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2.4ATP荧光法稀释液的选择…………………………………………………………14

2.4.1ATP荧光法稀释液选择的目的…………………………………………………14

2.4.2ATP荧光法稀释液选择的步骤…………………………………………………14

2.4.3结果分析…………………………………………………………………………15

2.5ATP荧光法和平板菌落计数法之间的对应关系…………………………………18

2.5.1得到ATP荧光法和平板菌落计数法对应关系的目的…………………………19

2.5.2得到ATP荧光法和平板菌落计数法对应关系的步骤…………………………19

2.5.3结果分析…………………………………………………………………………20

2.6结论…………………………………………………………………………………21

3.关于ATP荧光法在乳制品行业的应用展望…………………………………………22

致谢………………………………………………………………………………………24

参考文献…………………………………………………………………………………25

附录一……………………………………………………………………………………27

附录二……………………………………………………………………………………27

附录三……………………………………………………………………………………27

绪论

细菌总数作为判定食品被细菌污染程度的标记,具有重要的卫生学意义。

液态生物制品如液态牛奶、低酒精度饮料酒等出厂前都需要经过食品卫生微生物学检验，达到相应的国标要求才能进入市场。

食品细菌学检验通常采用琼脂平板菌落计数法，该方法是根据每个活菌都可生长为一个菌落的原理设计，这种方法精度高，但是操作过程一般需要2-3的时间甚至更长，检验结果往往滞后。

众所周知，许多食品在生产当天就必须出售，因此急需即时性的细菌学检验方法。

近年来，国外普遍采用HACCP（食品制造过程中卫生管理认证）制度，更迫切需要在食品制造过程中能快速、简便检测食品生产环境清洁度和食品是否达到卫生标准的方法。

ATP生物荧光法作为一种简便、快速的微生物检验方法，近年来在国外备受瞩目，并得以广泛应用。

ATP作为生物代谢的能量来源，是微生物不可缺少的物质。

如果捡样中污染了微生物，用有机溶剂等专用试剂破菌后，ATP就被释放出，利用ATP生物荧光法即可测出ATP的含量。

由于活的微生物体内的ATP浓度基本稳定，使得ATP浓度与活的微生物之间存在线性关系，故ATP含量可以成为活的微生物的检测指标。

本课题以巴氏灭菌奶为检测对象，进行琼脂平板计数和ATP荧光法两种微生物检测方法，然后将两种方法的结果进行比较，得到二者之间的相关性，探索如何对牛奶进行预处理才可以使得ATP生物荧光法代替传统的平板菌落计数法进行牛奶中总菌数的测定。

由于捡样中游离ATP的存在，所以我们应该探索最优的预处理方法，尽量减少游离ATP以及其他杂质对检测结果的干扰，然后得到传统平板菌落计数法和ATP生物荧光法的较高相关性，绘制标准曲线，可直接将ATP生物荧光法应用于牛奶中微生物活性的快速检测，缩短微生物的检测周期。

1.研究思路

将现有的牛奶样品浓度梯度稀释后采用传统的平板菌落计数法进行计数，并用ATP生物荧光检测仪测出不同浓度的牛奶样液的荧光值，即可做出活菌总数和荧光值的对应曲线，并将其作为ATP生物荧光检测仪检测牛奶中总菌数的标准曲线。

我们在实验中使用的样品是光明优倍鲜牛奶（市面销售的巴氏灭菌奶），能在市面上出售的巴氏灭菌奶应为合格产品，那么，可能出现总菌数过少导致有传统法测出的菌落总数不准或者根本无法测出。

为了避免这种情况的出现，我们在实验过程中，人为添加大肠杆菌，提高牛奶样液中的含菌量，再进行实验。

纯牛奶中各类营养物质含量丰富，则有可能会影响ATP生物荧光检测仪的检测结果，需要我们对牛奶样液进行一定的预处理；

但是，我们还不清楚牛奶中的营养物质会对检测造成何种影响。

所以，我们先暂定两种预处理方法：

过滤和稀释。

若牛奶中的营养物质对荧光仪的检测影响较大，过滤可以除去牛奶中的大分子蛋白质，降低营养物质对检测的影响；

若牛奶中的营养物质对荧光仪的检测影响不大，那么，采用稀释的方法，不需要复杂的预处理，简便省时。

确定了预处理方案后，稀释液的选择也需要谨慎的选择，实验室条件有限，我们暂定稀释液为无菌水和缓冲液。

在得到最优的预处理方案后，做出荧光值和菌数的对应曲线，得到相关系数。

2.研究方案

2.1牛奶原液总菌数的检测

2.1.1牛奶原液总菌数检测的目的

为了确定市面上销售的巴氏灭菌奶的灭菌效果和之后的实验是否要采用加菌的办法得到较好的实验结果，我们首先采用平板菌落计数法检测牛奶原液中的总菌数，以便确定之后的实验方案。

