发酵工程教案打印Word格式文档下载.docx
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是指利用生物的生命活动产生的酶，无机或有机原料进行酶加工，获得产品的工业。
2.获得发酵产品的条件
•适宜的微生物
•保证或控制微生物进行代谢的各种条件
•进行微生物发酵的设备
•精制成产品的方法的设备
三、发酵工业的发展历史
•天然发酵阶段
•纯培养技术的建立：
巴斯德，科赫等。
人为地控制微生物的发酵进程。
•通气搅拌发酵技术的建立：
青霉素的生产——深层培养
•代谢控制发酵技术：
微生物进行甾体化合物的转化，Glu和Lys发酵生产。
对微生物具有高度专一性的酶反应作为合成手段的一部分加以利用，进行合理的代谢。
•开拓发酵原料时期：
石油发酵，醋酸生产谷氨酸
•基因工程阶段：
采用酶学的方法，将不同来源的DNA进行体外重组，再把重组DNA设法转入受体细胞内，并进行繁殖和遗传下去。
人们能够根据自己的意愿将微生物以外的基因件导入微生物细胞中，从而达到定向地改变生物性状与功能创新的物种，使发酵工业能够生产出自然界微生物所不能合成的产物。
第二章生产中常用菌种的分离、选育和保藏
第一节菌种的分离简介
一、菌种的来源
•根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；
•从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
•二、分离思路
•新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。
•实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。
•有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。
三、新种分离与筛选的步骤
•定方案：
首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。
•采样：
有针对性地采集样品。
•增殖：
人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。
•分离：
利用分离技术得到纯种。
•发酵性能测定：
进行生产性能测定。
这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。
（一）采样
1、采样对象
以采集土壤为主。
一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。
采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。
•2、采样季节：
以温度适中，雨量不多的秋初为好。
•3、采土方式：
在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。
为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。
（二）增殖培养
•为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。
•例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。
这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。
（三）培养分离
•尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。
因此还必须分离，纯化。
在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。
纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。
•（四）筛选
•这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。
（五）毒性试验
•自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。
据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。
七、生产选种
是在长年累月的生产实践中，在培养工艺条件没有任何可见变更情况下，突然发现某些批次生产水平提高较大，这就有可能是个别自然变异朝更好的方向变的细胞，在这种条件下很适应于培养条件，并逐渐显示出它的生长优势，这种优势的发展，促使它优良的生产性能表露。
进行类似新种筛选分离，达到获得新的优良生产菌种的目的。
第二节诱变育种
以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。
诱变育种：
以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。
诱变
一、诱变剂和诱变处理
物理诱变剂：
射线如紫外线、X—射线、γ—射线，快中子；
物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。
许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。
其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。
化学诱变剂：
化学因子如碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化剂等。
化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。
使用化学诱变剂的优缺点：
1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。
2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。
而用电离辐射±
行工作时，设备费用大，并要注意安全性。
3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。
诱变剂的选择
1．碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，回复突变率高，效果不大。
2．亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。
其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。
3．吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。
4．紫外线仍十分有效。
电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。
但它可能影响邻近基因的性能。
二、诱变育种步骤
（一）出发菌株的选择
1．自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。
2．在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。
3．每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。
4．出发菌株开始时可以同时选2～3株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。
5．要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。
6．根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。
有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：
有的作用于休止期，就可选用孢子。
（二）处理菌悬液的制备
这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。
（三）诱变处理
根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。
（四）中间培养
由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程（生理延迟），需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。
这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。
方法：
让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。
这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。
（五）分离和筛选
筛选分初筛和复筛。
初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。
复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。
因此在具体方法上就有差异.
