Toll样受体4与心肌缺血再灌注损伤的进展文档格式.docx

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内源性热休克蛋白60（heatshockprotein60，HSP60）。

后来另一些内源性TLR4配体，如表面活性剂A、透明质烷低聚糖、硫酸肝素片段、纤维蛋白原肽、β-防御素2等也相继被报道。

[3]

2TLR-4信号传导通路

2.1MyD88依赖途径

MyD88属于Toll／白细胞介素-1受体（IL一1R）家族和死亡结构域（deathdomain）家族成员，相对分子质量为35000，其本质为一种胞质可溶性蛋白，结构上有3个功能区域——N端的死亡区（deathdomain，DD）、中间区域及C端的Toll区。

DD约有90个氨基酸，可以介导有DD序列的蛋白质与蛋白质之间的相互作用，Toll区类似于IL-1R的胞质区，约有130个氨基酸，通过募集连接蛋白来传递信号。

DD是与启动细胞凋亡信号途径中的接头分子相互问进行信号转导的特征结构，但尚未发现其介导细胞凋亡。

DD激活胞内下游信号，其功能缺陷可导致信号转导中断。

MyD88依赖性信号途径是TLRs信号转导的共同通路，现有资料表明，TLR-2、3、4、7、9均通过该途径完成信号转导。

当TLRs与病原相关分子模式（pathogen—associatedmolecularpatterns，PAMPs）结合后，受体发生二聚化，此时胞质Toll的TIR结构域与MyD88的羧基末端相互作用，MyD88用它的DD募集下游同样含死亡作用域的丝／苏氨酸蛋白激酶一白细胞受体相关激酶（IRAK）IRAKl和IRAK2，导致IRAK自身磷酸化；

磷酸化的IRAK脱离MyD88与肿瘤坏死因子受体活化因子6（TRAF-6）相互作用，活化后的TRAF-6引起两条不同途径的信号转导，一条包括p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）家族和c-jun氨茎末端激酶（JNK）；

另一条是活化丝裂原活化蛋白激酶MPKKK，或称MAP3K家族成员核因子（NF）-κB诱导激酶（NIK），后者的磷酸化激活其抑制蛋白（IκB）激酶（IKKs），导致IκB泛素化而从IκB／NF-κB复合物释放，NF-κB由此活化转位进核，导致一系列特定基因的表达，从而产生原发性致炎因子如肿瘤坏死因子（TNF）-α白细胞介素（IL）-1等，完成炎症信号的转导过程。

[4]

2.2MyD88非依赖途径

TLR-4通过MyD88非依赖途径的信号转导，诱导干扰素（IFN）-13和IFN诱导基因的表达，并伴随NF-κB晚期活化。

在缺失MyD88的巨噬细胞中，用TLR-4配体如LPS刺激可引起NF—κB延迟出现，而其所诱导的炎性细胞因子产物却没有出现，这表明在TLR-4介导的信号转导中存在非依赖MyD88的途径。