2.1.2牛奶原液总菌数检测的步骤

（1）设备

SPX-250型恒温培养箱；

YX-4502高压灭菌锅；

SW-CJ-ID型单人超净工作台；

250ml锥形瓶（2个）;

玻璃试管（6只）；

试管架；

培养皿（18个）；

小烧杯；

10ml移液管；

微量移液枪及一盒吸头；

酒精灯；

（2）试剂

营养琼脂粉；

盒装牛奶；

（3）步骤

①培养基的配制；

（详细方法见附录一）；

将六只试管中均用10ml移液管加入9ml的蒸馏水，用盖子盖好；

18个培养皿装盒，一盒吸头用报纸包好，然后把两瓶培养基、6只试管、2盒培养皿、一盒吸头放入高压蒸汽灭菌内灭菌（121℃，20min）；

②样品的稀释

待所有灭菌过的器具冷却后，用移液枪吸取吸牛奶原液1ml加入有9ml无菌水的无菌试管内，盖好盖子后将其震荡至混匀（大约5min左右），制成1:

10的样品匀液；

用1ml微量移液枪吸取1:

10样品匀液1ml，沿管壁缓慢注于盛有9ml稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管使其混合均匀，制成1:

100的样品匀液；

重复上述步骤，制备10倍系列稀释样品匀液。

每递增稀释一次，换用1次吸头；

③倾注法到平皿

选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做三个平皿。

同时，分别吸取1ml空白稀释液加入三个无菌平皿内作空白对照；

及时将15ml～20ml冷却至46℃的平板计数琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀；

④培养

等到培养皿内的琼脂凝固后，将平板倒置，在37℃±

1℃培养箱中培养48h±

3h；

⑤菌落计数要求

用肉眼观察，必要时可以用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。

菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。

选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。

低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。

每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；

若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，将每条单链作为一个菌落计数；

2.1.3结果分析

平板上的菌落生长状况并不理想，甚至有些平皿中并未长出菌落。

具体情况见下表。

表一

稀释倍数

10

100

1000

10000

CFU

24/16/28

5/1/7

0/1/0

0/0/0

计算得，总菌数=

；

结论：

部分平皿并未长出菌落，并且长出菌落的平皿都未达到计数要求，这证明巴氏灭菌奶中总菌数过少，为了之后的实验结果尽可能的准确，我们需要向牛奶中添加大肠杆菌。

2.2牛奶原液加菌后总菌数的测定

2.2.1牛奶原液加菌后总菌数的测定的目的

为了保证样液可以用传统平板菌落计数法计数，并达到有效计数范围；

这样才能使ATP生物荧光法的计数和传统平板菌落计数法更好的对应起来。

2.2.2牛奶原液加菌后总菌数的测定的步骤

（1）设备

基本同2.1.2

（1），并且在2.1.2的基础上多准备一只试管；

同2.1.2

（2）；

（3）步骤

①按照2.1.2（3）①中的方法将培养基配制好，并且在五只试管中用10ml移液管加入9ml蒸馏水，并用盖子盖好；

在另一只试管中用同一只10ml移液管加入10ml的蒸馏水，放入4个玻璃珠，用盖子盖好后做上标记，灭菌后用以配制菌悬液。

在最后一只试管中用10ml移液管加入8ml蒸馏水，盖上盖子后做好标记；

将培养基、装有无菌水的试管、培养皿放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌（121℃，20min）；

②样品的稀释及加菌

待所有灭菌过的器具冷却后，将做有10ml无菌水标记的试管取出，在保存菌种的斜面中用接种环挑取适量的大肠杆菌置于盛有10ml无菌水的试管中，将试管放入摇床中震荡20min，使菌悬液混匀；

用移液枪吸取1ml菌悬液加入做有8ml无菌水标记的试管内；

换一次吸头后，吸取1ml牛奶原液加入做有8ml无菌水标记的试管内，将盖子盖好，混匀。

然后将加菌的牛奶原液10倍浓度梯度稀释，具体操作方法参照2.1.2（3）②；

选择2个～3个适宜稀释度的加菌后的样品匀液，吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做三个平皿。

