植物愈伤组织诱导培养实验指导李老师Word文件下载.docx

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3.2试剂

（1）95%乙醇、1mol/LNaOH、1mol/LHCl。

（2）MS培养基成分：

①大量元素（母液Ⅰ）：

NH4NO3、KNO3、CaCl2.2H2O、MgSO4.7H2O、KH2PO4；

②微量元素（母液Ⅱ）：

KI、H3BO3、MnSO4.4H2O、ZnSO4.7H2O、Na2MoO4.2H2O、CuSO4.5H2O、CoCl2.6H2O；

③铁盐（母液Ⅲ）：

FeSO4.7H2O、Na2.EDTA.2H2O；

④有机成分（母液,维生素和氨基酸）：

肌醇、盐酸吡哆醇（维生素B6）、烟酸（Vpp）、盐酸硫胺素（维生素B1）、甘氨酸；

（3）植物生长调节物质：

2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）。

4、操作步骤

（1）MS大量元素母液的配制

按照培养基配方的用量，把各种化合物扩大10倍，按照表1中的次序分别准确称量后，分别用50ml烧杯，加入蒸馏水30ml溶解（可以加热至60℃～70℃，促其溶解）。

溶解后，按顺序倒入一大烧杯中（烧杯中事先加入约50ml的蒸馏水，目的避免由于盐浓度过高使钙离子与磷酸根离子、硫酸根离子形成不溶于水的沉淀），注意最后加入氯化钙溶液，混匀，用250mL容量瓶定容。

将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。

表1MS培养基大量元素母液（10倍）的配制剂量

母液

化合物名称

培养基用量（mg/L）

扩大倍数

称取量（mg）

母液体积（mL）

1L培养基吸取母液量（mL）

大量元素

KNO3

1,900

10

4,750

250

100

NH4NO3

1,650

4,125

MgSO4·

7H2O

370

9,25

KH2PO4

70

425

CaCl2·

2H2O

440

1,100

（2）微量元素母液的配制

按照培养基配方的用量，将微量元素各种化合物（除去铁盐）扩大100倍（表2），用万分之一天平分别准确称取，可以混合溶解，最后定容。

表2MS培养基微量元素母液（100倍）的配制剂量

微

量

元

素

MnSO4·

4H2O

22.3

223

ZnSO4·

8.6

86

H3BO3

6.2

62

KI

0.83

8.3

Na2MoO4·

0.25

2.5

CuSO4·

5H2O

0.025

10ml*

CoCl2·

6H2O

10ml**

*、**：

因天平均存在误差，为减少误差带来的影响，建议称取0.25g，溶解并定容至10ml容量瓶中，然后移取10ml，加入混合液中。

（3）铁盐母液的配制

常用的铁盐是FeSO4·

7H2O和Na2-EDTA的螯合物，必须单独配成母液。

配制时，按照扩大后的用量（表3），分别称取FeSO4·

7H2O和Na2-EDTA，分别溶解后，将FeSO4溶液缓缓倒入Na2-EDTA溶液（需加热溶解），搅拌均匀使其充分螯合，定容后贮放于棕色玻璃瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。

表3MS培养基铁盐母液（100倍）的配制剂量

铁盐

Na2-EDTA

37.3

373

FeSO4·

27.8

278

（4）有机物母液的配制

按照表4中各成分浓度扩大后的用量，用感量0.0001g天平分别称量各有机物。

可以分别溶解定容，分别装入试剂瓶中，也可以混合溶解定容，装入同一试剂瓶中，写好标签，放入冰箱中保存。

一般有机物都溶于水，但叶酸（VBc）先用少量稀氨水或1mol/LNaOH溶液溶解；

VH（生物素）先用1mol/LNaOH溶液溶解；

VA、VD3、VB12应先用95%乙醇溶解，然后再用蒸馏水定容。

表4MS培养基有机物母液（100倍）的配制剂量

有机物名称

培养基用量

（mg/L）

有

机

物

甘氨酸

2.0

20

VB1

0.4

4

VB6

0.5

5

烟酸

肌醇

1,000

（5）激素母液的配制

激素母液必须分别配制，浓度根据培养基配方的需要量灵活确定，一般是0.1～2mg/ml，根据需要确定配制的浓度。

称量激素要用感量为万分之一天平。

本实验选用激素2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）。

2，4-D母液的配制方法为：

准确称取10mg2,4-D，称量后先用少量（1-3ml）95%乙醇完全溶解后，加蒸馏水定容至100ml，即得到0.1mg/ml的2,4-D贮备液，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、浓度、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。

