龙葵Solanum nigrum Linn幼苗.docx

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龙葵SolanumnigrumLinn幼苗

龙葵（SolanumnigrumLinn）幼苗生长及抗氧化酶对Cd2+的耐性研究

郭海军[1]吴克勤[1]王维忠[1]张芬琴[2]

（河西学院生物系，甘肃张掖734000）

摘要：

本文采用溶液培养的方法，研究了生长于湖南省长沙市李梅镇的龙葵（以H种表示）和生长于甘肃省张掖市甘州区的龙葵（以Z种表示）的幼苗生长和抗氧化酶对Cd2+的响应。

结果表明，两种龙葵对Cd2+都有一定的积累性,同时，Cd2+对两种龙葵的幼苗生长均产生抑制作用；随着Cd2+浓度的增加，幼苗叶片内的叶绿素含量下降，丙二醛含量、脯氨酸含量增加，抗氧化酶CAT、APX、SOD和POD的活力或增加或在较高浓度下降底；并且，在相同的Cd2+浓度下，H种龙葵的CAT、APX、SOD、POD活力都比Z种龙葵的高。

相比之下，Z种龙葵的幼苗生长和抗氧化酶对Cd2+的响应较H种龙葵的明显，暗示了H种龙葵幼苗对Cd2+的耐性较前者强。

关键词：

龙葵；溶液培养；幼苗生长；抗氧化酶；Cd2+处理

EeffectsofCd2+onSeedlingGrowthandAntioxidantEnzymesofSolanumnigrumLinn

Abstract:

TheayticlepaysmoreattentiontoresearchthedifferenteffectsoftwoSolanumnigrumLinninthewayofhydroponiccultures.ThetwoSolanumnigrumLinnwereproductedinHunanandZhangye.ItwasestimatedthatthegrowthofseedlingswassignificantlyinhibitedforthetreatmentwithCd2+.WiththeconcentrationofCd2+increasing,thechlorophllcontentinseedlingleavesdropped,butthecontentofMDAandprolineincreasednnotably.TheactivitiesofantioxidantenzymesCAT、APX、SODandPODincreasedwiththeconcentrationofCd2+increasing.ComparedwithtwoSolanumnigrumLinn,theseedinggrowthingofSolanumphoteinocairpumNakamuraodaehimaexhibitedlittleeffects.ThismaybesuggestedthattheresistanceofseedingsgrowingofSolanumphoteinocarpumNakamurawardsCadmiumstressbestrongerthanthatofSolanumnigrumlinn.

Keywords:

Solanumnigrumlinn；hydroponicculture；seedinggrowth；antioxidantenzymes；treatmentwithCd2+

近年来,随着工农业的发展、工业污染物排放量的增加和农药、化肥的过量使用，使世界范围内的环境污染日益严重，生态平衡不断被破坏。

在环境污染中，十分突出的是重金属污染。

镉是广泛存在于自然界的一种毒害性最强的重金属元素，其毒性仅次于汞，位居第二。

在自然界中镉主要以其化合态的形式存在，其中以Cd2+的形式产生毒性，且Cd2+对生物有机体的毒性很大，蓄积性也很强，受Cd2+毒害的植物不能正常生长，并且生物量呈下降趋势[1]。

0.01mmol/L的Cd2+即可引起植物细胞DNA的损失和代谢紊乱[2]。

生产中施用含镉的肥料，灌溉含镉的污水及大气中漂浮的镉在作物和土壤表面发生沉积，从而使镉进入土壤——植物生态系统，并通过食物链危害人和动物。

当镉毒害达到一定程度，就会表现出生长迟缓、植株矮小、叶片失绿等中毒症状，严重影响产量[1]。

据统计，我国Cd2+污染的农田已达1.09×104hm2，而且还有上升趋势[3]。

若有一种能够耐Cd2+的植物对土壤或水体中的Cd2+进行吸收并在体内积聚起来，进而回收利用，那么就可以减轻Cd2+对环境的污染。

龙葵（Solanumnigrumlinn）属茄科（Solanaceae），茄属（Solanumlinn）[4]，俗称黑天天，又名油油，为一年生农田野生杂草[5]。

我国各地均有分布，广布于世界温带和热带地区[6]。

目前不少研究通过对单一品种龙葵果的碱溶性多糖成分、水溶性成分、色素、矿物质、维生素等的提取和研究，报道了龙葵具有很高的经济价值，药用价值，营养和食用价值，以及开发利用价值。

