《基因工程》 考试重点总结Word文件下载.docx

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（3）基因组学与生物信息学的应用。

2、基因工程的应用：

（1）生物反应器（bioreactor）：

大规模生产生物活性分子如生长激素、胰岛素等。

（2）遗传改良（geneticimprovement）、分子育种（molecularbreeding）、设计构建新物种。

（3）基因治疗（genetherapy）：

人体转基因或基因组编辑。

第三节基因的结构——基因操作的理论基础

一、基因的结构组成对基因操作的影响

1、基因及其产物的共线性：

一个基因的核苷酸序列与其产物的氨基酸序列一一对应。

N个氨基酸=3N个编码碱基。

2、基因及其产物的非共线性。

间断基因。

内含子（intron）是指真核基因在RNA加工过程中从原初转录本中剪去而不进入成熟RNA结构、不具有氨基酸编码能力的一段序列。

外显子（exon）：

是真核基因转录本中剪去内含子后所保留的RNA片段，它们拼接并进行适当修饰后成为成熟RNA并执行相应功能。

3、基因的重叠性与可变性：

基因的重叠性：

单个DNA序列可编码一个以上的蛋白质，它们在结构上可以具有序列重复性，也可以是相互完全不同的全新蛋白质。

原因：

可变性转录起始位点、可变性起始位密码子、可变性编码终止位点、可变性剪接。

开放读码框（openreadingframe，ORF）：

成熟mRNA中从起始密码子ATG至终止密码子（TAA、TAG或TGA之一）之间形成的一个连续的氨基酸编码区间。

以起始密码子的第1个碱基作为+1，其5’方向的第1个碱基为-1。

4、启动子和终止子

启动子（promoter）：

基因转录过程中控制起始的部位，通常是位于转录起始位点5’上游的一段DNA区间，其上有许多顺式元件。

转录起始位点（transcriptionstartsite）：

起始转录的第一个碱基，也是掺入到RNA中的第1个碱基。

在转录研究中记为+1，其5’方向的第1个碱基（已属于启动子而非转录区）为-1。

侧翼序列（flankingsequence）：

一条核酸单链上位于某一特定位置的5’或3’方向的序列。

上游（upstream）：

一条核酸单链上位于某一碱基的5’方向。

下游（downstream）：

一条核酸单链上位于某一碱基的3’方向。

终止子（terminator）：

位于基因的3’部位、终止基因转录过程的一段DNA区间。

有依赖不依赖ρ因子两种。

核糖体结合位点（ribosomalbindingsite,RBS）：

位于mRNA起始密码子及其正上游的一段区间，是核糖体结合并起始翻译过程的位点。

原核和真核的RBS显着不同。

转录单位（transcriptionunit）/转录本（transcript）：

从转录起始位点直至转录的最后一个碱基之间被转录的RNA序列，可以包含一或多个蛋白编码框。

亚克隆（subcloning）：

1、将大片段克隆子的DNA重新打断成小片段，然后分别克隆到新的载体中，供进一步研究。

初步克隆中的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的DNA片段，在诸如表达序列分析和突变等操作中不便进行，因此必须将目的基因所对应的一小段DNA找出来，这个过程叫“亚克隆”。

2、通指将DNA片段从一个载体穿梭克隆到另一个载体的过程。

亚克隆技术：

泛指实验室中以DNA在大肠杆菌中经典克隆操作为核心的基本技术体系。

第2章分子克隆工具酶

第一节限制性内切酶

一、限制与修饰

1、限制与修饰现象：

限制（restriction）：

指一定类型的细菌可以通过限制性内切酶（restrictionednonuclease）的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主范围受到限制。

限制作用实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。

修饰（modification）：

指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶（methylase）的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。

修饰作用宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。

甲基化作用：

最主要的碱基修饰，使腺嘌呤A成为N6-甲基腺嘌呤，胞嘧啶成为5’-甲基胞嘧啶。

限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。

限制酶存在于细菌中，也存在于一些病毒中，真核生物中没有限制酶。

3.限制性核酸内切酶的种类

据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。

Ⅱ型限制酶用途大，多为同源二聚体，其中切口酶只在单链上产生切口，Ⅱs型识别序列和切割位置特殊。

二、限制酶识别的序列

1、限制酶识别序列的长度（n）：

一般为4-8个碱基对，最常见为6bp。

识别位点出现频率：

4n

2、限制酶识别序列的结构：

多数为回文结构（palindrome）即镜像对称结构。

一些酶可识别多种结构尤其是允许一些碱基是简并的，

还有一些酶识别序列呈间断对称，即回文对称序列之间可以间隔一定长度的任意碱基。

3、限制酶的切割位置：

多数在识别序列内部，也有在外部、两端、两侧或单侧的。

三、Ⅱ限制酶的功能和产生的末端类型

Ⅱ限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′端为OH，识别序列一般为4～6个碱基对，通常是反向重复顺序，具有180°

