核酸检测技术及其在国内外血液筛检中的应用.docx

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核酸检测技术及其在国内外血液筛检中的应用

　核酸检测技术及其在国内外血液筛检中的应用

输血相关传染病的预防和控制已经成为全社会关注的焦点,新技术的引进是进一步提高血液安全性的重要一环。

本文就病原体核酸检测技术（nucleicacidtesting,NAT）及其在国内外血液筛检中的应用情况和结果作一介绍,并对该方法在我国推广和应用的必要性和可行性作初步探讨。

1.　NAT在血液筛检中的必要性

酶免检测（EIA）技术已经广泛运用于血液筛检,该方法的灵敏度和特异性也在不断地改进和提高,但每年仍有少数新发输血后肝炎病例报道,如美国无偿献血者每单位供血传播HBV、HCV和HIV的危险性分别为1∶66000、1∶103000和1∶676000[1]。

这些危险的主要原因是:

病毒感染者“窗口期”献血,病毒变异,免疫静默感染（immunosilentinfection）以及人工操作错误[2]。

所谓“窗口期”,是指从感染病原开始,直至用某种检测方法能够检测到该病原存在为止的这一段时间[3]。

血清学抗原、抗体检测的“窗口期”较长,如HBsAg、抗-HIV、抗-HCV检测的“窗口期”分别为45-56ｄ、22ｄ、72ｄ[4,5],故美国90%以上输血传播HIV和HBV以及75%以上输血传播HCV的危险性来自“窗口期”感染献血[6]。

EIA“窗口期”漏检是当前影响血液安全性进一步提高的瓶颈,对于献血者的筛选,单纯抗原或抗体血清学检测不能有效地保障血液安全。

NAT检测是直接检测病原体核酸的一系列技术的总称。

其基本步骤包括核酸提取、扩增、和检测。

NAT敏感性高,可检出标本中极微量的核酸,在病毒感染后数天即能检出,可大大缩短“窗口期”。

初步研究表明,混合血样NAT检测可将HBV、HCV和HIV感染的平均“窗口期”缩短9d（缩短“窗口期”20%）、59d（82%）和11d（50%）[5,7];此外NAT还可以检出因上述其它3种原因而漏检的被感染献血。

如法国应用NAT,从大约150万份献血中筛检出4份HCVRNA阳性、抗体阴性的样本,其中1份即为免疫静默感染[8]。

尽管NAT从理论上并不能完全消除感染“窗口期”,但病毒核酸转阳之前的血液传染性极低,可以有效地预防经输血传播病毒性疾病[9]。

因此,NAT的引入可使输血传播疾病的危险性降到最低[10]。

2.　NAT检测的技术方法

1985年具有划时代意义的聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）的发明,标志着NAT的诞生。

随后,在PCR的基础上,派生出许多其它原理的体外NAT方法[11]。

这些技术灵敏度和特异性或高或低,操作或简单或复杂,适合在各自不同的领域运用，目前适用于大样本量血液筛查并能满足高灵敏度要求的扩证扩增技术主要为PCR技术和TMA技术。

2.1　PCR扩增方法　

PCR是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术,以其高敏感性、高特异性和快速简便等优势得到了广泛的应用。

通过简单的技术改进和联合,涌现出了各种各样不同的PCR方法,如检测RNA的逆转录PCR（RTPCR）、敏感性和特异性均较高的巢式PCR（nestedPCR）、可对靶序列进行定量检测的定量PCR、检测基因超长分布的多重PCR以及PCR结合酶标技术（PCRELISA）、PCR结合寡核酸探针杂交技术（PCRSSOP）、荧光PCR和免疫PCR等。

目前在临床检测中使用较多的是荧光定量PCR,主要用于各种传染病的诊断、病毒滴度监测以及疗效评估,因采用荧光标记的探针杂交或直接使用能和双链DNA结合的荧光素检测PCR扩增产物,进一步提高了检测的敏感性和特异性。

若加入已知浓度的内标或外标,便能进行定量检测。

由于该方法实现了反应体系的全封闭和操作的全自动,不仅减少了污染,还提高了效率。

虽然国内许多生物技术企业已经利用荧光PCR方法开发出成熟的NAT定量检测产品,如深圳匹基、广州达安、上海复星、上海科华、上海浩源等,但这些产品均只获得我国食品和药品监督部门的临床诊断使用许可证。