故本文以生存于两种不同生态环境中的龙葵为试验材料进行研究，旨在为龙葵田间生产和露地栽培早期预报重金属对其的毒害效应，相比之下，找出更适宜种植的龙葵优良品种，为龙葵的大面积推广种植提供理论依据。

并通过龙葵的种植对被镉污染的环境进行修复和对Cd2+进行回收利用。

种子萌发及幼苗生长是作物对外界有所反应的开始，也是作物对外界反应的敏感期[7]。

本文通过研究两种生态环境中的镉超积累植物龙葵[8]的幼苗生长及抗氧化酶对“三废”中较为广泛存在的重金属镉（Cd2+）毒害的响应，

1　材料与方法

1.1材料

生于湖南省长沙市李梅镇的少花龙葵，试验用种子，于2005年9月采自湖南省长沙市李梅镇，简称H种；甘肃省张掖市甘州区产的红果龙葵，试验用种子，于2005年11月采自甘肃省河西学院校园，简称Z种。

1.2材料培养及处理

挑选饱满均一的H种和Z种的种子，将Z种种子用0.1%HgCl2表面消毒10min[9]，蒸馏水冲洗后，放入培养皿中在20℃下浸种；3d后再将H种种子用0.1%HgCl2表面消毒10min，开始浸种，两种种子均在25℃、黑暗中催芽。

浸种到第8d时，挑选露白一致的两种种子播于培养皿中培养龙葵幼苗，待长至两叶一心时挑选整齐一致的幼苗移入1L塑料杯中培养（5株/杯）。

用Hoagland营养液培养，每天通气1min，每3d更换一次培养液。

培养14d后进行以下处理。

设5个Cd2+处理浓度，分别为0（CK）、5、20、50和100μmol/L，Cd以CdCl2·2.5H2O的形式加入，每个处理设6个重复。

处理后第8d取样，测定其叶绿素含量、脯氨酸含量、丙二醛（MDA）含量和抗氧化酶系统CAT、APX、SOD和POD的活力。

1.3测定方法

1.3.1叶绿素含量的测定

参照张宪政的方法[10]。

用丙酮：

乙醇（V：

V=1：

1）提取，分别测A645、A663。

按丙酮法公式计算叶绿素含量。

   取新鲜龙葵叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。

称取剪碎的新鲜样品0.2g，置于丙酮：

乙醇（V：

V=1：

1）混合液中，在室温黑暗中浸泡提取24h，直到叶圆片完全变白，把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95％乙醇为空白，在波长A665、A649下测定吸光度。

 实验结果计算：

将测定得到的吸光值代入下面的式子：

Ca=13.95A665－6.88A649；Cb=24.96A649－7.32A665。

据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度（Ca、Cb：

mg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。

最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：

     叶绿素的含量（mg/g）=[叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重

1.3.2脯氨酸含量的测定

参照李合生等的方法[11]。

用茚三酮作显色剂，以脯氨酸作标准曲线。

根据回归方程y=0.0569x-0.0016（R2=0.9871）计算出2ml测定液中脯氨酸的浓度x（μg/ml），再根据公式单位鲜重样品的脯氨酸含量μg/g=x×2.5/样重。

标准曲线的绘制

（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每1ml含脯氨酸100μg。

（2）系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6μg/ml。

（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及4ml冰醋酸和4ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。

（4）冷却后各试管准确加入6ml甲苯，振荡30s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。

（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于A520波长处进行比色。

（6）标准曲线的绘制：

先求出吸光度值（y）依脯氨酸浓度（x）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（μg/2ml）。

   称取剪碎的新鲜样品0.5g，置大管中，然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。

吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入4ml冰醋酸及4ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。

冷却后加入6ml甲苯，摇荡30s，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000rpm下离心5min。

用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，测A520处的吸光值。

结果计算根据回归方程计算出（或从标准曲线上查出）2ml测定液中脯氨酸的含量（xμg/2ml），然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。

计算公式如下：

     脯氨酸含量（μg/g）＝[x×5/2]/样重（g）。

1.3.3MDA含量的测定

参照李合生等的方法[11]。

取0.5g根系或叶片,加5ml5％冰浴研磨，在3000r/min下离心10min。

取上清液2ml，加0.67%TBA2ml，混合后在100℃水浴上煮沸30min，冷却后在离心一次。

分别测定上清液在A450、A532和A600处的吸光值。

按公式C（μmol/L）=6.45（A532-A600）-0.56A450计算MDA含量。

1.3.4抗氧化系统酶活力的测定

参照Jiang的方法[12]。

将鲜龙葵根、茎和叶漂洗干净，用吸水纸吸干水分，剪碎混匀，取0.5g，加入5ml冰冷的50mmol/L、pH值7.0的磷酸缓冲液（内含1%PVP，1mmol/LAsA，1mmol/LEDTA），在冰浴中磨成匀浆，在4℃低温下，以10000r/min的转速离心30min，取上清液备用，进行以下酶活力测定。

