生化分离技术(主要内容)Word文档格式.doc
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选择性好；
适应性强；
实现自动化操作。
按膜断面的物理形态：
表面活性层（0.1~1μm，分离作用，其孔径和性质决定膜的分离特性，厚度决定传质速度）；
多孔支撑层（100~200μm，机械支撑作用，对分离特性和传质速度影响很小）
表征膜性能的参数：
孔的性质；
水通量；
耐压能力；
pH适用范围；
对热和溶剂的稳定性；
截留分子量分布
膜的劣化：
膜本身不可逆转的质量变化（化学性：
水解、氧化；
物理性：
固结、干燥；
生物性：
微生物代谢产物）。
污染膜是否清洗的判据：
进出口压力降；
透水量或透水质量；
定时清洗。
污染膜的常用清洗方法：
机械方法；
加起溶解作用的物质；
加起氧化作用的物质；
加起渗透作用的物质；
切断离子结合作用。
浓差极化：
指外源压力迫使分子量较小的溶质通过薄膜，而大分子被截留于膜表面，并逐渐形成浓度梯度的现象。
克服极化的主要措施：
震动、搅拌、错流、切流。
膜分离的原理：
利用溶液中溶质分子的大小、形状、性质的差别，对于各种薄膜表现出不同的可透性而达分离的目的。
分子透过膜可由简单的扩散作用引起或外加的流体静压差或电场作用所推动。
透析Dialysis（DS）：
除去或更换小分子物质；
脱盐；
改变溶剂成分
透析膜的特点：
亲水性，分子筛状多孔薄膜；
化学惰性；
一定机械强度和良好的再生性能。
提高透析效果的措施：
搅拌；
定期或连续更换新鲜溶剂。
反渗透RO原理（毛细孔流动模型）：
膜组成中含有亲水活性基团，膜表面能选择性吸附水分子而排斥溶质分子，靠近膜表面的浓度梯度急剧下降，从而在膜和溶液的界面形成一层被膜吸附的纯水层（厚度约2个水分子），在反渗透压力推动下，纯水层的水通过膜的毛细孔连续不断地渗出。
溶解－扩散模型：
把半透膜看成完全致密的中性界面，水和溶质通过膜分为两个阶段：
第一阶段：
水和溶质被吸附溶解到膜材质表面；
第二阶段：
水和溶质在膜中扩散传递而通过膜。
孔隙开闭学说：
膜里无固定连续孔道，所谓渗透性指因聚合物的链经常振动而在不同时间和空间内渗透的平均值而已。
氢键理论：
水分子进入醋酸纤维膜的非结晶部分后，因和羧基的氧形成氢键而构成结合水，结合水的结合强度取决于膜内的孔径，孔径越小结合越牢；
牢固的结合水把孔占满，不与醋酸纤维膜氢键结合的溶质就不能扩散透过，但能与膜氢键结合的离子和分子（水，酸）却能穿过结合水层而有序扩散通过膜。
临界孔径：
膜表面孔径为吸附水层厚度2倍时，能获最大分离效果和最高渗透通量。
超滤UltrafiltrationUF：
以超滤膜为分离介质，以膜两侧压力差为推动力，将不同分子量的物质进行选择性分离。
其用途：
大分子物质的脱盐和浓缩；
小分子物质的纯化；
大分子物质的分级分离；
生化制剂或其它制剂的去热原处理。
超滤膜的选择（主要考虑参数：
截留分子量、流动速率）。
截留分子量：
指截流率90%以上的最小被截留物质的分子量（以球形分子测定）
流动速率：
一定压力下每分钟通过单位面积膜的液体量（mL/cm2.min）
其它：
操作T、化学耐受性、膜吸附性、膜无菌处理
影响超滤流率的因素：
（1）溶质分子的性质；
（2）溶质浓度；
（3）压力；
（4）搅拌；
（5）温度；
（6）其它（溶液pH、离子强度及溶剂因素等）
超滤膜的截留机理：
筛分作用：
据分子大小、形态而分离。
超滤应用：
浓缩和脱盐；
分级分离与纯化；
超滤分离与酶反应器（或发酵罐）联用。
纳滤NanofiltrationNF：
介于超滤与反渗透之间的膜分离技术，其截留分子量在200～2000的范围内，孔径为几纳米。
能截留小分子有机物并同时透析出盐，集浓缩与透析为一体；
在保证一定膜通量的情况下，纳滤所需压力比反渗透低得多，可节约动力。
纳滤膜的分离机理：
筛分作用（位阻效应）；
离子与膜之间的静电作用。
纳滤膜对盐的截留率主要由阴离子的价态决定。
反渗透的应用：
海水和苦咸水的淡化；
饮料用水和纯水制备；
果蔬汁和乳制品的浓缩。
微孔膜过滤MicrofitrationMF：