（6）在配制母液时注意事项：

①培养基各试剂应使用分析纯。

②在称量时应防止药品间的污染，药匙、称量纸不能混用，每种试剂使用一把药匙，多出的试剂原则上不能再倒回原试剂瓶。

③母液配制好后，贴上标签，写清母液名称、试剂浓度或扩大倍数、配制日期，并存放在4℃冰箱中。

使用前，要进行检查，若发现试剂中有絮状沉淀、或长菌、或铁盐母液的颜色变为棕褐色，都不应再使用。

5、结果记录与分析

（1）记录本小组配制的培养基母液种类、扩大倍数、母液配制体积、母液中各成分的称取量。

（2）仔细观察在配制母液过程中的现象与遇到的问题，如是否产生浑浊或沉淀，并分析出现混浊的原因。

6、思考题

（1）配置大量元素母液、铁盐母液时，应注意些什么？

（2）配置激素母液时，应注意些什么？

实验1-2植物组织培养基MS的配制与灭菌

1、目的要求

学习植物组织固体培养基的配制，学习高压灭菌器的使用，为外植体的接种与初代培养做准备。

2、基本原理

在植物组织培养中，固体培养基是最常用的一种培养基类型。

由于培养基中含有植物细胞生长所必需的各类营养物质，主要包括水、大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖、凝固剂和植物生长调节物质，因此，培养基也是微生物繁殖的极好场所。

所以，必需对培养基进行灭菌处理，以确保无菌操作的顺利进行。

本实验以可用于胡萝卜等植物初代培养的培养基MS+1mg/L2-4D+3%蔗糖+1%琼脂，pH5.8。

配制1L为例，学习培养基的配制方法。

3、实验仪器和试剂

（1）仪器、用具

高压灭菌锅，超净工作台、分析天平（0.0001g）、pH计（或pH试纸）、微波炉、手术剪刀、解剖刀、镊子、药匙、玻棒、称量纸、洗瓶、记号笔、烧杯（1000ml）、量杯、量筒（1000ml，100ml，50ml）、耐热皮筋（或棉绳）、100ml三角瓶（每人按3-4瓶准备）、培养皿（每2人按1套准备）、封口膜、定性滤纸等。

（2）试剂

①95%乙醇、1mol/LNaOH、1mol/LHCl。

②MS培养基各母液、2-4D母液、蔗糖、琼脂。

（1）器皿准备清洗三角瓶、烧杯、量筒、量杯、镊子、手术刀、培养皿、打孔器等，烘干或自然晾干备用。

（2）计算母液使用量

根据下面公式量取母液：

激素母液用量（mL）=

————————————————————

配制1000ml培养基需要加入各母液的量分别为：

大量元素母液：

100ml微量元素母液：

10ml铁盐母液：

10ml

有机物母液：

10ml激素母液：

（3）配制

称取适量的琼脂（常用量10g/L）置于1000ml大烧杯中，加蒸馏水500ml左右，在微波炉中加热使之溶解，待琼脂完全溶化后，加入蔗糖（常用量30g/L），溶后，加入上述各种母液，最后，加蒸馏水定容到需配培养基的终体积。

每组配制MS固体培养基1000ml，培养基组成为：

MS+1mg/L2,4-D+3%蔗糖+1%琼脂（pH5.8）。

（4）pH值调节

充分混合，待温度降至50℃～60℃时，用1mol/LNaOH溶液或1mol/LHCl溶液调pH值到5.8，注意用玻璃棒不断搅动。

（5）分装

搅匀培养基并迅速分装在100mL的三角瓶中（温度低于40℃以下琼脂就会凝固），每瓶25mL-30mL左右，1000mL培养基可以分装至30～40瓶，迅速盖上封口膜，用封口材料包上瓶口，扎口后，写上标记，注明配制者姓名和配制日期，准备灭菌。

注意：

分装时不要把培养基弄到管壁上，以免日后污染。

（6）灭菌

培养基内含有丰富的营养物质，有利于细菌和真菌繁殖，所以培养基配好后要及时灭菌，同时将接种用具，如镊子、解剖刀、蒸馏水、培养皿（装有滤纸）等进行灭菌。

使用高压锅灭菌要注意以下几点：

①检查灭菌锅外层锅内水位，水量过少时应加蒸馏水。

把分装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶内。

盖上锅盖，上好螺栓后接通电源加热。

②排放冷空气，关闭放气阀，当灭菌锅盖上的压力表指针移至0.1Mpa（121℃），控制压力表稳定在该压力下15分钟，即达到灭菌目的。

③灭菌后，先切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，待灭菌锅压力表指针降到0时，打开排气阀，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭菌的培养基，置于水平台子上，在室温下冷却，同时取出灭菌水、培养皿、镊子、解剖刀、滤纸等。