1.3.4.1CAT活力的测定

参照Aebi的方法[13]。

3ml反应混合物物中含50mmol/LpH7.0的磷酸缓冲液2.7ml、酶液0.2ml、0.3mmol/LH2O20.1ml。

以50mmol/LpH7.0的磷酸缓冲液作参比，迅速测定A240的连续变化值，每30s读一次数，持续3min。

1.3.4.2APX活力的测定

参照Nchaedle和Bassham的方法[14]。

3ml反应混合物物中含50mmol/LpH7.0的磷酸缓冲液2.2ml、酶液0.2ml、0.1mmol/LH2O20.3ml、0.3mmol/LAsA0.3ml。

以50mmol/LpH7.0的磷酸缓冲液2.2ml、0.1mmol/LH2O20.3ml、0.3mmol/LAsA0.3ml作参比，迅速测定A290的连续变化值,每10s读一次数，持续1min。

1.3.4.3SOD活力的测定

　　参照Giannopolitis和Ries的方法[15]。

以氮蓝四唑（NBT）光化还原反应50％抑制率所需的酶量作为一个酶活力单位（U）。

3ml反应混合物物中含50mmol/LpH7.8的磷酸缓冲液1.7ml、13mmol/LMet0.3ml、0.1mmol/LEDTA0.3ml、酶液0.1ml、0.075mmol/LNBT0.3ml、0.002mmol/L核黄素0.3ml。

此反应混合液光照20min（光密度5，000Lux）后测定A560处的吸光值。

以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位，按下式计算SOD活性。

SOD总活性＝（Ack－AE）×V/（Ack×0.5×W×Vt）

    上式中，SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示。

1.3.4.4POD活力的测定

参照Hammerschmidt的方法稍加修改[14]。

3ml反应混合物物中含pH5.4HAC缓冲液1.8ml、75％的愈创木酚1ml、酶液0.1ml、3％H2O20.1ml为底物，迅速测定A460的连续变化值，每30s读一次数，持续3min。

。

1.4数据分析

利用MicrosoftOfficeExcel2003和SPSS10.0forWindows系统软件对测定的各个指标进行统计分析。

2　结果与分析

2.1　龙葵幼苗生长对Cd2+的响应

处理72h后观察，H种的叶色正常，在50μmol/L以上的浓度下，根的颜色逐渐变为深褐色，且100μmol/LCd2+的明显深于50μmol/LCd2+。

Z种叶色略有变化，随Cd2+浓度的增高而变浅，100μmol/LCd2+浓度下，叶片有点萎蔫，根的颜色随Cd2+浓度的增高而明显变暗，且50μmol/L以上的较明显。

处理168h后观察，H种的心叶颜色较CK的加深，其余叶色发黄，随Cd2+浓度的增高发黄程度增加，100μmol/LCd2+最明显；根的颜色随Cd2+浓度的增高而暗色加深。

Z种心叶叶色显深于其它部位叶的，叶脉附近出现萎斑，且随Cd2+浓度的增高萎斑越大越多，100μmol/LCd2+最严重，甚至大部分脱落；根的颜色，随Cd2+浓度的增高而变安，且50μmol/L以上的根变暗程度比H种的明显。

100μmol/LCd2+的出现黑褐色斑点，根系发棉发粘。

（见照片1）

与H种相比：

Z种对Cd2+做出的响应更明显。

2.2　龙葵叶片叶绿素含量对Cd2+的响应

表1所示，随着Cd2+处理浓度的增大，Z种和H种龙葵叶片叶绿素含量都呈下降的趋势。

与对照相比，较低浓度（5μmol/L）的Cd2+处理下，Z种和H种叶片叶绿素含量分别下降；较高浓度（100μmol/L）Cd2+处理下，Z种和H种叶片叶绿素含量也分别下降。

相比之下，H种的下降幅度较Z种的小。

表1两种龙葵叶片的叶绿素含量对Cd2+处理的响应

Table1．ResponsesofthechlorophyllcontentofleavesoftwoSolanumnigrumLinntoCd2+treatment

