTaq(5U/µ
L)0.2µ
L。
程序:
94℃预变性4min;
94℃30s,55℃45s,72℃40s后扩增(内参基因扩增28Cycles,GbMFT2扩增30Cycles);
72℃延伸10min。
1.2.5T2代转基因烟草表性分析
1.2.5.1T2代烟草种子的处理及种植
70%酒精消毒2min,再加入20%NaClO消毒7min,水洗3次,最后一次留少量水,用移液器吸出,均匀点种在含有200mg/LKan的1/2MS筛选培养基上。
至于暗培养箱中黑暗培养2天,再放入25℃光照培养箱培养,两个星期后将幼苗分为两部分:
一部分无菌烟草幼苗的转接到分别含0mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L的1/2MS培养基上盐胁迫处理30天,观察表型;
将另一部分野生型烟草与转基因烟草种在含1/2MS的锥形瓶,光照培养箱中培养30天,再经过两天的炼苗后栽培到经过高压灭菌的土:
1的营养土里,做好编号,放入h光照和16h黑暗的培养间里培养,统计转基因烟草与野生型烟草的开花时间。
1.2.5.2CTAB法提取T2代转基因烟草的DNA进行的分子检测
1.2.5.3分析不同浓度NaCl对T2代转基因烟草叶片叶绿素含量的变化
(1)烟草叶片的盐胁迫处理
称取新鲜样品0.2g左右,擦净组织表面污物。
分别放入0mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、300mmol/LNaCl的溶液中。
至于光照培养间,放置72h。
(2)测定叶绿素a和叶绿素b的含量
将72h盐处理后的叶片剪碎,分别放入研钵中,加少量石英砂和2mL95%乙醇,研成均浆,继续研磨至组织变白。
静置3~5min。
取滤纸1张,置漏斗中,用乙醇湿润,沿玻棒把提取液倒入漏斗中,过滤到25mL棕色容量瓶中,用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次,最后连同残渣一起倒入漏斗中。
用滴管吸取乙醇,将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。
直至滤纸和残渣中无绿色为止。
最后用乙醇定容至25mL,摇匀。
把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。
以95%乙醇为空白,在波长665nm、649nm下测定吸光度。
将测定得到的吸光值代入下面的式子:
Ca=13.95A665-6.88A649;
Cb=24.96A649-7.32A665。
据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度(Ca、Cb:
mg/L),二者之和为总叶绿素的浓度。
最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量:
叶绿素的含量(mg/g)=[叶绿素的浓度×
提取液体积×
稀释倍数]/样品鲜重。
1.2.5.4统计不同浓度N