在MyD88非依赖途径中又发现2种TIR包含蛋白TRIF和TRAM。

对TRIF突变和TRAM缺失小鼠的研究发现，TRIF和TRAM都是TLR-4介导的MyD88非依赖途径所必须的。

此信号转导通路最终导致炎性因子如IFN一口和IFN诱导蛋白10的释放[5]。

二、TLR-4在心肌缺血再灌注损伤中的作用

1.心肌缺血再灌注损伤

心肌缺血再灌注损伤是在长时间心肌缺血的基础上，恢复血流灌注，即复灌后缺血和组织损伤不减轻，反而加重甚至发生不可逆性损伤的现象。

局部和全身的炎症反应为心肌缺血再灌注损伤的特征，有可能发展为组织损伤并严重影响左心室功能的恢复。

早期的钙超载、活性氧的产生和随后中性粒细胞的募集及补体的激活都参与调节心肌缺血再灌注损伤的炎症反应。

但是，激发炎症反应的具体过程未完全阐明。

临床上，各种针对心肌缺血再灌注的抗炎策略在临床实践中被证实不够理想。

于是，对心肌缺血再灌注所诱导的炎症和损伤的基本机制的研究显得相当重要

2TLR-4在心肌缺血再灌注损伤中介导炎症的作用

TLR-4不仅在骨髓系细胞中表达，参与天然免疫，还可在心脏和脉管系统中表达参与病原微生物触发的炎症反应，具体作用表现为：

（1）心肌所表达的TLR-4对LPS所诱导的左心室功能不全及心肌中TNF-α、IL-1β、诱导型一氧化氮合酶的表达都是必需的[6,7]；

（2）接触LPS的冠状内皮细胞所表达的TNF-α、IL-1β、血管细胞黏附分子1及细胞间黏附分子1同样依赖于TLR-4[8]。

这些在细菌性脓毒血症期间TLR-4参与心血管炎症和功能不全中均得到了不同程度的证实。

TLR-4除了参与病原微生物触发的炎症反应外，有研究提示TLR-4也可能参与了缺血组织损伤的炎症反应。

Oyama等[9]证实TLR-4信号传导缺陷可降低小鼠缺血再灌注期间的心肌梗死面积，并可减轻MIR期间与心肌损伤加重相关的炎症反应，包括中性粒细胞的聚集、氧化应激及活化补体的沉积等。

这说明TLR信号传导途径在心肌缺血再灌注所诱导的小鼠炎症和损伤中具有重要的作用。

心肌缺血再灌注会导致强烈的炎症反应，包括活性氧的产生、补体的激活及多形核中性粒细（polymorphonuclearneutrophil，PMN）的浸润等[10]，而PMN的浸润是心肌缺血再灌注后的主要问题。

研究表明，TLR-4可能参与心肌缺血再灌注损伤中PMN的浸润以及活性氧的产生。

Oyama等[9]检测到在TLR-4缺陷型ScCr小鼠（C57/BL10）的心脏中PMN浸润显著降低，补体激活减少。

其具体机制可能是：

肌细胞的TLR-4缺陷可能使肌细胞对心肌缺血再灌注和LPS应答时所表达的嗜中性CXC型化学增活素减少，如LIX和KC，从而减少PMN的局部浸润；

还可通过使趋化性过敏毒素的产生减少（特别是C5a）而进一步减少PMN的局部浸润。

此外，TLR-4缺陷型小鼠的心脏脂质过氧化物比正常的小鼠心脏少，这提示TLR-4的激活可能可以通过上调诱导性一氧化氮合酶和环氧化酶的表达而增加活性氧的产生。

当然，脂质过氧化物的减少也可能是由于心肌缺血再灌注后活化的中性粒细胞数目减少，从而减少了活性氧的生成。

虽然在心肌缺血再灌注后中性粒细胞的聚集是原发性的还是心肌损伤后继发的还没有一致的看法，但至少说明TLR-4在心肌缺血再灌注损伤过程中PMN的聚集及活性氧的生成中起着重要作用。

另外也有实验研究表明，TLR-4缺陷可以显著降低小鼠缺血再灌注后的梗死面积。

Chong等[11]对一种TLR-4突变而无功能的C3H/HeJ系小鼠做了类似的缺血再灌注模型实验并证实：

与野生型小鼠（C3H/HeN，一种与缺陷型小鼠除TLR-4外的所有基因相同的小鼠）相比，在相似的危险区面积（即被结扎冠状动脉分布区域的面积）之下，C3H/HeJ小鼠梗死区域大小（危险区面积的百分比）下降了40%（P=0.001），以及C3H/HeJ小鼠心肌内c-JunN端激酶活性显著下降（P<

0.05），而c-JunN端激酶是TLR-4的JNK/SAPK信号转导通路中的关键蛋白；

此外，虽然在两个品系NF-κB和活化因子蛋白-1在心肌缺血再灌注损伤期间的心肌内均发生了核转位，但是通过密度测定分析，C3H/HeJ小鼠内的NF-κB和活化因子蛋白-1（的转位要比C3H/HeN小鼠显著降低；

而IL-1、巨噬细胞趋化因子1（（MCF-1）及IL-6在C3H/HeJ小鼠心肌组织内表达亦显著降低。

这些信号转导途径中分子活性变化的研究结果进一步提示，TLR-4可能介导了心肌缺血再灌注损伤的炎症反应，因此抑制TLR-4的活性可能为临床上减轻缺血再灌注损伤提供新的治疗线索。

三、TLR-4信号转导通路的阻断手段

3．1从预处理的角度去阻断

HMGBl是广泛存在于真核细胞的细胞核中最重要的非组蛋白之一，在细胞的核内，HMGBl主要参与细胞分化、稳定染色质结构、调节基因转录和翻译及类固醇激素调控等生命活动。