处理浓度

μmol/L

叶绿素含量（mg·g-1·FW-1）

Z种

H种

绝对含量

与对照百分比

绝对含量

与对照百分比

CK

1.87±0.08

100.00%

1.54±0.13

100.00%

5

1.55±0.07

83.16%

1.39±0.04

90.29%

20

1.44±0.06

76.79%

1.35±0.02

87.87%

50

1.40±0.03

75.07%

1.31±0.06

85.27%

100

1.32±0.04

70.09%

1.21±0.02

78.76%

注：

表中数据为三个重复的均值±SD

2.3龙葵不同器官中的脯氨酸含量对Cd2+的响应

图1表明,无论是叶还是根,随着Cd2+处理浓度的增大,Z种龙葵的脯氨酸含量显著增加,且都高于H种的。

但不同浓度的Cd2+处理对H种脯氨酸含量影响不显著（图1）。

相比之下，不论是那一种龙葵，基叶组织中的脯氨酸含量明显高于根中的（图2）。

2.4龙葵叶片组织中的MDA含量对Cd2+的响应

在本实验中，两种龙葵叶片MDA含量随着Cd2+处理浓度的增加而增加（图3）。

当Cd2+处理浓度为50μmol/L和100μmol/L时，Z种和H种叶片内的MDA含量差别不大，而当Cd2+处理浓度为50μmol/L时，Z种叶片的MDA含量比H种叶片的MDA含量高的多。

2.5　龙葵不同器官中的CAT活力对Cd2+的响应

从图4可以看出，Z种龙葵叶片和根的CAT活力随着Cd2+处理浓度的增大不断上升，当Cd2+浓度为100μmol/L时叶片和根的CAT活力突然降低。

H种龙葵叶片和根的CAT活力也随着Cd2+处理浓度的增大不断上升，当Cd2+浓度为100μmol/L时叶片和根的CAT活力仍然不断上升。

过氧化氢酶（Catalase）普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。

过氧化氢酶（Catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。

可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。

CAT能够清除植物组织中的H2O2，限制潜在的活性氧的伤害。

CAT活性的下降将会造成H2O2的积聚，从而导致细胞膜的损伤。

也就是说，当Cd2+浓度为100μmol/L时Cd2+抑制Z种龙葵CAT活力。

总体表现为H种龙葵对Cd2+的耐性比Z种龙葵的耐性强。

2.6龙葵不同器官中的SOD活力对Cd2+的响应

从图5可以看出，随着Cd2+处理浓度的增大，Z种龙葵叶片SOD活力几乎没有变化；而根的SOD活力在Cd2+浓度为5μmol/L时上升，而后降低到一定值保持稳定。

H种龙葵叶片的SOD活力不断上升，随着Cd2+处理浓度的增大，上升幅度减小；而根的SOD活力在Cd2+浓度为5μmol/L时降低后又上升。

也就是说，当Cd2+浓度为5μmol/L时Cd2+激活了Z种龙葵SOD活力。

总体表现为H种龙葵对Cd2+的耐性比Z种龙葵的耐性强。

SOD作为超氧化物自由基清除剂，在底浓度Cd2+胁迫下，体内所具有的防御机能和具抗性特征的生理活动被刺激而加快，体内自身防卫体系中SOD活性迅速是升高以对付Cd2+胁迫所引起的体内活性氧的增加而免遭伤害。

但随着Cd2+处理浓度的增大，活性氧的增加远远超过正常的歧化能力，过多的氧自由基使细胞内多种功能膜及酶系统遭到不同程度的破坏，生理代谢紊乱，SOD活性受到以致而急剧或缓慢下降，即呈现以致效应。

而H种龙葵SOD活性似乎还没有被抑制，也就是说H种龙葵对Cd2+的耐性比Z种龙葵的耐性强。

2.7龙葵不同器官中的POD活力对Cd2+的响应

从图6可以看出，随着Cd2+处理浓度的增大，Z种龙葵叶片POD活力逐渐下降，在Cd2+浓度为50μmol/L时上升，而后又降低；而根的POD活力在Cd2+浓度为5μmol/L时略有降低，在Cd2+浓度为5μmol/L时升高，而后保持稳定的上升趋势。

随着Cd2+处理浓度的增大，H种龙葵叶片的POD活力不断上升，在Cd2+浓度为50μmol/L时，POD活力达到最大，而后又降低；随着Cd2+处理浓度的增大，根POD活力逐步升高，在Cd2+浓度为20μmol/L时POD活力达到最大，然后随着Cd2+处理浓度的增大而逐渐降低。