④灭菌后的培养基应在室温下放置2—3天，观察有无微生物生长，以确定培养基是否灭菌彻底。

经检查没有杂菌生长时方可使用。

要求：

每人准备培养基3-4瓶。

（1）仔细记录培养基制备中，各种母液、试剂称量的量。

（2）观察在配制培养基过程中的现象与遇到的问题，并加以解释。

（1）培养基表达式：

MS+1mg/L2-4D+2.5%蔗糖+1%琼脂，pH5.8，表达的含义是什么？

实验1-3胡萝卜愈伤组织的诱导

1、实验目的

（1）学习植物材料表面灭菌的常规方法；

（2）了解接种的无菌操作技术；

（3）学习诱导植物器官形成愈伤组织的方法。

2、实验原理

植物组织培养是应用无菌操作的方法，培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。

如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前提和重要保证。

由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上，可以通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织。

3、实验仪器和试剂

仪器：

超净工作台、光照培养下、酒精灯、打火机、橡皮筋、记号笔、脱脂棉1包、8把水果刀、8个1000ml烧杯（装废液用），8个500ml广口瓶，内装75%酒精及棉球、8个150ml锥形瓶，内装75%酒精100ml，8个250ml试剂瓶，内装HgCI2或次氯酸钠的消毒液。

无菌器材：

吸水纸（定性滤纸）、25套直径90mm的培养皿、8个250ml三角瓶（或烧杯），8瓶500ml无菌水、8把大号镊子、8把解剖刀。

植物材料：

直根胡萝卜。

试剂：

95%乙醇、0.1%氯化汞（或次氯酸钠）。

培养基：

MS+1mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+10g/L琼脂,pH5.8

4、实验步骤

（1）接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种间紫外灯，照射约30min，然后关闭紫外灯，通风20min后，打开日光灯即可进行无菌操作。

（2）外植体预处理：

将胡萝卜根用流动的自来水冲洗干净，用小刀削去其表皮1-2mm，切成大约15-20mm厚的块段，置于250ml三角瓶或大烧杯中。

（3）双手用肥皂洗净，以70%乙醇棉将手擦试一遍。

以下操作全部在无菌条件下进行。

（4）外植体消毒：

将胡萝卜片放人已灭菌的250ml三角瓶（或大烧杯）中，先用70％酒精对胡萝卜消毒5min，然后将酒精倒掉，再用0.1%的升汞消毒10min-12min（或用30%的次氯酸钠的消毒液将植物材料淹没浸泡约30分钟）,倒掉消毒液，然后用无菌水中漂洗3次，每次2分钟，洗时不断摇动三角瓶以确保完全除去消毒液。

（5）将胡萝卜片放入垫有无菌滤纸的培养皿中，一手用消毒好的镊子固定胡萝卜，一手用灭菌后的解剖刀切除胡萝卜块段截面的表面部分，余下部分切成包含形成层的长、宽约5mm，厚约1mm的小片。

在完成切割后，将解剖刀和镊子放入95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后，放回原处，待冷却后即可使用。

在每一次使用镊子、解剖刀后，都要对其消毒一次。

（6）接种：

在酒精灯焰附近处，取下三角瓶的封口膜，用火烧灼瓶口。

用无菌镊子夹取胡萝卜薄片并迅速半插入琼脂培养基上，每瓶放4-5片，注意将近根尖的一面接触培养基。

将培养瓶口在酒精灯焰上小心地轻转灼燎数秒，立即用封口膜封好瓶口。

（7）培养：

将接种后的三角瓶放到光照培养箱中，在25℃下的黑暗中培养3-4周。

（1）接种1周-10天后，调查、计算污染率：

污染率（%）=污染的材料数/接种材料数×

100%

（2）每周观察并记录胡萝卜外植体产生愈伤组织的情况，包括出现愈伤组织前培养物的形态，愈伤组织出现的时间以及愈伤组织的形态特征（愈伤组织的颜色、质地等），4周后调查、计算愈伤组织诱导率：

诱导率（%）=形成愈伤组织的材料数/接种材料数×

（1）分析影响愈伤组织诱导的主要因素。

（2）以胡萝卜为材料为什么要强调要切取含有形成层部分，胡萝卜其它部分（如茎、叶、花）能否诱导出愈伤组织？