例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。
在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。
在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。
紫外线的诱变育种
紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为2537A．灯与处理物的距离为15～30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。
一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。
被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个／ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个／ml。
由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。
由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。
（二）操作步骤
1．将细菌培养液以3000r／min离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。
2．将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。
将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个／ml左右，作为待处理菌悬液。
3．取2～4m1制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。
在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～50s。
操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。
4．取未照射的制备菌液和照射菌液各o.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。
5．取照射菌液2ml于液体培养基中（300ml三角瓶内装30ml培养液），120r／min振荡培养4～6h。
6．取中间培养液稀释分离、培养。
7．挑取菌落进行筛选。
第四节菌种的衰退、复壮与保藏
一、菌种的衰退
衰退的原因：
1.菌种保藏不当
2.菌种生长条件没有得到满足
二、菌种的复壮
1.纯种分离
2.通过寄主体进行复壮
3.淘汰已衰退的个体
三、菌种保藏
1.原理人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态。
低温、干燥、缺氧、缺营养物质
2.方法
（1）斜面保藏法：
用螺旋口试管防失水，尽量减少碳源含量
（2）干燥保藏法：
沙土管，固体曲
（3）悬液保藏法：
将微生物悬浮在不含养分的溶液中（水、生理盐水、buffer）
（4）冷冻干燥保藏法：
冷冻，减压蒸发除去水分，使生命活动停止
（5）低温保藏法：
大多数微生物可在-20℃以下的低温中保藏，比冷冻干燥更为常用。
（6）液氮保藏法
第三章微生物的代谢
一、微生物的代谢产物
初级代谢产物
微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质。
举例：
氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。
特征：
不同的微生物初级代谢产物基本相同；
初级代谢产物合成过程是连续不断的。
次级代谢产物
微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。
抗生物、毒素、激素、色素等。
不同的微生物初级代谢产物不同；
抗生素是一类具有特异性抑菌和杀菌作用的有机化合物。
二、微生物代谢的调节
酶合成的调节
微生物细胞内酶的种类：
组成酶：
微生物细胞内一直存在，合成是受遗传物质控制。
诱导酶：
在环境中存在某种物质的情况下才能够合成的酶。
亮白曲霉原来不能合成蔗糖酶，所以不能利用蔗糖，但如果在培养基内加入蔗糖，一段时间后，可合成蔗糖酶，并利用蔗糖。
酶活性的调节
两种调节的对比
三、微生物代谢的人工控制
目的
最大限度积累对人类有用的代谢产物
措施
改变微生物遗传特性
控制生产过程种各种条件
实例