具体要求同2.1.2（3）⑤；

2.2.3结果分析

具体结果详见表二；

表二

100000

无法计数

143/138/182

20/34/17

稀释10000倍的计数均在计数要求内，故计算得：

；

利用传统的方法对牛奶进行总菌数的检测耗时较长而且也不准确；

传统的平板菌落计数法适合菌数较多的样液的检测；

无法得知较为准确的总菌数，只能得到平均值。

2.3ATP荧光法的预处理方法的选择

2.3.1ATP荧光法的预处理方法选择目的

对牛奶进行预处理的目的是为了减少牛奶中各类营养物质对快速检测的干扰，现有两种预处理方法：

过滤后需要无菌水清洗滤膜；

而稀释不需要特别的操作步骤，比较省时省力；

我们需要找出简便同时容易操作的语出方法。

2.3.2ATP荧光法的预处理方法选择的步骤

BacTiter-Glo微生物细胞活性检测仪；

酶标仪多孔板；

微量移液枪及吸头若干；

玻璃试管（7支）；

10ml移液管；

滤膜若干（0.22μm）；

BacTiter-Glo缓冲液；

BacTiter-Glo底物；

①配制好BacTiter-Glo试剂，具体方法详见附录二；

②取出一支试管，用10ml移液管加入10ml蒸馏水，加入4个玻璃珠，做好标记；

另取出一支试管用10ml移液管加入8ml蒸馏水，加入4个玻璃珠，做好标记；

剩下的5支试管均用10ml移液管加入9ml蒸馏水；

将所有盛有无菌水的试管和装有枪头的盒子（盒子需用报纸包好）放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌（121℃，20min）；

将酶标仪多孔板放入SW-CJ-ID型单人超净工作台开紫外灯灭菌20min；

③待灭菌完的所有物品冷却后，将做有10ml无菌水标记的试管取出，在保存菌种的斜面中用接种环挑取适量的大肠杆菌置于盛有10ml无菌水的试管中，将试管放入摇床中震荡20min，使菌悬液混匀；

然后将加菌的牛奶原液和菌悬液均进行10倍浓度梯度稀释，具体操作方法参照2.1.2（3）②，做8个梯度稀释；

④用移液器吸取配制的10倍梯度系列稀释样液各0.1ml，置于酶标仪多空板内，加入混合好的BacTiter-Glo试剂0.1ml，室温下放置5min促进酶促反应，在酶促反应进行的过程中放在桌面上轻微晃动，使试剂与样液混合均匀，然后进行检测；

⑤将检测完的样液超净工作台中，进行过滤，用无菌独立包装的0.22μm的滤膜过滤，取出一支装有样液的试管用滤膜过滤后用多余的无菌水将滤膜洗净，从稀释倍数高到低依次过滤。

⑥将过滤后的样液再测一次荧光值；

2.3.3结果分析

（1）预处理选择稀释的方法

牛奶原液加菌后，直接检测的结果如表三；

表三

稀释倍数的对数

1

2

3

4

5

6

7

8

第一次检测的荧光值

915502

88390

10827

3263

2560

1449

4026

1841

第二次检测的荧光值

906014

87412

10657

3185

2530

1488

4051

1798

平均值

910758

87901

10742

3224

2545

1468.5

4038.5

1819.5

后面两个数值明显不成梯度，舍去，取前六点作图，得到图一；

图一

从上图中，可以得知，后两点的斜率与前四面明显不一致，应舍去，故取前四点作图，得到图二；

图二

（2）预处理选择过滤的方法

将

（1）中的样液过滤，发现稀释倍数为10-1000的样液可能由于牛奶里面的营养物质含量过多，将滤膜堵死，导致样液溢出或者根本无法滤过，所以只得到了几组稀释倍数较高的样液荧光值，检测的结果详见表四；