也就是说，当Cd2+浓度50μmol/L时Cd2+激活了两种龙葵叶的POD活力，当Cd2+浓度100μmol/L时Cd2+抑制了两种龙葵叶的POD活力。

随着Cd2+处理浓度的增大，H种龙葵的POD活力总是高于Z种龙葵的，这也表明H种龙葵对Cd2+的耐性比Z种龙葵的耐性强。

2.8龙葵不同器官中APX活力对Cd2+的响应

从图7可以看出，随着Cd2+处理浓度的增大，Z种龙葵叶片和根的APX活力都逐渐升高，但上升幅度较小；而H种龙葵叶片和根的APX活力也逐渐升高，上升幅度却较明显。

也就是说，随着Cd2+处理浓度的增大，H种龙葵的APX活力总是高于Z种龙葵的，这表明H种龙葵对Cd2+的耐性比Z种龙葵的耐性强。

3　讨论

由于采矿、工业污染、人类生活污染、农药化肥的滥用，Cd2+以成为重要的环境污染物之一[20][21]，而且Cd2+是生物毒素较强的重金属元素之一，一旦植物生长在被Cd2+污染的环境中，就会对植物产生毒害作用。

Cd2+可以在植物体内大量积累，人类一旦以这些植物为食物，就会对健康产生威胁[22][23]。

龙葵（Solanumnigrumlinn）属茄科（Solanaceae）,茄属（Solanumlinn）[6]，为一年生农田野生杂草。

我国各地均有分布,广布于世界温带和热带地区[24]。

龙葵作为一种野生蔬菜,不但口感较好,很受消费者的喜爱,而且也可以丰富蔬菜的种类,出口创汇,增加效益[25]。

目前不少实验通过对单一品种龙葵果的碱溶性多糖成分、水溶性成分、色素、矿物质、维生素等的提取和研究,报道了龙葵具有很高的经济价值、药用价值、营养和食用价值,以及开发利用价值。

而另一些研究显示，生于东北的龙葵是一种Cd2+超积累植物，对Cd2+有较高的耐性。

我们通过对南北两种龙葵的研究，也发现两种龙葵对Cd2+有一定的耐性，并且湖南长沙市李梅镇的龙葵（H种）比甘肃省张掖市甘州区的龙葵（Z种）的耐Cd2+性强。

Cd2+是植物的非必需元素，Cd2+进入植物体内并积累到一定程度，就会表现出毒害症状，通常会出现抑制种子萌发、根的伸长，生长缓慢、植株矮小、失绿、产量下降等症状。

根系往往是最直接、最严重的受害器官之一，受Cd2+污染蚕豆苗根尖呈深褐色坏死[26]。

用Cd2+处理豌豆幼苗，可以降低植物幼苗叶片叶绿素含量，从而抑制光合作用[27]。

我们的试验也表明，Cd2+处理对H种和Z种龙葵有明显的毒害作用，且随着镉处理浓度的增加和处理时间的延长，毒害作用越明显，0-100μmol/LCd2+处理下叶片内叶绿素含量均减少（表1），叶片失绿加重。

和H种相比，Z种龙葵对Cd2+的响应更为敏捷。

叶片失绿是植物受重金属毒害后出现的普遍现象[28]，研究发现，Cd2+处理的龙葵叶片中的叶绿素含量降低，而关于Cd2+的这种作用机理没进行研究。

由于Cd2+抑制了根的伸长生长和侧根的发育。

推测在Cd2+处理下，叶片叶绿素的降低与根系吸收Mg、N等合成叶绿素的有关元素降低有关。

另外，很有可能是Cd2+抑制叶绿素合成过程中酶的活性或其基因表达，影响叶绿素的合成[29]。

破坏叶绿素的结构，导致叶绿素含量减少。

与H中相比Z种退绿更为严重。

说明Z种龙葵对镉毒害的响应更为明显。

MDA是膜脂过氧化作用的产物，其含量高低被用作膜伤害指标[19]。

膜脂过氧化作用增加是植株受环境胁迫的共同特征之一。

已有研究指出Cd2+处理会导致氧化胁迫，增加膜脂过氧化作用[5]。

膜脂过氧化作用，是许多植物对逆境的共同反应之一[30],膜脂过氧化是膜上不饱和脂肪酸中所发生的一系列活性氧反映，其产物丙二醛（MDA）含量是反映膜脂过氧化作用强弱的一个重要标志[31]。