的旋转对称性，即回文结构。

Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA产生3种不同的末端类型。

1、对称型突出末端：

回文结构决定对称，分为5’突出和3’突出的粘性末端（cohesive/stickyend）两种。

2、平末端（bluntend）：

任何平末端酶的酶切产物可以互连，但连接效率比粘性末端低100倍左右。

3、非对称的突出末端：

因为识别序列是非回文的、简并的或存在间隔序列，故产生的粘性末端也为非对称的。

即使是单酶切限制片段在连接时也具有方向性。

4、同裂酶（isoschizomer）：

不同的酶识别序列相同，切割位点可以相同也可以不同，又分为同序同切酶、同序异切酶、同功多位酶和其它类型。

例：

SmaⅠ（CCC↓GGG）和XmaⅠ（C↓CCGGG）

5、同尾酶（isocaudarner）：

不同限制酶识别序可以相同，也可以不同，但它们产生的末端是一样的，末端间可以相互连接。

同尾酶在基因工程尤其是载体构建中有较大用途。

XhoⅠ（C↓TCGAG）与SalⅠ（G↓TCGAC）、

BamHI（G↓GATCC）和BglⅡ（A↓GATCT）

6、归位内切酶（homingendonuclease）：

一些线粒体、叶绿体、核DNA和T偶数噬菌体的内含子编码内切酶（称为I-prefix）或内含肽（intein）具有内切酶活性（称为PI-prefix）。

它们识别序列很长，核心识别序列一般为10-12bp，识别位点极少。

四、DNA末端长度对限制酶切割效率的影响

限制性核酸内切酶识别和切割靶序列时需要识别序列两侧具有一定长度的DNA，否则会降低切割效率。

对侧翼长度敏感性较低的酶有EcoRⅠ等，只要一个侧翼碱基即保证90%的效率。

对侧翼长度敏感性高的酶有AccⅠ、HindⅢ、PstⅠ等，侧翼3个碱基以上也未必理想。

设计引物、接头等时要考虑适当长度的保护碱基，载体构建时多克隆位点中的相临位置的酶的切割序列的选择也很重要。

限制酶的活性单位（unit）：

1个单位的酶是指在建议的缓冲液及温度下，在20μl反应液中反应1h，使1μgDNA（多用λ）完全消化所需要的酶的量。

五、位点偏爱

某些限制酶对同一底物中的不同位置的识别位点的切割效率不同，表现出偏爱性，这种现象称作位点偏爱。

某些噬菌体DNA中的某些相同的酶切位点对酶的敏感性不同。

λ噬菌体DNA为48502bp，两端为12bp粘性末端。

EcoRⅠ酶切割λ噬菌体中的5个位点时并不是随机的，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快10倍；

EcoRⅠ对腺病毒2DNA不同位置切点的切割速率也不同。

由于位点偏爱性，λDNA用HindⅢ消化而制备的λHindⅢDNAmarker中4.3kb条带甚至比2.0kb条带还弱。

切割时需要同时与2个识别位点作用（如NarⅠ等），或识别和切割时要求在DNA上有2个明显不同的结合位点，其中1个是另1个的被切割时起激活作用的变构位点。

应对办法：

超量用酶、延长切割时间。

七、限制酶的星活性（staractivity）

在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列不同但相似的序列，降低酶切反应的特异性，这种改变的特殊性称为限制性核酸内切酶的星活性。

产生原因：

①反应体系中甘油的浓度大于5%。

②酶用量过大，大于100U/μgDNA。

③低离子强度，小于25mmol/L。

④高pH，大于8.0。

⑤含有机剂如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等。

⑥Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价离子的存在。

易发生星活性的内切酶有：

EcoRI、HindⅢ、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。

办法：

对因改进。

八、单链DNA的切割

多数限制酶很难切割单DNA模板。

部分限制酶除切割双链DNA外，还可切割单DNA，但活性一般都不高。

切口酶虽然识别双链，但只在单链上切口，名称前要加一个N。

九、酶切位点的引入

现代基因工程中通过引物化学合成等方式可以很方便进向目标位置引入设计的酶切位点。

通过不同酶切末端的连接重组也可产生新的酶切位点，对具体情况的分析在设计中有价值：

5’突出末端补平后重连；

同尾末端连接；

平末端连接。

十、影响限制性核酸内切酶活性的因素

①DNA样品的纯度

DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等都有可能抑制酶活性。

可采用以下方法，提高酶活性：

加大酶的用量，1μgDNA用10U酶

加大反应总体积

延长反应时间

②DNA样品的甲基化程度

大肠杆菌中的dam甲基化酶在5′GATC3′序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、Mbol等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响。