核内的HMGBl可通过炎性细胞的主动分泌和坏死细胞的被动释放转移至胞外，参与急、慢性炎症的发生、发展过程。

IR后HMGBl水平升高，其主要通过TLR-4依赖的信号途径介导炎症反应。

但Izuishi等[12]的研究显示，与TLR-4突变小鼠（C3H／HeJ）相比，野生型小鼠（C3H／HeOuj）在IR之前接受HMGBl预处理，肝脏IRI损伤程度明显降低，循环血中的炎性因子TNF-α和IL-6水平也同时下降。

证实HMGBl预处理是通过TLR-4依赖的信号途径来发挥对肝脏的保护作用的，其可能的机制是HMGBl预处理后，TLR-4信号转导通路中的负向调节因子IRAK-M升高，而促炎调节因子IRAK-1降低。

近来也有研究表明，利用磷酸葡聚糖（glueanphosphate，GP）预处理可抑制TLR-4的表达，从而发挥对心肌的保护作用。

Li等[13]用GP（40mg／kg，腹腔注射）预处理Sprague-Dawley大鼠，发现用GP预处理的大鼠在IR后心肌梗死的面积较小，这种心肌保护的机制可能是GP预处理后：

①使TLR-4与MyD88的亲和性降低，抑制了此信号转导通路中IRAK、IKK-8及NF-κB的活性；

②提高了TLR-4的磷酸酪氨酸化水平，导致P13K／Akt的活性升高从而使IR后心肌细胞的凋亡数目减少；

③可使TLR-4从主要的NF-κB途径转变为P13K／Akt信号，来发挥对心肌的保护作用。

Shimamoto等[14]利用C57BL／6型小鼠制作缺血30min、再灌注2h的IR损伤模型，于缺血前10min静脉给予TLR一4特异性的拮抗剂Eritoran（5mg／kg），对照组仅给予载体。

结果发现，与对照组相比，用Eritoran预处理的小鼠IR后心肌梗死面积明显缩小，JNK的活化明显降低，NF-κB的易位和炎细胞因子释放都明显减少。

3.2从MyD88的角度去阻断

MyD88是TLRs信号途径中起重要作用的关键分子，它的缺陷可导致TLRs信号转导中断。

RNA干扰可通过双链RNA（dsRNA）介导特异性地降解相应序列的mRNA，从而导致转录后的基因沉默。

用MyD88RNA干扰可抑制LPS刺激导致的树突状细胞（DC）的成熟，产生耐受性DC，同时抑制NF-κB核移位。

NF-κB是炎性反应基因重要的转录激活因子，NF-κB的激活可以上调许多炎性反应基因的表达，是炎症发生、发展的关键环节。

靶向NF-κB的抗炎治疗（包括基因治疗）成为国内外学者研究的热点。

目前正在探索多种抑制NF-κB活化的抗炎措施，如圈套寡核苷酸（ODNs）的导入，野生型或突变I-κBa的转染，I-κB／NF-κB抑制剂的使用等，在多种动物模型中已证实了这些治疗策略的有效性，并已进入临床研究阶段。

因此，从炎症信号的各个环节探讨调节和控制炎症的基因治疗手段，在医学实践上具有重要意义。

TLRs及MyD88处于NF-κB信号途径的上游，采用基因转染的方法阻断TLRs炎症信号，或者同时联合阻断NF-κB信号途径，可能成为有效的炎性反应治疗措施。

刘懿等[15]应用TLR-4的单克隆抗体特异性地阻断TLR-4，发现可以减轻溃疡性结肠炎小鼠的炎性反应，下调炎性细胞因子TNF-α、IL-1、INF-γmRNA水平。

在IRI中，应用TLR-4的单克隆抗体也不失为从源头阻断TLR一4防治再灌注损伤可行的方法。

Hua等[16]将腺病毒携带的无功能MyD88（Ad5-dnMyD88）在IR前3d转染到大白兔心肌组织中，以腺病毒携带的Ad5一GFP作为对照。

与对照组相比，转染了Ad5-dnMyD88组的心肌梗死面积减小，能够抑制NF-KB的转录活性，同时提高磷酸-Akt和抗凋亡因子BCL-2的水平，而转染Ad5-GFP对IR兔心肌损伤无保护作用。

证明了阻断MyD88下游信号通路能对IR心肌起保护作用。

综上所述，TLR-4信号传导通路在心肌缺血再灌注损伤中发挥着重要的作用，从某些角度适当的阻断其信号通路会有助于减轻心肌缺血再灌注损伤，其许多机制还有待于我们进一步地去研究。

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