以多孔细小薄膜为过滤介质，压力为推动力，使不溶物浓缩过滤的操作。
层析（色谱）：
利用各组分与固定相亲和力或相互作差别实现分离。
广义吸附（Sorption）：
有选择地将一种或多种溶质从流动相转移到固定相的过程，利用固定相和流动相间的相互作用将组分分离开来。
Gel的准备：
（1）凝胶溶涨；
（2）倾析；
（3）控制稠度；
（4）
脱气。
层析柱操作效果的影响因素：
所用层析介质；
洗脱剂的空柱流速；
柱孔隙率；
层析介质的可渗透性能；
组分在固定相和流动相中的分配系数；
处理量。
层析的两个基本问题：
区带分离和峰形变宽。
层析分离效果常用两个目标峰的分辨率（RS）描述（分辨率：
两个洗脱峰峰顶对映的洗脱体积之差比上两峰在基线上峰宽的和的平均值）。
分辨率取决于：
两组分的洗脱体积和峰宽；
决定洗脱体积和峰宽因素：
层析柱的选择性和柱效
层析分辨率取决于：
系统选择性α、柱效率N和容量因子k′。
k′的取值与溶质在固定相和流动相的分配性质、温度及固定相和流动相体积比有关，而与柱尺寸和流速无关。
欲提高RS达到满意分离效果，须满足的条件：
（1）相对保留值α＞1；
（2）理论塔板数N尽可能大；
（3）k′≠0。
对极性组分：
用极性较小溶剂溶解样品/上样/吸附；
用极性较大的溶剂作洗脱剂。
凝胶过滤层析原理：
利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，据被分离物分子大小不同进行分离.
凝胶过滤层析优点：
分离条件温和；
样品回收率高；
实验重复性高；
操作时间短，简便，经济。
凝胶参数：
排阻极限（用A类分子中最小分子量表示）；
工作（分级）范围（B类分子的分子量范围）。
溶质洗脱的异常：
⑴分配系数Kd<
0：
装柱不好，发生沟流（短路）；
⑵Kd>
1：
凝胶对溶质分子可能有吸附作用（疏水、亲和、静电作用）
Gel的定义：
含大量液体的具有三维网状开孔弹性结构的多聚体结构，一般制成球状颗粒。
Gel的要求：
⑴多孔、孔隙区大，内水体积Vi要大；
⑵亲水；
⑶惰性；
⑷稳定；
⑸色谱性能好。
交联葡聚糖（Sephadex）：
（一）结构
n骨架：
葡聚糖（dextran）
n主键：
α-1，6糖苷键（约95%）
n分支：
α-1，3糖苷键（约5%）
n交联剂：
环氧氯丙烷，以醚键交联
控制葡聚糖与交联剂比例可制造不同孔径凝胶
G-X可表示型号，X从10-200
其数字表示：
10g干胶的吸水量mL
（二）稳定性
1、化学性质：
较稳定
其稳定pH范围：
2～12
n强酸下，凝胶糖苷键易水解
n强碱下，羟基易氧化成酸
n一般稀碱下相对稳定，可用稀碱清洗
2、物理性质
n对热较稳定，可进行高温灭菌
n耐压性与凝胶型号有关
（三）色谱性能
1、总工作范围
分子量：
100Da～60万Da
2、吸附作用
n离子性
n芳香性（疏水）
聚丙烯酰胺（Bio-Gelp-x）
一）结构
n单体：
丙烯酰胺CH2=CH-CONH2
N,N′-甲叉双丙烯酰胺
CH2=CH-CONH-CH2-NHCO-CH=CH2
n型号Bio-Gelp-x中，x范围：
2～300
其中x=工作范围上限/1000
1、化性
稳定pH范围2～11
2、物性
同Sephadex
1、总工作范围：
100～40万
2、吸附：
离子I>
0.02mol/L
交联丙烯基葡聚糖（Sephacryl）
烯丙基右旋糖苷
n凝胶：
较硬，强度大
n型号：
SephacrylS-200，S-300，S-400，S-500，S-1000
型号愈高，孔径愈大，其分子量分离范围可查表
npH2～11
n较Sephadex抗压
n工作范围：
1000～7亿
n吸附性：
I>
0.05mol/L
琼脂糖凝胶（Sepharose）
nβ-D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合所形成的线性多聚糖
n糖浓度越大，网孔越小
Sepharose2B、4B、6B表示糖浓度2%…
Bio-GelA0.5～150M表示工作范围上限
稳定pH范围4.5～9.0
n抗热性：
较差，只能在0～45℃使用
