运用紫外诱变获得并筛选植酸酶高产菌株.docx
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应用微生物技术实验设计
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运用紫外诱变获得并筛选植酸酶高产菌株
一.实验目的
1.学会从土壤中筛选到植酸酶菌株。
2.掌握紫外诱变菌株的方法。
3.学会从变异的菌株中筛选高产菌。
二.实验原理
植酸（又称为肌醇六磷酸）在多种植物组织（特别是米糠与种子）中作为磷的主要储存形式，其结构是肌醇的6个羟基均被磷酸酯化生成的肌醇衍生物。
植酸以植酸钙镁钾盐的形式广泛存在于植物种子内，也存在于动物有核红细胞内，可促进氧合血红蛋白中氧的释放，改善血红细胞功能，延长血红细胞的生存期。
植酸本身就是对人体有益的营养品，植酸在人体内水解产物为肌醇和磷脂，前者具有抗衰老作用，后者是人体细胞重要组成部分。
植酸酶，是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸（盐）的一类酶的总称，属磷酸单酯水解酶。
具有特殊的空间结构。
植酸酶作为一种新型的饲料添加剂，能分解饲料中的植酸，形成禽畜可利用的磷酸，提高饲料中有机磷的利用率，减少添加无机磷，降低饲料成本，减轻磷污染，同时解除植酸的抗营养作用，提高饲料的营养价值，具有非常可观的经济效益和生态效益。
以微生物的自然变异作为基础的筛选菌种的机率并不很高。
因为自发突变率小，一个基因的自发突变率仅为10-6~10-10左右。
为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。
物理因素中目前使用得最方便且十分有效是UV，UV诱变一般采用15w的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。
在生产和科研中可利用此法获得突变株。
从土壤中筛选到一株植酸酶高产菌株，利用紫外线对该菌株进行诱变提高植酸酶产量，并采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素阴离子交换层析和sephadex G-100 凝胶过滤层析对植酸酶进行分离纯化。
三.实验材料
1.材料
（1）筛选培养基：
1%植酸钙，3%葡萄糖，200U/ml青霉素钠，0.5%NH4NO3，0.05%KCl，0.003%，MnSO4.4H2O，0.05%MgSO4.7H2O，0.003%FeSO4·7H2O，1.5%琼脂，pH5.5。
（2）液体发酵培养基：
1.5%葡萄糖，0.3%蛋白胨，0.2%（NH4）2SO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.05%KCl，0.003%MnSO4·4H2O，0.003%FeSO4.7H2O，pH5.5。
（3）查氏合成培养基：
硝酸钠2g，磷酸氢二钾1g，氯化钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂15~20g，水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。
（4）斜面培养基：
0.05%MgS04·7H2O，0.003%MnSO4·7H2O，0.003%FeSO4·7H20，麸皮汁100ml，1.5~2%琼脂，pH5.5。
（5）土壤：
去除土层表面枯枝、杂草和砂石，收集距表层5cm-10cm的土壤。
2.仪器
水浴锅、培养箱、烧杯、培养皿、灭菌锅、漏斗、试管、摇床、分光光度计、pH试纸、电炉、干燥箱、超净工作台、移液管等
四.实验步骤
1.流程
土壤样品稀释液
测量各透明圈与
菌落直径的大小
初筛
保藏菌种
菌种鉴定
复筛
4
6
8
10
去离子水
（ml）
2
1.6
1.2
0.8
0.4
0
钒钼终止液
2
2
2
2
2
2
OD
值
按表
1
加入试剂后，在
415nm
波长下测
OD
值，并绘制标准曲线。
复筛
测酶活
保藏菌种
制备单孢子菌悬液
紫外诱变
4
6
8
10
去离子水
（ml）
2
1.6
1.2
0.8
0.4
0
钒钼终止液
2
2
2
2
2
2
OD
值
按表
1
加入试剂后，在
415nm
波长下测
OD
值，并绘制标准曲线。
复筛
菌种鉴定
紫外诱
4
6
8
10
去离子水
（ml）
2
1.6
1.2
0.8
0.4
0
钒钼终止液
2
2
2
2
2
2
OD
值
按表
1
加入试剂后，在
415nm
波长下测
OD
值，并绘制标准曲线。
复筛
菌种鉴定
紫外诱变
平板初筛
摇床复筛
测酶活
保藏菌种
分离纯化
2.方法
（1）菌株的筛选：
土壤样品稀释1×10^5倍，涂布于筛选培养基上，30℃培养72h，挑取产生透明圈的菌株。
对初筛得到的菌株进行摇瓶复筛，在220r/min的转速下发酵培养，测其酶活。
-[崔志芳,刘娜,季爱云.植酸酶产生菌的快速筛选及发酵条件优化[J].中国酿造.2010（07）]
（2）酶活的测定：