而临床诊断和血液筛检是2个不同的应用领域,血液筛检对试剂的要求要比临床诊断高很多。

迄今为止正式通过美国FDA认证可用于血液筛检的试剂仅有2种,即RocheCOBASAmpliScreenHBV/HCV/HIV和HIV1/HCV检测系统,FDA评判这些试剂是否能用于血液筛检的标准之一:

必须对50copies/ml的病毒核酸的检出率>95%。

相当一部分国产荧光定量PCR检测试剂或许能在某些标本上获得20copies/ml的灵敏度,但一般都很难满足95%检出低病毒载量标本的要求。

相信不断提高检测灵敏度,早日研发并注册成功我国自己的NAT血液筛检用试剂也是国内生物技术企业的发展目标。

2.2　转录介导的扩增方法

包括转录介导的扩增系统（transcriptionmediatedamplification,TMA）和核酸序列依赖扩增系统（nucleicacidｓsequencebasedamplification,　NASBA）。

TMA是一种利用Money鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶和T7RNA多聚酶2种酶的共同作用,在等温条件下来扩增RNA或DNA的反应系统,主要扩增原理为:

目标序列在逆转录酶作用下,以引物为引导进行逆转录,逆转录酶的RNA酶H活性将杂合链上的RNA降解以后,合成双链的DNA,并在T7RNA多聚酶作用下,转录出成千上万个目标RNA序列,这些RNA又可以作为模板进行下一个循环,整个反应是一个自催化过程。

NASBA的原理与TMA相似,只是在核酸提取和扩增产物检测的方法上有所不同。

这两种方法的特异性强,灵敏度高,反应条件简单,扩增效率高,无需专门的扩增仪器,且因整个反应在1个试管中进行,也减少了污染。

2.3其它NAT技术　

包括支链DNA检测技术（branchedDNAsignalamplificationassay,bDNA）、环介导的等温扩增技术（loopmediatedisothermalamplification,LAMP）、连接酶链技术（ligasechainreaction,LCR）和链置换扩增（stranddisplacementamplification,SDA）等。

这些技术或因为自身原因,或因为刚研发出来尚未进入临床,均未在血液筛检中应用。

如bDNA技术，在1995年左右推出,其信号放大是通过碱性磷酸酶（AP）标记的探针杂交结合到一个树枝状核酸枝状体上而实现的。

bDNA技术对待测DNA无扩增,特异性较好,能进行病毒定量检测,动态地揭示病毒滴度水平的变化,不仅在预测干扰素疗效方面可为临床提供更为有用的信息,还可作为丙肝病人对干扰素完全应答的标志反应。

但也正因为bDNA技术没有扩增待测核酸,其检测灵敏度远远低于PCR,故该项技术实际上不适合用于血液筛检,目前国内主要将bDNA技术用于HBV或HCV病毒滴度的定量分析。

3.　NAT在国内外血液筛检中的应用

3.1开展NAT检测的国家及所用的技术

NAT是一种新兴的检测方法,许多国家及输血机构都进行了一系列的研究,在国外特别是一些发达国家和地区已普遍应用于血液筛检[12]，例如,日本是世界上最早在全国范围内对血液进行HBV、HCV、HIVNAT筛检的国家[13],新加坡、中国香港也已经分别采用不同的方式对血液进行NAT筛检;德国和荷兰从1997年起就开始NAT筛检的尝试,英国和法国的部分血站也从2000年起开始了NAT血液筛检;美国则从1999年3月开始在FDA新药审核程序下使用不同的试剂进行常规血液筛检。

