蛋白酶的发酵及酶活力测定实验报告Word文档格式.docx
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有调查显示，酶制剂市场量最大的是洗涤剂用酶，第二位是淀粉加工用酶，以后依次为乳制品加工业、制酒工业、纺织工业和饮料加工业等用酶[2]。
与动、植物来源的蛋白酶相比，利用微生物产的蛋白酶有易于培养、生长快、产量高、易于提取，适于大规模工业化生产，培养基的本钱相对较低等优点，使微生物成为生产蛋白酶的重要来源和首选材料。
1.2国外研究概况
由于从植物和动物中生产蛋白酶具有的局限性,为了满足当今世界市场的需要,人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶上[3]。
当前工业用酶主要来源于微生物，微生物来源的蛋白酶按其作用的pH值的不同可分为三类，即碱性蛋白酶、中性蛋白酶与酸性蛋白酶，它们作用的最适pH值分别为碱性、中性与酸性。
蛋白酶在食品工业上的应用主要是用在制干酪，蛋白质水解调味液，烤焙食品，肉类嫩化，功能性低聚肽和阿斯巴甜的合成等。
食品加工使用的蛋白酶通常来自于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、米曲霉和黑曲霉等。
随着社会开展和生活水平不断提高，人们对肉类的需求量日益增长的同时，对肉的品质也提出了更高要求。
微生物蛋白酶肉类嫩化剂是一种专门用于嫩化肉类的生物制剂，在适当温度下，可以断裂蛋白质中的某些肽键，提高肉的嫩度，使肉变得多汁、柔软、易于咀嚼，提高了肉的成品率、保质期和经济效益，因此十分经济且便于生产，并能取得显著效果。
面包制作过程中，面粉中含有的不溶解性谷蛋白可以通过碱性蛋白酶限制性降解来修饰。
用米曲霉蛋白酶和肽酶对面筋蛋白作有限的水解，可改善面团操作性能和机械性能，以适应不同制品的需要。
酶处理后的面团其韧性和机械强度都有所增加。
过量使用蛋白酶能减少面团的混合时间和增加面包产量。
使用细菌蛋白酶可以增加面团的延展性[4]。
1.3本实验的研究容
通过研究产蛋白酶菌来了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线，了解蛋白酶的性质与蛋白酶的测定原理，掌握蛋白酶的发酵与酶活力测定方法和掌握一定的知识与技能。
第二章材料与设备
2.1菌种
产蛋白酶芽孢杆菌
2.2培养基
2.3主要试剂材料
福林试剂、0.4mol/L的碳酸钠溶液、0.4mol/L的三氯乙酸、0.5mol/LNaOH溶液、1mol/L和0.1mol/L盐酸溶液、硼酸缓冲液（pH=10.5）、10g酪素溶液、100ug/mLL--酪氨酸标准溶液
2.4主要仪器设备
UV1000分光光度计、恒温水浴锅、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、移液枪、吸管、离心管、枪头、摇床、培养基
第三章分析测定方法
3.1福林-酚试剂法
福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物复原呈蓝色（钼蓝和钨蓝混合物），由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），可使蛋白质与其水解产物呈上述反响。
因此可利用此原理测定蛋白酶活力。
通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反响，经一段时间后终止酶促反响，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再参加福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;
酪氨酸含量用分光光度计在680nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。
3.2蛋白酶活力测定方法
按中华人民国专业标准SB/T10317-1999：
蛋白酶活力测定法[5]测定。
管号
酪氨酸标准溶液的浓度ug/ml
取100ug/ml酪氨酸标准溶液的体积ml
取去离子水的体积ml
加0.4mol/L的碳酸钠溶液的体积ml
加福尔马林的体积ml
测定OD680值〔A〕
0.0
1.0
5.00
1.00
1
10
0.1
0.9
0.089
2
20
0.2
0.8
0.179
3
30
0.3
0.7
0.353
4
40
0.4
0.6
0.479
5
50
0.5
0.518
加完之后，置于40+0.2水浴中显色20min，取出，用分光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的对照管为空白，分别测定其吸光度值。
以吸光度值A为纵坐标，酪氨酸的浓度C为横坐标，绘制标准曲线，计算出OD680=1时的浓度，即为吸光常数K值。
计算出OD680=1时的浓度，即为吸光常数K值，K=88.28。
X=A×
K×
4/10×
n
式中：
