湖南大学生物信息学实验报告W13.docx

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湖南大学生物信息学实验报告W13

实验七PCR引物设计及评价

1基本信息：

姓名：

程瑶学号：

201378020205

班级：

医学1301实验日期：

2016-05-24

2实验目的和要求：

1）掌握引物设计的基本要求，并熟悉使用Primerpremier5.0软件进行引物搜索；

2）掌握使用软件oligo6.0对设计的引物进行评价分析。

3实验仪器、设备与材料：

计算机（联网）

4实验原理：

1）引物设计原则：

A：

引物应在序列的保守区域设计并具有特异性；

B：

引物的长度一般为15-30bp；

C：

引物不应形成二级结构；

D：

引物序列的GC含量一般为40-60%；

E：

引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右最佳；

F：

引物序列自身或者引物之间不能在出现3个以上的连续碱基；

G：

引物3’端不可修饰；

H：

引物3'端G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间G值相对较高。

2）引物设计软件Primerpremier5.0及Oligo6.0：

Primerpremier5.0：

“Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计、限制性内切酶位点分析和DNA基元（motif）查找。

“Premier”可以针对模板DNA的来源以相应的遗传密码规则转换DNA和氨基酸序列，软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择。

Oligo6.0：

Oligo6.0的界面是三个图，Tm图、ΔG图和Frq图。

“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。

但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。

所以引物设计的最佳搭配是“Premier”进行引物搜索“Oligo”对引物分析评价。

5实验内容：

1）使用Primerpremier5.0软件进行人瘦素（leptin）mRNA引物的设计；

2）使用oligo6.0对引物进行评价分析；

3）使用blast工具帮助设计引物和评估引物特异性；

6实验步骤：

略~~~

7作业：

提交使用Primerpremier5.0及Oligo7.37软件进行人肉素（leptin）mRNA引物的设计结果：

1）使用引物设计软件Primerpremier5.0进行人瘦素（leptin）mRNA引物搜索结果截图。

（包括Sense链和Anti-sense链截图）：

A：

先把leptin的序列输入到Primer中：

然后进入primer：

然后点击search，可修改部分数据去得到你想要设计的引物：

得到search的结果，分三种：

sense、anti-sense、pair：

↑Sense

↑Anti-sense

↑Pair

因为pair是综合sense和anti-sense的结果，所以我在pair中选择引物：

根据引物设计的原则，如sense链和anti-sense链的Tm值相差不能过大，GC含量要在40%-60%之间，hairpin、dimer和falsepriming要尽量少的found等，我选择第二条引物，即2672-2968：

其sense链为：

其anti-sense链为：

2）oligo6.0分析此对引物的结果。

（包括Duplexformation、Hairpinformation、FalsePrimingSites截图）：

A：

首先呢~要把leptin的序列输入到Oligo中去，并把之前从Primerpremier5.0中所得到的引物在Oligo中表示出来：

即这段：

然后进行分析，我在analyse中进行了4种分析，分别是Duplexformation、Hairpinformation、Composition&Tm、FalsePrimingSites：

A：

Duplexformation

B：

Hairpinformation

C：

Composition&Tm

D：

FalsePrimingSites

从上面4种分析可见：

①在5’和3’的引物中，有4个碱基位点可以互补，可以配对形成双链。

但无形成环状的配对位点；

②无发夹结构；

③Oligo所分析出的Tm值与primer引物设计出的Tm值有差异；

④正义链有三个假启动位点，反义链有5个假启动位点。

总结可知，该引物无发夹结构，但是会有双链形成的和数个假启动位点的可能，所以并不是多么完美的引物。

但相比较其他几条引物来说，这条是最好的~

3）综合Primerpremier5.0与oligo6的引物设计结果为：

A：

sense：

5’-GTAGAGTTTGAAGGAGGTGA-3’（20bp）

antisense：

5’-CAGCCTGATTAGGTGGTT-3’（18bp）

8思考题：

1）怎么设计引物把上面提到的leptin的全长拉出来？

A：

老师，说实话，我还是没完全理解你说的拉出全长，我就按我的理解来了……

首先，进入primer：

可见一开始时引物为1-25，sense链和anti-sense链都是25个碱基；

因为sense链已经是从1开始了，所以我只需要调节anti-sense链即可；

先点击primer处的A，然后调节下方滑动到最后区域，用鼠标将anti-sense链的5’端移到3444的位置，这样就把leptin的全长拉出来了：

其实一开始，我不想来这么简单粗暴的方法……

所以我想在search中修改数据来得到全长的引物，如下图：

然后结果是酱紫滴~~~

没办法，我只能作罢，选择第一种那样简单粗暴的方法……

2）请比较芯片设计与引物设计的异同。

A：

因为基因芯片探针和PCR引物都是通过配对来形成双链的，而且基因芯片的探针也是通过PCR来扩增的，所以PCR引物的设计原则基本上也是基因芯片的探针的设计原则，如下：

①产物的特异性；

②产物的长度一般为15-30bp，产物中G、C序列的GC含量一般为40-60%，并且不能在出现3个以上的连续碱基；

③避开产物的二级结构区，不能形成双链和发夹结构；

④产物的3'端不能修饰，而5'端可以修饰；

但是PCR引物只有一条双链，即只有sense链和anti-sense链两条引物；而基因芯片的探针有成千上万种，所以基因芯片的探针设计还需要考虑到下列因素：

①探针序列的互补序列在所有基因序列中必须是唯一的；

②探针序列的任一长度为15的子序列在整个基因组中必须是唯一的；

③探针序列不能自杂交，即探针序列中的互补片段的长度不能超过探针长度的30%。