开展NAT检测的国家及其所采用的技术见表1：

表1.　开展NAT检测的国家及所用技术汇总

国家或地区

技术

混合检测／单检

•Germany德国　（1997年起部分,

　　　　　　1999年４月起，全部）

•Netherlands荷兰　（1997年起）

•U.K.英国　（2000年起）

•Switzerland瑞士

•Japan日本（1997年１月起对原料浆；

　　　　　1999年初起献血者）

•Canada加拿大

•USA美国　（1999年3月起）

•NewZealand新西兰

•Australia澳大利亚

•Singapore新加坡

•Portugal葡萄牙

•France法国（2000年起）

•Spain西班牙

•Italy意大利

•HongKong香港

•台湾（2005年准备中）

•韩国（2005年1月起）

•PCR

•PCR

•PCR

•PCR

•PCR

•PCR

•TMA/PCR

•TMA

•TMA

•TMA

•TMA

•TMA/PCR

•TMA/PCR

•TMA/PCR

•TMA

•TMA/PCR

•TMA/PCR

•Pool

•Pool

•Pool

•Pool

•Pool

•pool

•pool/IDT

•IDT

•pool/IDT

•IDT

•IDT

•Pool/IDT

•Pool

•Pool

•pool

•Pool

•Pool

各国采用的技术各不相同（参见表1）。

日本使用的方法为罗氏公司与日本红十字会共同开发的全自动的AmpliNATＴＭNPX系统（为荧光PCR技术，可同时联合检测HBV,HCV和HIV），目前正在考虑使用Chiron公司的TMA技术;　美国ARC和新加坡使用的是Chiron公司的TMA技术;美国血液中心（ABC）系统则使用罗氏COBASAmpliScreen;荷兰及部分欧洲国家将荷兰阿克苏公司推出的Nucliesens全自动核酸提取方法同罗氏的COBASAmpliScreen扩增体系结合起来使用;而英国和法国的部分血站在2000年采用的是Qiagen的全自动核酸提取系统与罗氏的COBASAmpliScreen扩增体系结合起来的方法,随后部分血站又更换成Chiron的TMA技术。

各血站根据自身特色,正在对各种不同的技术组合进行评估,目的是寻求一种最适合的NAT技术,既保障血液安全,又能保证血液的及时供给,还要做到省时省力。

3.2国外献血员中NAT检测结果

从各国公布的NAT检出的阳性标本资料总结中可以看出,尽管世界发达国家的血液安全水平已经大幅度提高,但是由于EIA“窗口期”所致的漏检概率仍然有几百万分之一、几十万分之一甚至几万分之一，具体检测结果见表2。

表2　国外献血员中NAT检测结果汇总

国家

试剂

检测方式

血清学阴性、NAT单独阳性检出情况

文献

美国

ChironProcleixTMAHIV-1/HCVassay;

Roche　CobasAmpliScreenHIV-1andHCVtests

Chiron:

16人份，TMA,化学发光检测；

Roche：

24人份混合，PCR-ELISA

1999.03-2002.03:

HCVNAT+：

170/39,721,404，即1/23万；

HIV-1NAT+：

12/37,164,054，即1/310万

文献14

日本

MultiplexHBV/HCV/HIV-1reagent（Roche与日本共同研制）

1999年7月1日-2000年1月31日，500人份；

2002年2月1日起，50人份混样;

合格血液检测

–2000.4：

HBVNAT+

：

26／2560977，即1/9.8万；

HCVNAT+

：

9／2560977,即1/28.4万；

HIV-1NAT+：

0／256.1万。

–2002.12.31：

HBVNAT+：

308／16012175，即1/5.2万；

HCVNAT+：

46／16012175,即1/34.8万；

HIV-1NAT+：

6／1601217

文献15,16

澳大利亚

ChironProcleixTMAHIV-1/HCVassay;

2个点单人份，3个点16人份，TMA,化学发光检测；

2000.-2004：

HCVNAT+-：

9/4,489,550，即万；

HIV-1NAT+：

1/4,489,5504，即万4,489,550

文献17及个人交流（文献18）

中欧

HCVPCR:

RocheCobasAmplicon;HIVPCR:

自己研制的PCR

96人份混合

HCVNAT+：

6/360万，1/60万；HIVNAT+：

2/360万，1/180万

文献19

法国

ChironProcleixTMAHIV-1/HCV；或RocheCobasAmpliscreenHIV-1andHCV结合theOrganonNuclisens核酸提取仪

单检，或8人份，或16人份,不考虑血清学

2001.07-2003.12：

HCVNAT+：

3/614万，即1/205万；HIVNAT+：

2/614万，即1/307万

文献20

新加坡

ChironProcleixTMAHIV-1/HCVassay;

单人份检测

.10:

HCVNAT+：

4／304,715,即万；

HIV-1NAT+：

0／304,715，即万

个人交流（文献21）

韩国

ChironProcleixTMAHIV-1/HCVassay;

16人份

2004，前期评估：

单采献浆者24599，献血者15597:

HCVNAT+：

1/40196；

HIVNAT阳性：

1/40196；

2005起，常规检测

个人交流（文献22）

南非

ChironProcleixTMAHIV-1/HCVassay;

单人份

1999年:

HIVNAT+:

2/19709,即1/1.0万；HCV　NAT＋:

0/19709

文献23

我国核酸筛查技术应用研究情况

3.3.1我国核酸筛查技术应用

我国有关NAT血液筛检研究的报道还比较少见。

比较规范的血液筛检研究更少，有的单位利用国产PCR试剂加电泳检测的方法进行检测，其实验室交叉污染的问题很难控制。

有关我国献血者及原料浆中NAT检测工作的情况总结于表3和表4。

表3国内血液中心开展NAT检测研究的情况

单位

试剂

检测方式

NAT阳性

文献

深圳保安区中心血站

美国BiotronicsTech　HBV,HCVAmpliSensor试剂盒

20人份混合15000rpm离心浓缩，半自动荧光定量PCR检测

HCVNAT+:

1/8805

（ALT390U/L）；

HBVNAT+:

抗-HBc阳性中：

1/946；单项抗-HBc阳性中：

5/495（1％）

文献24

厦门血液中心

自行设计引物，HCV

50人份混合，NucliSensExtractor提取核酸，NASBA技术，混扩增，ECL检测

HCVNAT+:

2/10000,即

1／5000

文献25

江苏省血液中心

华美HCVRNA试剂盒

单人份，PCR,电泳

HCVNAT+:

2/750，即1／375

文献26

上海血液中心

美国ChironProcleixHIV-1/HCV

8人份或24人份混合；TMA技术；化学发光检测

HCVNAT+:

0／103539;

HIVNAT+:

0／103539;

文献7

北京血液中心

匹基HCV/HIV-1荧光PCR核酸检测试剂

24人份混合，26000g离心浓缩，Roche核酸提取柱，荧光PCR

HCVNAT+:

0/34373;

HIVNAT+:

0/34373

文献27

多单位参加的国际合作

美国ChironProcleixHIV/HCV

16人份混合；无菌采血管EDTA抗凝，TEAN自动混样；TMA技术；化学发光检测

HCVNAT+：

2/80259

（其中1个ALT254IU/ml）

HIVNAT+：

0/80259

文献28

深圳血液中心

RocheAmpliscreenHBV/HCV/HIV

24人份混合，STAR2000自动混样;RocheMPLC自动提取核酸；

RocheCOBASAmplicor扩增和检测

HCVNAT+:

0/16512;HIVNAT+:

0/16512;HBVNAT+:

8/16512,即1/2064

文献29及个人交流（深圳血液中心,王良华，2005年５月）

沈阳血液中心

匹基HCV荧光PCR核酸检测试剂

24人份混合，26000g离心浓缩，Roche核酸提取柱，荧光PCR

万

个人交流（沈阳血液中心，李剑平博士，2005年6月）

中山中心血站及芜湖中心血站

厦门长城，无锡三星，上海正业HCVPCR

单人份，PCR,电泳

HCVNAT+:

77/28098（1/365）

文献30

表4　国内原料浆开展NAT检测研究情况

单位

试剂

检测方式

NAT阳性

文献

中国药品生物制品检定所

匹基HCV/HIV-1荧光PCR核酸检测试剂

24人份混合，26000g离心浓缩，Roche核酸提取柱，荧光PCR

HCVNAT+:

0/19196;

HIVNAT+:

0/19196

文献31

上海莱士血制品

匹基HBV/HCV/HIV-1荧光PCR核酸检测试剂

48人份混合，26000g离心浓缩，Roche核酸提取柱，荧光PCR

HBVNAT+:

1/1401718（1/140万）;

万）;

万）

文献32

中国药品生物制品检定所

ChironProcleixHCV/HIV-1Assay

16人份混合，TMA技术；化学发光检测

HCVNAT+:

1/10032;　

HIVNAT+:

0/10032

个人交流（检定所，白坚石博士，2005年1月）

3.3.2我国核酸筛查技术应用工作小结：

1）NAT检出率：

有限的研究数据表明，我国献血者血液NAT检出率

HCV　NAT+　检出率结果差异很大，　从1/365（国产试剂,电泳）～万～不等；HIVNAT+检出率<万；HBVNAT+为1/946（anti-HBc+献血者中）～1/2088。