n抗压性：
较好，与浓度有关
n总工作范围：
103～4×
107（4000万）
I＞0.02mol/L
交联琼脂糖（SepharoseCL-XB）
㈠结构
强碱条件下用2,3—二溴丙醇或环氧氯丙烷进行交联
㈡稳定性
n化性：
pH3～14
n物性：
抗热、抗压均提高
㈢色谱性能
同Sepharose
下降
凝胶过滤色谱应用：
㈠.分离
⒈组别分离：
A类与B类、B类与C类、A类与C类间
⒉分级分离：
B类分子间的分离
㈡.分子量测定：
需先作标准曲线，常用Ve—lgMw
凝胶过滤色谱实验设计要点：
⒈高分辨率；
⒉回收率高（减少峰宽，可提高回收率）；
⒊减少稀释；
⒋短时间。
凝胶过滤色谱应用举例：
缓冲液交换；
测定多聚物的分子量分布；
混合物的分级分离；
蛋白质的复性
离子交换层析IEC原理：
因溶质分子带不同性质电荷和不同电荷量，可在固定相和移动相之间发生可逆交换作用而使溶质移动速度变化，从而达到分离目的的技术。
离
子交换剂是离子交换技术的核心和基础：
n基质：
母体和骨架，水不溶性化合物
n功能基团：
共价结合在基质上
n反离子（平衡离子）：
与功能基团带相反电荷
功能基团决定了离子交换剂的基本性质：
1、功能基团的类型决定离子交换剂的类型
☆功能基团是酸性基团－阳离子交换剂
☆功能基团是碱性基团－阴离子交换剂
2、功能基团的解离性质决定离子交换剂强弱
☆强弱不是指可交换分子与交换剂结合的牢固程度
☆取决于带电功能基团的pKa（电离平衡常数）
强型及弱型离子交换剂共性：
n当层析pH远离pKa时，无论强型还是弱型离子交换剂都能牢固吸附可交换分子；
n阳离子交换剂应用时有pH下限，低于此pH功能基团开始失去负电荷，强酸型pH下限低于弱酸型；
n弱碱型交换剂应用时有pH上限，高于此pH功能基团开始失去正电荷，季铵基（任何pH都不会失去正电荷）型强碱性交换剂无pH上限。
交换容量：
指离子交换剂能结合溶液中可交换离子的能力，常分为总交换容量和有效交换容量。
1、总交换容量：
指单位质量或体积的离子交换剂中已解离或可能解离的功能基团的总量，其数值大小取决于离子交换剂的取代程度即电荷密度；
基础参数：
对某种特定交换剂，其数值恒定。
2、实际（有效）交换容量：
指每克干介质或每毫升湿胶在一定的实验条件下吸附某种分子的实际容量。
☆有效交换容量是变值，论及其数值时应同时给出
实验条件；
☆单位：
g溶质/gIE；
g溶质/mLIE
静态容量的测定：
试管小样法
n取若干支试管，分别加入相同体积的已用起始缓冲液平衡好的离子交换剂；
n分别加入一系列不同浓度的Pr溶液，混合振荡确保充分吸附；
n分析上清液中是否含Pr成分，据能使上清液中无Pr的最大Pr浓度可推算出每毫升离子交换剂能吸附的Pr的上限，此即为静态容量。
动态容量的测定（层析条件下）
n取一定体积离子交换剂装柱，用起始缓冲液平衡；
n特定流速下加样（样品浓度1～5mg/mL），不停加样至检测出有Pr流出，读数达到最大值一半停止加样（起始缓冲液和样品液的读数分别为0、100％）；
n停止加样，用起始缓冲液将不吸附的Pr洗出；
n改变缓冲液条件，使Pr从柱上解吸；
n收集洗脱液，测定出其总Pr，用此总Pr除以离子交换剂体积可算出该交换剂在此流速下动态容量。
离子交换层析的本质：
☆起始条件下溶液中离子强度较低，上样后，目的物与离子交换剂的结合能力更强，能取代离子而吸附到交换柱上；
☆洗脱时，提高溶液离子强度来增强离子的竞争性结合能力，使目的物从交换剂上解析。
溶质的电荷性质：
蛋白质在离子交换剂上发生吸附是因其表面带电荷
n蛋白质分子带电基团的来源：
特定的氨基酸或蛋白质修饰过程中引入；
n蛋白质分子所带电荷种类和数量并非常数，与溶液pH直接相关：
pH<
pI时，蛋白质带净的正电荷
pH>
pI时，蛋白质带净的负电荷
比较样品中目标蛋白和主要杂蛋白的滴定曲线，有助于离子交换层析起始条件选择。
n对基本信息不明的蛋白质，常先尝试在略偏碱性条件下采用阴离子交换剂进行层析分离；
nPr样品等电点信息对层析条件选择很有价值，要选择分辨率较高的层析条件，须获得各组分分子电荷随pH变化的情况（Pr滴定曲线）.