人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸；
人工控制谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸。
人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸
黄色短杆菌的代谢过程
第四章培养基及其制备
从微生物营养要求看，所有微生物都需要碳源，氮源，无机元素，水及生长物质。
如果是好氧微生物还需要氧气。
在实验室规模上配制含有纯化合物的培养基非常简单，但在大规模生产上是不合适的。
第一节工业发酵培养基
发酵培养基的作用：
-满足菌体的生长
-促进产物的形成
一、工业上常用的碳源（carbonsource）
1.应用最广的是谷物淀粉（玉米、马铃薯、木薯淀粉），淀粉水解后得葡萄糖。
使用条件：
微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类。
缺点：
a.难利用、发酵液比较稠、一般>
2.0%时加入一定的α-淀粉酶。
b.成分较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等。
优点：
来源广泛、价格低，可解除葡萄糖效应。
2.葡萄糖
-所有的微生物都能利用葡萄糖，但会引起葡萄糖效应。
-工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质量指标。
3.糖蜜
制糖工业上的废糖蜜或结晶母液
包括：
甘蔗糖蜜—糖高，氮少
甜菜糖蜜
糖蜜使用的注意点：
除糖份外，含有较多的杂质，对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。
二、工业上常用的氮源（nitrogensource）
1.无机氮（迅速利用的氮源）
种类：
氨水、铵盐或硝酸盐、尿素
特点：
吸收快，但会引起pH值的变化
选择合适的无机氮源有两层意义：
-满足菌体生长
-稳定和调节发酵过程中的pH
无机氮源的影响：
硫酸铵>
硝酸铵>
硝酸钠>
尿素
2.有机氮：
来源：
一些廉价的原料，如玉米浆、豆饼粉、花生饼粉、鱼粉、酵母浸出膏等。
其中玉米浆（玉米提取淀粉后的副产品）和豆饼粉既能做氮源又能做碳源。
成分复杂：
除提供氮源外，还提供大量的无机盐及生长因子。
微生物早期容易利用无机氮，中期菌体的代谢酶系已形成——有机氮源。
有机氮源来源不稳定，成份复杂，所以利用有机氮源时要考虑到原料波动对发酵的影响。
三、无机盐（inorganicmineral）
硫酸盐、磷酸盐、氯化物及一些微量元素。
无机盐含量对菌体生长和产物的生成影响很大。
四、生长因子（growthfactor）
微生物生长不可缺少的微量有机物质。
如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素。
生长因子不是所有微生物都必需的。
只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物。
如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型（biotinauxotroph）,以生物素为生长因子。
1.生物素
作用:
（1）主要影响细胞膜通透性。
P263
（2）影响菌体的代谢途径。
生物素浓度对菌体生长和谷氨酸积累均有影响。
大量合成谷氨酸所需要的生物素浓度比菌体生长的需要量低，即为菌体生长需要的“亚适量”。
生物素过量：
菌体大量繁殖，不产或少产谷氨酸。
生物素不足：
菌体生长不好，谷氨酸产量也低。
-谷氨酸产生菌为生物素缺陷型。
-要达到菌体生长需要的“亚适量”。
生物素存在于动植物组织中，多与蛋白质呈结合状态存在。
用酸水解可以分开。
那么，生产上有哪些原料可以作为生物素来源呢？
2.提供生长因子的农副产品原料
（1）玉米浆：
（cornsteepliquor,CSL）
最具代表性。
虽然主要用作氮源，但含有乳酸，少量还原糖和多糖，含有丰富的氨基酸，核酸，维生素，无机盐等。
常作为提供生长因子的物质。
所以，从某种意义上说，玉米浆液用于配制发酵培养基是发酵工业中的一个重大发现。
（2）麸皮水解液：
可代替玉米浆，但蛋白质，氨基酸等营养成分比玉米浆少。
（3）糖蜜：
两种糖蜜（canemolasses，beetmolasses）均可代替玉米浆。
但氨基酸等有机氮含量较低。
（4）酵母：
可用酵母膏，酵母浸出液或直接用酵母粉。
第二节淀粉水解糖的制备
在工业生产中，将淀粉水解为葡萄糖（glucose）的过程称淀粉的糖化，制得的溶液叫淀粉水解糖。