表四

3174

3069

2538

1655

3176

3013

3006

2472

1721

2980

3093.5

3037.5

2505

1688

3078

最后一个数值明显反常，舍去，取前四点作图，得到图三；

图三

从上图中得知，后两点的斜率与前三点相差较大，可以将最后一点舍去作图，得到图四；

图四

过滤的方法操作复杂且在浓度较高的时候由于蛋白质等营养物质含量较高，样液会溢出，也有可能在过滤后用无菌水清洗滤膜的时候存在未洗净的现象，从而影响检测结果；

而稀释的方法操作起来较为简单，省时且易上手，推广起来较为方便；

进而对比上面的图一到图四，不难发现，采用稀释的预处理方法后检测得到的荧光值梯度明显，且数据相关性高，可信度高；

但是采用过滤的预处理方法后检测得到的荧光值存在梯度，但是摆动幅度较大且相关性低，可信度有待验证。

所以，综上所述，预处理的方法选择稀释优于过滤。

2.4ATP荧光法稀释液的选择

2.4.1选择ATP荧光法稀释液的目的

翻阅相关文献可知，磷酸二氢钾缓冲液有稳定溶液中ATP的作用，可以在检测的时候有效抑制ATP荧光值的衰减，但同时磷酸二氢钾也会抑制反应中的荧光作用；

无菌水仅仅作为稀释介质，没有稳定ATP的作用，也不会抑制荧光作用，对比二者，选择最优的稀释介质。

2.4.2ATP荧光法稀释液的选择步骤

玻璃试管（18支）；

10ml移液管（2支）；

磷酸二氢钾缓冲液；

②配置好磷酸二氢钾缓冲液，具体方法详见附录三；

③取出一支试管，用10ml移液管加入10ml蒸馏水，加入4个玻璃珠，做好标记；

另取出一支试管用新的移液管加入磷酸二氢钾缓冲液10ml；

然后另取出两支试管分别用不同的10ml移液管加入8ml蒸馏水和8ml磷酸二氢钾缓冲液，往两只试管中分别加入4个玻璃珠，分开做好标记；

取剩下的7支试管均用10ml移液管加入9ml蒸馏水；

最后7支试管用10ml移液管加入9ml磷酸二氢钾缓冲液；

将所有盛有无菌水的试管和盛有枪头的盒子（盒子需用报纸包好）放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌（121℃，20min）；

④待灭菌完的所有物品冷却后，将做有10ml无菌水标记和10ml缓冲液标记的两支试管取出，在保存菌种的斜面中用接种环挑取适量的大肠杆菌分别置于盛有10ml无菌水的试管和10ml缓冲液的试管中，将两支试管均放入摇床中震荡20min，使菌悬液混匀；

用移液枪吸取1ml无菌水稀释的菌悬液加入做有8ml无菌水标记的试管内；

然后将加菌的牛奶原液用无菌水进行10倍浓度梯度稀释，具体操作方法参照2.1.2（3）②，做8个梯度稀释；

用移液枪吸取1ml由缓冲液稀释的菌悬液加入做有8ml缓冲液标记的试管内；

换一次吸头后，吸取1ml牛奶原液加入做有8ml缓冲液标记的试管内，将盖子盖好，震荡混匀。

然后将加菌的牛奶原液用缓冲液进行10倍浓度梯度稀释，具体操作方法与用无菌水进行的浓度梯度稀释的操作一样；

⑤用移液器吸取配制的10倍梯度系列稀释样液各0.1ml，置于酶标仪多空板内，加入混合好的BacTiter-Glo试剂0.1ml，室温下放置5min促进酶促反应，在酶促反应进行的过程中放在桌面上轻微晃动，使试剂与样液混合均匀，然后进行检测；

2.4.3结果分析

（1）稀释介质选择缓冲液

稀释介质若选择缓冲液，牛奶原液加菌稀释后，用ATP荧光仪检测的具体结果如下，详见表五；

表五

53561

1923

305

179

304

246

289

252

53799

1984

331

170

318

263

270

274

53680

1953.5

174.5

311

254.5

279.5

取表五中的数值作图，得到图五；

图五

由图上得知，前四点与后四点的斜率明显不一致，故取前四点作图，得到图六；

图六

（2）稀释介质选择无菌水

牛奶原液加菌用无菌水稀释后，直接检测的结果如表六；

表六

30142

22037

20663

17849

17684

16156

10824

8502

31178

24314

19973

17962

16980

15973

10221

7963

30660

23175

20318

17905

17332

16064

10522

8232

取平均值作图，得到图七；

图七

从上图中，可以得知，后两点的斜率与前四面明显不一致，应舍去，故取前四点作图，得到图八；

图八

对比上面的图表可知，磷酸二氢钾的缓冲液虽然有稳定溶液中ATP的作用，但是检测出来的效果不及无菌水；

磷酸二氢钾缓冲液作为稀释液检测得到的结果数据波动较大，前四点成一定梯度，而后四点基本在一条直线上，可能由于总菌数过少且磷酸缓冲液可抑制荧光作用才会出现这样的结果；

为保证浓度梯度完整，总菌数过少的时候仍然可以检测得到有效结果，故选择无菌水作为预处理的稀释液。

2.5ATP荧光法和平板菌落计数法之间的对应关系