我国原料浆NAT检出率：

HCVNAT+万～万;HIVNAT+：

万；HBVNAT+：

1/140万（48人份混合）。

2）必须重视核酸检测的质量控制体系：

✧注重避免交叉污染：

⏹检测方法：

传统的电泳检测为开放式，不适合；

⏹严格的核酸检测实验室设置和管理。

✧注重试剂质量：

为适应血液混样检测对灵敏度的要求，一些国产血筛试剂在临床诊断试剂的基础上已做样品处理的改良，灵敏度（如匹基）在考察期间不错。

但仍有待完善，表现在：

⏹灵敏度、重复性、特异性：

进口NAT血筛试剂质量稳定，各批质量波动小；国产试剂批间差异问题；特异性问题。

⏹内标：

进口试剂每个检测管均有内标，保证阴性结果的可靠性；国产试剂由于尚无法解决加入内标后灵敏度降低的问题，未加内标，因此存在假阴性问题。

⏹自动化：

进口试剂已有配套的检测系统和软件，便于大规模筛查；国产试剂尚在起步阶段，尚不能实现自动化，没有配套软件。

✧标本留样和处理：

也是核酸检测质量控制体系中的重要环节，否则在检测之前病毒核酸已降解，造成假阴性检测结果。

根据我们的研究结果，用于NAT检测的标本应用无菌留样管采集。

4.血液核酸筛查发展趋势

4.1NAT检测先从原料浆开始实施，再在献血者中实施:

NAT血液筛检方法总是从血浆制品的原料浆的筛检开始的,积累了充分的经验后,才逐步应用到血站的采供血系统。

例如,日本从97年11月起在原料浆中进行NAT筛检，1999年7月在东京都试用于献血者中［33]；欧洲医疗产品规范委员会（CPMP）规定从1999年7月起所有的血浆制品的原料、中试产品和最终产品都应进行HCVPCR检测,当时NAT只在少数血站进行评估,而大部分血站供血系统至今仍未进行NAT筛检;美国早在1994年FDA就曾提出血浆蛋白生产的原料浆必须进行NAT筛检,而血站系统则从1999年才开始全面进行NAT的可行性评估[34]。

自动化，集中化检测

　以地域为单位建立几个大型的集中式的NAT血筛中心,既便于质量管理,又能节省检测成本。

例如,全日本只设3家NAT检测中心,分区域对77家血液中心的标本进行HCV、HBV、HIV核酸检测和分析[35]。

又如美国红十字会（ARC）在全美成立了3个NAT检测中心,每天将所有ARC血站采集的血液集中到这3个检测中心进行NAT检测,据测算,尽管血液标本的冷链运输消耗一部分费用,但集中检测的成本仍低于各个血站单独检测。

我国香港地区将血液标本送到澳大利亚进行NAT检测也是这个道理。

目前,欧洲各国的血站正在进行或已经完成整合,也正是顺应了集中化管理的潮流。

4.3混合样本数逐渐减少

　　为降低成本,在保证灵敏度的前提下,NAT往往将一定数量的血液标本混合起来检测。

NAT检测最初在欧洲普遍流行96人份样本混合检测,随后逐渐更换成48人份,直至目前的24人份混合。

TMA刚开始在美国ARC进行评估时,将128份血液标本混合起来检测,随后改成16人份混合[34]。

日本1999年7月起用于献血者筛查，2000年2月起由原来的500份混合检测改为50份混合检测［33］；新加坡从一开始就使用单人份血液标本进行NAT检测。

这样更改的原因一是可以防止低拷贝的病毒阳性血液的漏检,二是混合样品增多,一旦发现阳性检测结果,进一步拆分混合样品,最终找到阳性血液标本的工作变得复杂耗时,有时还会影响正常的血液供应。

4.4应考虑考虑成本－效益比

NAT对提高血液安全确实有帮助，从各国公布的NAT检出的阳性标本资料总结中可以看出,尽管世界发达国家的血液安全水平已经大幅度提高,但是由于EIA“窗口期”所致的漏检概率仍然有几百万分之一、几十万分之一甚至几万分之一,虽然从经济学角度考虑,为了保障每年如此少数几个人的安全而投入大量的人、财、物进行NAT血液筛检,不太经济,然而对于受血者来说,一旦输入感染病毒的血液,被感染的概率就是100%。

因此大多数国家从人权角度考虑,仍然在经济允许的条件下开展NAT血液筛检；但成本-效益的问题也是各国家所关心的［36-39］。

　一些国家已在考虑加做HBVNAT

Chiron已开发Ultrio，可同时检测三项，初步临床试验数据表明，HBVNAT的检出率较高：

在新西兰：

检出HBVNAT+：

1/1991，单人份检测；新加坡：

1/6000，单人份检测。

而在国内，尽管由于混合检测使HBVNAT的窗口期加长，HBVNAT+检出率仍比较高，为1/946（anti-HBc+献血者中）～1/2088［25,29］。

因此，如果在国内开展NAT临床服务工作，应考虑加做HBVNAT。