免疫组化非标记免疫酶法PAPWord文档下载推荐.docx

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包括酶桥法（EnzymeBridgeMethod）和过氧化物酶抗过氧化物酶法（PeroxidaseAntiperoxidaseMethod,PAP法）。

现分述如下。

（一）酶桥法

　　1．基本原理　　首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后使用第二抗体作桥，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上，再将酶结合在抗酶抗体，经呈色显示抗原的分布。

在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连结对抗体和酶活性的损害，提高方法的敏感性，且能节　省第一抗体的用量。

　　2．染色步骤主要程序如图4-4

图4-4　酶桥法主要染色步骤

（1）切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法，第一抗体（假设来自种属A）孵育24h（4℃）。

第一抗体的稀释度可高些，使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合，较牢固，漂洗时不易丢失。

（2）切片与第二抗体（也称桥抗体，抗种属aIgG抗体）孵育1～1.5h（室温）。

应用过量的桥抗体能保证一个Fab段与第一抗体结合，另一个Fab段游离。

　　（3）切片与抗酶抗体（来自种属A）孵育1～1.5h（室温）。

因抗酶抗体和第一抗体均系种属aIgG，具有相同的抗原性，所以桥抗体游离的Fab能与抗酶抗体结合，起到桥的作用，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上。

　　（4）切片与酶（HRp70～100μg/ml,PBS溶解）孵育0.5h（室温），酶与抗酶抗体结合。

　　（5）显色等与酶标抗体法相同。

　　酶桥法克服了酶标抗体法的缺点，较好地保护了抗体和酶活性。

但仍有其不足：

①在酶抗体血清中，含有低亲合力和高亲合力两类抗体，它们作为抗原与桥抗体结合，主要依赖于桥抗体对它的亲合力，而与其本身对酶的亲合力无关，故二者均可被连结在桥抗体上。

低亲合力的抗酶抗体与酶结合较弱，漂洗时易解离，使大部分酶（70%左右）丢失，降低了方法的敏感性。

②第三步所用的抗酶抗体血清中，亦含有非特异性抗体，其抗原性与抗酶抗体相同，所以能与桥抗体结合，但不能与酶结合，影响组织抗原的显示。

为此70年代初，Sternberger（1970）又建立了PAP法，并加以改良，现为ICC研究中常用的方法之一。

（二）PAP法

　　1．PAP的制备及特征　PAP复合物是离体制备的HRP抗HRP复合物，它的制备方法较多，现简介其中之一。

PAP复合物的形成不同于其它抗原抗体反应，在抗原稍过量时，所有的抗HRP抗体均参与形成可溶性PAP复合物，仅残留少许游离的HRP，而大多数抗原抗体反应需要抗原绝对过量才能形成可溶性复合物。

PAP复合物的形状相当稳定，不受抗原量的影响，无论最初加入的抗原抗体过量与否，最终形成的PAP复合物其HRP/抗HRP之比绝大部分为3：

2。

应用离心沉降、液相扩散等方法分析表明：

PAP复合物沉降系数为11.5s,分子量为400～430kD，由此可推算出酶与抗体之比为3：

2，即每个PAP生命物由3个HRP分子和2个抗HRP抗体组成，呈五角形结构，3个角为HRP，另两个角为抗HRP抗体。

采用H2O2-DAB染色，电镜下已经观察到PAP复合物五角形环状结构，直径平均21nm。

这种结构异常稳定。

据报告PAP复合物的抗HRP抗体与HRP结合常数为108，在此可溶性复合物中，即使存在少量游离HRP，亦不影响其稳定性。

　　2．PAP染色原理及步骤

（1）原理：

与酶桥法相似，都是借助桥抗体将酶连结在与组织抗原结合的第一抗体上，所不同的是PAP法将酶桥法的步骤3、4合并为1，用PAP复合物代替，即第三步用PAP复合物孵育切片，故称PAP法。

PAP复合物中的抗HRP抗体和第一抗体为相同种属动物的IgG，所以桥抗体能够作为“桥”将PAP复合物连结在第一抗体上。

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（2）染色步骤：

主要步骤与酶桥法相似，如图4-5。

　　①切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法；

切片与特异性第一抗体孵育同酶桥法。

　　②用过量的桥抗体孵育，作用同酶桥法。

图4-5　PAP法主要染色步骤

　　③用离体制得的PAP复合物（1：

30～300稀释）孵育1～1.5h（室温），使其被桥抗体连结在第一抗体上。

亦可用ALP抗ALP复合物代替。

　　④显色观察等同间接法。

　　3．PAP法的评价　　PAP法应用比较广泛，特别是近几年，PAP、ABC等试剂盒商品化，在科研和临床病理诊断等中有着广阔的前景。

其主要特征和注意事项如下：

（1）抗体活性高：

非标记抗体酶法最大限度地保存了抗体活性，因为在所有的反应过程中，任何抗体均未被酶连结，避免了标记过程（共价键连结）对抗体活性的损害。

（2）灵敏度高：

灵敏度是指ICC方法所能发现最少数量抗原而言。

从理论上讲，PAP法应该较间接法敏感2倍以上，因为酶标抗体法中，酶与抗体为1：

1标记，而PAP复合物含有3个HRP分子。

假设一个第一抗体同一个酶标抗体/PAP复合物结合，则被连结于抗原部位的酶分子数量不同，所以PAP法应较敏感。

我们知道组织切片抗原的含量是未知的，所以不能直接在切片上检测方法的敏感度；

但可以假设相邻切片抗原浓度相对恒定，采用相邻切片染色，以产生特异性染色所用的第一抗体最低浓度作为方法的敏感度，用信噪比（Signal/moise,S/N）表示。

据此，Sternberger（1979）认为PAP法较间接法敏感20～25倍，可进一步稀释第一抗体，以节　省其用量。

但实际上PAP法与间接法之间的差异并非如此明显。

笔者在实验中注意到，PAP显示阳性的抗原，相同的稀释倍数的第一抗体在间接法中亦呈阳性反应，而时间阴性时，PAP法亦为阴性。

其原因尚不清楚，可能与桥抗体和第一抗体结合时，“剩余”（游离）的Fab段少，PAP复合物被连结的相应减少有关。

另外，PAP复合物分子量较大（400KD）,冰冻切片时，对组织穿透性远不如酶标抗体（分子量90～180kDa），所以不适于免疫电镜的标本制作。