大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5′CCAGG3′或5′CCTGG3′序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等，但BglI、KpnI不受影响。

采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA，可防止DNA的甲基化。

十一、基因组中酶切位点分布的不均一性

在基因组中酶切位点的分布并不是均一的。

大肠杆菌中六碱基识别的酶SpeⅠ平均60kb才出现1次。

酵母中重复序列以外富含GC的识别序列较少。

哺乳动物基因组中CG序列只有随机概率值的1/5，且多数发生胞嘧啶甲基化，SmaⅠ位平均约65kb才出现1次。

果蝇和线虫中CG基序虽然少，但不发生甲基化。

限制性核酸内切酶操作的注意事项

①商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积应不超过总体积的10%，否则酶液中的甘油浓度超过5%时将会抑制酶的活性。

②整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。

③当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量。

④当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液，若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。

⑤正确保存、分装和取用限制酶，抽提高质量的DNA。

Ⅱ限制性核酸内切酶的主要用途

①在特异位点上切割DNA，产生特异的限制性酶片段。

②建立DNA分子的限制酶图谱。

③构建基因文库。

④用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。

⑤改建质粒。

第二节甲基化酶

一、甲基化酶的种类

原核生物和真核生物中存在大量的甲基化酶（methylase），又称甲基转移酶（methyltransferase），大肠杆菌中有3种。

三、甲基化对限制酶切的影响

1、修饰酶切位点：

敏感的酶不能切开。

2、产生新的酶切位点：

为依赖于甲基化的限制酶创造切点。

3、对基因组作图的影响：

哺乳动物具有较多的m5CG序列具有组织细胞特异性，而且一个细胞内的m5CG甲基化不彻底，所以用m5CG甲基化敏感的限制酶作图时具有可变性，对图的稳定性带来影响。

植物的基因组DNA的甲基化程度高，作图时也要求选用对m5CG甲基化不敏感的限制酶。

第三节DNA聚合酶

DNA聚合酶（DNApolymerase）的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTPs等情况下）及其相辅的活性。

真核生物有4种DNA聚合酶：

α、β、γ、线粒体型。

原核生物有3种DNA聚合酶：

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。

二、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenowfragment）

（1）Klenow酶的基本性质：

大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理,获得N端三分之二的大肽段,即Klenow酶。

Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，但失去了5’→3’核酸外切酶活性。

（2）Klenow酶的基本用途（可被T4DNA聚合酶代替）：

补平由核酸内切酶产生的3′粘性凹陷末端

抹平DNA的3′粘性凸出末端

DNA片段的同位素末端标记

cDNA第二链的合成

双脱氧末端终止法测定DNA序列

三、T4DNA聚合酶（T4phageDNApolymerase）

（1）T4DNA酶的基本特性：

有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3的DNA聚合酶活性。

在无dNTP时，可以从任何3’-OH端外切

－在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸。

－在四种dNTPs均存在时，聚合活性占主导地位。

四、T7噬菌体DNA聚合酶（T7phageDNApolymerase）

持续合成能力最强

有3’→5’外切酶活性是Klenow酶的1000。

可代替T7噬菌体DNA聚合酶的用途。

五、耐热性的DNA聚合酶（第八章详讲）

来自噬高温细菌，如Taq、Pfu等。

高温下具有5’→3’DNA聚合酶活性，一般在72℃最理想。

有5’→3’外切酶活性。

具3’→5’外切酶活性者具校正（proofreading）功能，如Pfu。

否则无校正功能，如Taq。

用于PCR扩增。

反转录酶：

是依赖于RNA的DNA聚合酶，以RNA为模板聚合cDNA链，具有5′→3′的DNA聚合酶活性、5′→3′的RNA外切核酸酶活性和RNaseH活性，但缺乏3′→5′RNA外切核酸酶活性，所以反转录过程中无校正功能。

末端转移酶：

是不依赖于模板的DNA聚合酶，催化dNTP加于DNA分子的3’羟基端。

可产生同源多聚尾用于连接、引物退火，也可用于末端标记。

第四节其它分子克隆工具酶

一、依赖于DNA的RNA聚合酶

依赖于DNA的RNA聚合酶ATP（DNAdependentRNApolymerase）包括SP6噬菌体和T4噬菌体RNA聚合酶。

活性：

转录活性，无需引物，但识别特异启动子序列。

用途：

体外合成RNA分子作探针等。

用于表达外源基因的mRNA，然后用于翻译蛋白。

二、DNA连接酶（DNAligase）

DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5′-磷酸根和3′-羟基生成磷酸二酯键。

这种反应需要供给能量，大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以NAD+作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。