X——样品的酶活力，U/mL；
A——样品平行试验的平均吸光度；
K——吸光常数；
4——反响试剂的总体积，mL；
10——反响时间10min，以1min计；
n——稀释倍数。
所得结果表示至整数。
第四章试验方法
4.1试验流程
培养基的配置→活化菌种→培养取样→标准曲线绘制、生长曲线绘制和酶活测定
4.2培养基的制备
配方：
牛肉膏0.3g、蛋白胨1.0g、NaCl0.5g、水1000ml、pH7.0~7.2、121℃灭菌20min。
牛肉膏3g/L或酵母浸粉5g/L酪素10g/LNaCl4-5g/LPH7.2—7.4先将酪素用少量2%氢氧化钠润湿，玻棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热搅拌至完全溶解〔10-15min〕，补足1000mL蒸馏水，参加其他成分，调PH分装灭菌。
4.3菌种活化
将筛选好的并保藏在冰箱里中的未知的产蛋白酶实验菌接种2环于150ml液体发酵培养基〔牛肉膏蛋白胨培养基〕的250ml三角瓶中，30-32℃摇瓶发酵，在摇床里30℃震荡培养16到18小时，目的在于活化菌种并得到对数期菌种。
在培养瓶中进展发酵。
4.4试剂的配制
准确称取无水碳酸钠42.4g，加去离于水溶解后，定容至1000mL。
称取磷酸氢二钠（Na,HP0,·
12H,0）6.02g和磷酸二氢钠（NaH,PO,·
μg/mL酪氨酸溶液：
准确称取0.100g酪氨酸，逐步参加lmol/L盐酸6ml溶解后，用0.1mol盐酸定容至100mL得1mg/ml酪氨酸溶液，取此溶液10ml，用0.1mol盐酸定容到100ml,放入4度冰箱中保存。
4.5产蛋白酶菌生长曲线的测定
℃冰箱种中保藏于。
并同时将A号发酵瓶放到摇床中，继续30℃震荡发酵。
在直到20:
00时将放在冰箱中保藏的菌种液〔活化的对数期菌种〕取出5ml接种到B号发酵瓶中。
并放在30℃的摇床中继续发酵。
将编号0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18的离心管从冰箱里取出，用离心机在设定的转速为3500rpm,离心10min,将要测酶活力的的编号的上清液倒入另一干净的试管中。
沉淀留下。
〔2〕离心管中参加蒸馏水5ml轻微震荡制成悬浮液。
〔3〕将悬浮液加到比色皿中，测其吸光度值。
测定的OD600值填入下表。
编号
对照
6
7
8
发酵时间（h）
12
14
16
光密度值OD600
0.182
0.347
0.452
0.678
0.906
0.913
0.965
1.319
1.546
9
11
13
15
17
18
22
24
26
28
32
34
36
1.585
1.726
1.742
1.825
1.919
1.976
1.981
1.970
2.041
2.151
4.6酶活力的测定
〔1〕待测液的制备：
选择培养时间为0、6、12、18、24、30、36h的离心管，离心之后的上清液，即为待测酶液。
〔2〕将酪素、三氯乙酸溶液放入40±
0.2°
C恒温水浴锅中，预热5min。
〔3〕按下表操作：
试管A〔空白〕
试管B〔酶试样，需作三测量平行〕
加酶液1.00mL
40±
C，2min
加三氯乙酸2.00mL〔摇匀〕
加酪素1.00ml〔摇匀〕
C，10min
取出静止10min，过滤
取1.00mL滤液
加碳酸钠溶液5.0mL
加福林酚试剂1.00mL
C显色20min
于680nm波长，用10mm比色皿
于680nm波长，用10mm比色皿
测其吸光度
将测定的OD680值填入下表
培养时间〔h〕
对照组调0
样品OD680值〔A〕
0.307
0.557
0.606
0.765
0.986
1.225
1.337
5.1酶活力的计算
根据酶活计算公式将数据填入下表
酶活力（U/ml）
21
27
35
43
47
第五章结果与讨论
通过酶活力的曲线可以看出在36h左右酶活力到达最大，此时发酵液中的产蛋白酶最多。
所以在选择发酵时间时，应选择36h为最大产酶时间点。
掌握了蛋白酶产生菌的生长曲线绘制方法，同时通过研究蛋白酶的性质与学习其测定方法，用微生物学方法测定蛋白酶的酶活力。
第六章参考文献
[l]MalaBRao,APamaM.talkasle,MohiniS.Ghatge,etaL.Molecularandiotechologlealaspectsofmicrobialprotease[M].MiaebiologyandMolecularBiologyeview,sept.1998：
597~635.
[2]罗贵民.酶工程[M].:
化学工业,2002.
[3]黄文涛,胡学智.译《酶应用手册》[M],科学,1989.
[4]夏凡,琚争艳.微生物碱蛋白酶在食品工业中的应用与其平安性研究进展[J].食品
发酵,2008,
（2）:
19-22.
[5]中华人民国专业标准:
蛋白酶活力测定法,SB/T:
10317-1999.
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