钒钼酸铵法略加改进后进行测定。
取1ml粗酶液加入2ml植酸钠溶液并摇匀（对照加入2ml钒钼终止液），37℃保温反应30min，立即加入2ml钒钼终止液（对照加入2ml植酸钠溶液），415nm测OD值，参照磷标准曲线计算酶活。
酶活定义：
按上述方法，在pH5.5的条件下，每分钟从0.0051mol的植酸钠溶液中释放1umol无机磷所需的酶量为一个活力单位（U）。
磷标准曲线制备
原理：
利用植酸酶水解植酸盐释放无机磷，通过加入酸性钼一钒试剂，使水解反应停止，同时与水解释放出来的无机磷产生颜色反应，形成黄色的钒钼磷络合物，在415nm波长下测定磷的含量
试管号
1
2
3
4
5
6
标准磷溶液（ml）
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
无机磷浓度（mmol/l）
0
2
4
6
8
10
去离子水（ml）
2
1.6
1.2
0.8
0.4
0
钒钼终止液
2
2
2
2
2
2
OD值
按表加入试剂后，在415nm波长下测OD值，并绘制标准曲线。
-[杨平平,王燕,史宝军,陶文沂.对发酵生产植酸酶过程中植酸酶活性测定方法的初步探讨[J].食品与发酵工业.2003（09）]
（3）菌种鉴定：
将复筛酶活力最高的菌接种于查氏合成培养基上，28℃恒温培养箱培养3d后，观察菌落形态变化。
（4）单孢子菌悬液制备：
将复筛酶活力最高的黑曲霉菌斜面用10ml无菌水洗下，倒入盛有玻璃珠的无菌三角瓶中，手持振荡20min，用带有无菌脱脂棉的漏斗过滤，然后用无菌生理盐水将所得孢子洗涤2-3次，制成单孢子悬液。
（5）诱变处理：
取复筛酶活力最高的菌株的孢子悬液10ml加入直径为9cm的无菌培养皿中，在15W紫外灯下，距离28cm，进行诱变处理，时间依次为0、3、6、9、12、15min。
经紫外线诱变后得到的突变株，将其中透明圈与菌落直径比值较大的进行复筛，测定突变株的酶活。
-[焦秀凤,盛晓莉,单继阳,蒋立建.纤维素分解菌的筛选及其紫外诱变[J].化学与生物工程.2010（01）]
（6）斜面低温保藏法：
将菌种接种在适宜斜面培养基的上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。
（7）植酸酶的分离纯化：
①取发酵后的培养液在4℃，4000r/min离心20min，取上清液，分别加入固体硫酸铵，使硫酸铵饱和度分别为20%~90%，对植酸酶进行沉淀。
沉淀重新溶解在乙酸缓冲液中，对蒸馏水透析脱盐。
②透析后的植酸酶溶液用DEAE-纤维素阴离子交换层析柱进行分离纯化，用NaCl溶液进行线性梯度洗脱，于280nm检测蛋白质，分部收集，测定每管酶活力。
③将上述洗脱液用SephadexG-100凝胶柱进一步分离，用乙酸缓冲液进行洗脱，于280nm波长检测洗脱液中蛋白质的含量，记录洗脱曲线，分部收集酶活力较大的部分。
（8）酶学性质研究：
①用纯化的植酸酶分别在pH2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.6、7、7.5、8的乙酸缓冲液中进行酶促反应，测定酶的最适pH。
将不同pH的植酸酶溶液，在37℃处理30min，测定酶活力，研究酶的pH稳定性。
②纯化后的植酸酶溶解在乙酸缓冲液中，分别在不同温度（20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70℃）下进行酶促反应，测定植酸酶的最适温度。
将植酸酶溶液分别在不同温度下保温30min，再在37℃测定酶活力。
五.注意事项
1.紫外线对人体的细胞，尤其是人的眼睛和皮肤有伤害，长时间与紫外线接触会造成灼伤。
故操作时要戴防护眼镜，操作尽量控制在防护罩内。
2.空气在紫外灯照射下，会产生臭氧，臭氧也有杀菌作用。
臭氧过高，会引起人不舒服，同时也会影响菌体的成活率。
臭氧在空气中的含量不能超过0.1％~1％。
3.去除土层表面枯枝、杂草和砂石，收集距表层5cm-10cm的土壤。
4.应用菌株采用斜面低温保存法。
将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌株生长充分以后，转移至4～8℃冰箱中保存。
此法仅用于应用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。
保存时间根据菌种种类而不同，细菌：
1个月；酵母菌：
2个月；霉菌及芽胞：
3个月。
.
参考文献
1.杨平平,王燕,史宝军,陶文沂.对发酵生产植酸酶过程中植酸酶活性测定方法的初步探讨[J].食品与发酵工业.2003（09）
2.崔志芳,刘娜,季爱云.植酸酶产生菌的快速筛选及发酵条件优化[J].中国酿造.2010（07）
3.焦秀凤,盛晓莉,单继阳,蒋立建.纤维素分解菌的筛选及其紫外诱变[J].化学与生物工程.2010（01）
4.夏广欣.土壤放线菌的筛选、鉴定及其发酵产物的活性研究[D].东北农业大学2012
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