其主要糖分是葡萄糖。
根据水解条件不同，尚有数量不等的少量麦芽糖及其它一些二糖，低聚糖等复合糖。
一、淀粉水解制糖的意义
1.大多数微生物不能直接利用淀粉（所有的氨基酸生产菌不能直接利用）
2.有些微生物能够直接利用淀粉作原料，但必须在微生物产生淀粉酶后才能进行，过程缓慢，发酵周期延长。
3.若直接利用淀粉作原料，灭菌过程的高温会导致淀粉结块，发酵液粘度剧增。
二、淀粉水解糖的制备方法及原理
（一）酸解法（acidhydrolysismethod）
以酸为催化剂，在高温高压下使淀粉水解生成葡萄糖的方法。
1.水解过程：
总反应式：
（C6H10O5）n+nH2O→nC6H12O6
过程：
（C6H10O5）n→（C6H10O5）x→C12H22O11→C6H12O6葡萄糖
淀粉糊精麦芽糖
H+对作用点无选择性，A-1,4-糖苷键和A-1,6-糖苷键均被切断。
2.葡萄糖的复合反应和分解反应
在水解过程中，由于受到酸和热的作用，一部分葡萄糖会发生复合反应和分解反应。
淀粉
↓盐酸
复合反应葡萄糖分解反应
↙↗↘
复合二糖5‘－羟甲基糠醛
↓↑↓
复合低聚糖有机酸、有色物质
损失葡萄糖量7％<
1％
不利影响：
（1）降低了葡萄糖的收率。
（2）给产物提取和糖化液精制带来困难。
复合反应：
葡萄糖分子间经1，6糖苷键结合成龙胆二糖（有苦味），异麦芽糖和其它低聚糖（复合低聚糖）。
生成的多数复合糖不能被微生物利用，使发酵结束时残糖高。
分解反应：
生成的5‘－羟甲基糠醛是产生色素的根源，增加了糖化液精制脱色的困难。
如何控制分解反应和复合反应的发生？
（1）淀粉乳浓度
（2）酸浓度都不能过高
（3）温度
3.评价
工艺简单，水解时间短，生产效率高，设备周转快。
（1）副产物多，影响糖液纯度，一般DE值（葡萄糖值）只有90％左右。
（2）对淀粉原料要求严格，不能用粗淀粉，只能用纯度较高的精制淀粉。
DE值：
dextroseequivalentvalue
（葡萄糖当量值）
表示淀粉糖的含糖量。
还原糖含量（％）
DE值＝----------х100％
干物质含量（％）
（二）酶解法（enzymehydrolysismethod）
用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的工艺。
分两步：
（1）液化：
用A-淀粉酶将淀粉转化为糊精和低聚糖
（2）糖化：
用糖化酶（又称葡萄糖淀粉酶）将糊精和低聚糖转化为葡萄糖。
所以，淀粉的液化和糖化均在酶作用下进行，又称双酶法（doubleenzymehydrolysismethod）。
液化（liquification）
α－淀粉酶水解底物内部的α－1,4糖苷键，不能水解α－1,6糖苷键，一般采用耐高温淀粉酶，使液化速度加快。
85－90℃。
淀粉的糊化与老化：
由于淀粉颗粒的结晶性结构对酶作用的抵抗力非常强，需要先加热淀粉乳，使淀粉颗粒吸水膨胀，糊化，破坏结晶性结构。
糊化：
淀粉受热后，淀粉颗粒膨胀，晶体结构消失，互相接触变成糊状液体，即使停止搅拌，淀粉也不会再沉淀的现象。
老化：
指分子间氢键已断裂的糊化淀粉又重新排列形成新的氢键的过程，也就是复结晶的过程。
▲淀粉酶很难进入老化淀粉的结晶区起作用，必须采取相应的措施控制糊化淀粉的老化。
液化程度的控制（液化后需糖化的原因）：
如果让液化持续下去，虽然最终产物也是葡萄糖和麦芽糖，但：
a.糖液的DE值低（α-淀粉酶不能水解α-1,6糖苷键）
b.液化在较高温度下进行，液化时间加长，一部分已液化的淀粉又会重新结合成硬束状态，老化，使糖化酶难以作用。
c.液化的目的是为了给糖化酶的作用创造条件，而糖化酶水解糊精及低聚糖等分子时，需先与底物分子生成络合结构，然后发生水解作用，这就要求被作用的底物分子有一定的大小范围才有利于糖化酶生成这种结构，底物分子过大或过小都会妨碍酶的结合和水解速度。
根据生产经验，DE值在20-30之间为好，液化终点可通过碘液判断，此时呈棕色。
P25
液化到终点后，为了避免液化酶对糖化酶的影响，需对液化液进行灭酶处理，升温到100℃，保持10分钟，降温，供糖化用。
2.糖化（saccharification）
糖化酶从非还原性末端水解α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键。
终点确定：
DE值达最高时（DE值不再上升时），停止酶反应（加热至80℃，20min灭酶）。
否则DE值将由于葡萄糖经α-1,6糖苷键起复合反应而降低。
糖化的温度（50-60℃）和pH值（4.0-5.0）决定于所用糖化剂的性质。
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