1、T4DNA连接酶的作用机制：

①ATP+DNAligase（E）→E-AMP+PPi。

②E-AMP上的AMP转移到DNA的5’磷酸根上，使其活化，释放出酶。

③活化的5’磷酸根与相邻的3′羟基形成3’,5’-磷酸二酯键，并释放出AMP。

3、平头双链DNA片段的连接操作

从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢的多。

提高平头末端连接效率的方法包括：

加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）。

加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会。

加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用。

加入单价阳离子（NaCl）,最终浓度150-200mmol/L。

第3章基因工程载体

一、基本概念

利用重组DNA技术分离目的基因，称之为基因克隆（genecloning）。

克隆（clone）：

作物动词时是指从单一祖先产生同一的DNA分子群体或细胞群体的过程，作名词时指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊群体。

基因文库（genelibrary）：

由大量的含有基因组DNA的不同DNA片段的克隆所构成的群体。

载体（vector）：

在基因工程中，携带着目的基因或DNA片段进入宿主细胞进行扩增或表达的工具DNA分子。

2、分类

按载体功能分：

克隆载体、表达载体

按载体性质分：

质粒载体、噬菌体载体、人工染色体

表达体系载体宿主

原核生物表达体系质粒、噬菌体细菌

酵母表达体系大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒酵母

转基因植物体系大肠杆菌-农杆菌穿梭载体（Ti质粒）、病毒等植株

哺乳细胞表达体系大肠杆菌-病毒穿梭载体、脂质体等培养动物细胞

基因直接导入DNA本身（基因枪微粒轰击法、注射法等）生殖细胞、体细胞、个体

三、基因工程载体必须具备的条件：

※

（1）有复制起点

※

（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点

※（3）具备合适的筛选标记

※（4）具备合适的拷贝数目

（5）分子量要相对较小

（6）在细胞内稳定性要高

（7）易分离纯化

※表示载体必须具备的条件

第一节质粒载体

一、质粒（plasmid）的基本特性

Plasmid独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。

质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子。

质粒DNA多呈超螺旋的共价闭合环状DNA（covalentlyclosedcircular,cccDNA），大小为1-200kb，可以持续稳定地处于游离状态，但一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随染色体复制而复制。

编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。

质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此应用广泛。

1、质粒的复制：

由复制子（ori，复制起始区及与此相关的顺式作用元件）决定。

质粒复制的机理请见教材。

2、质粒的拷贝数：

根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。

作为载体的质粒一般应该是松弛型的。

拷贝数是由复制起始点的类型决定的，如pMB1或ColE1。

pUC系列载体中的突变型pMB1复制子可达500-700个拷贝。

3、质粒的不亲和性（incompatibility）：

两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。

涉及细胞分裂过程中的竞争性选择。

不相容群。

4、质粒的转移性：

自然条件下质粒可通过细菌的接合（conjugation）的作用而转移到新的宿主细胞中。

三亲杂交法。

质粒载体应具备的条件：

1有特定的复制起始子。

2有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有1个；

2有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；

3有一定容量；

4有相当的拷贝数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。

二、标记基因

1、转化子标记基因：

用于鉴别目的DNA的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。

Ampr（氨苄青霉素抗性基因）：

水解β-内酰胺环。

Tetr（四环素抗性基因）：

阻止四环素进入细胞。

Cmr（氯霉素抗性基因）：

编码氯霉素乙酰转移酶。

Kanr（卡那霉素抗性基因）：

编码氨基糖苷磷酸转移酶。

supF（琥珀突变抑制基因）：

编码细菌抑制性tRNA，可翻译UAG为酪氨酸。

赭石突变（UAA），乳白突变（UGA）。

正向选择标记：

蔗糖致死基因sacB。

2、重组子标记基因：

用于将重组子与非重子区别开来。

α-互补（αcomplementation）：

人工突变使大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因（lacZ）缺失N-端的第11-41位氨基酸，而载体则携带有LacZ基因的N-端140个氨基酸和编码区段（lacZ’），二者单独存在时均无功能，但共存于一个大肠杆菌细胞时则发生功能互补，形成具有完全活性的LacZ酶。

多克隆位点（multiplecloningsite，MCS）：

载体上的一段人工设计和人工合成的DNA序列，含有多个在该载体唯一的限制性内切酶的切点，以方便载体与外源片段的重组。

插入失活（insretionalinactivation）：

当一段足够长的外源DNA片段插入到一个功能基因的编码区后，导致ORF移码或提前终止，严重破坏原基因的编码能力而使该基因失活。

蓝白斑筛选（white-bluescreening）：

空载体转化子经IPTG诱导表达后，由于α-互补而形成的功能性的LacZ蛋白，能够转化无色底物X-gal而形成深蓝色的产物，使菌落或噬菌斑显蓝色（蓝斑）；

重组载体的转化子中，由于lacZ’基因的插入失活而不能形成α-互补，在IPTG+X-gal