nPr等电点测定：
等电聚焦电泳法
nPr滴定曲线：
电泳法
蛋白质层析行为：
n不仅取决于所带电荷种类和数量
n还与蛋白质分子中电荷分布密切相关
处于蛋白质分子的内部电荷（它们可能形成盐键维持蛋白质的空间结构）对蛋白质层析行为并不产生影响，而取决于蛋白质的表面电荷。
层析相关区域：
蛋白质表面的电荷分布大多不均匀，某些表面区域内电荷可能较密集，此区域往往就是离子交换时与交换剂发生接触的区域，称为层析相关区域，此区域的电性质决定了蛋白质能与何种离子交换剂结合。
Z值是指蛋白质分子上与离子交换剂发生相互作用的带电位点的数目。
进行离子交换层析时：
nZ值越大，蛋白质与交换剂的结合越牢固
nZ值越小，蛋白质与交换剂的结合越松弛
Z值是多种因子综合作用的平均值：
nZ值与蛋白质净电荷间无直接关系，分子量大的蛋白质与离子交换剂间的接触位点未必多于分子量小的蛋白质；
n蛋白质的构象变化将造成电荷分布情况的改变而引起Z值变化；
n层析时加样量增加，Z值会下降。
影响目的物与离子交换剂结合的因素：
n溶液pH，它决定了目的物的带电状态
n蛋白质的层析相关区域，即电荷在蛋白质表面的分布情况
n溶液中离子的种类和离子强度
pH的影响：
n目的物的pH稳定范围：
超出此范围会造成目的物活性丧失、回收率下降
n唐南效应
离子交换剂表面pH与溶液pH不一致
☆阳离子交换剂表面pH比周围缓冲液低1个pH单位
☆阴离子交换剂表面pH比周围缓冲液高1个pH单位
离子种类的影响：
n不同离子从离子交换剂上将目的物置换下来的能力不同；
n离子类型还对分辨率和不同目的物的洗脱顺序产生影响．
离子强度的影响：
n低离子强度下，目的物通过荷电基团结合至离子交换剂上带相反电荷的功能基团上；
n竞争离子浓度即溶液离子强度逐渐升高时，目的物逐渐被置换下来，绝大多数目的物在1mol/L的盐浓度下能被洗脱。
离子交换动力学的五步骤：
（1）膜扩散：
蛋白质通过扩散穿过水膜到达凝胶表面的过程，其速度取决水膜两侧蛋白质的浓度差
（2）粒子扩散：
蛋白质分子进入凝胶颗粒网孔并到达发生交换的位置的过程
（3）蛋白质取代离子交换剂上的反离子而发生离子交换；
（4）被置换下来的反离子扩散到达凝胶颗粒表面，即粒子扩散，方向与步骤2相反；
（5）反离子通过扩散穿过水膜到达溶液中，也即膜扩散，方向与步骤1相反。
㈠
目的物的解离曲线
已知pI时，一般首先考虑蛋白质的带电情况：
对pI=5的酸性蛋白
nDEAE纤维素柱色谱，可选pH5.5～9.0
nCM纤维素柱色谱则限于3.5～4.5
对pI=8的碱性蛋白
nCM纤维素柱色谱，可选pH3.5～7.5
nDEAE纤维素柱色谱则限于8.5～9.5
具体还需考虑
（1）目的物的稳定性
（2）唐南效应（Donnan）
如阴IEpH表面＞pH溶液约1个pH单位
阳IEpH表面＜pH溶液约1个pH单位
㈡目的物分子大小
㈢其它考虑：
吸附选择、流速、经济性、文献
影响吸附平衡常数或分布系数α的因素：
npH影响电性与电量
nI上升，α下降，减弱吸附
n溶质的电荷分布、IE的电荷分布及位阻效应
n与溶质的浓度成反比
（2）梯度洗脱：
洗脱缓冲液的离子强度或pH连续变化，能获得较高的分辨率
n峰宽通常小于阶段洗脱
n拖尾现象明显改善或完全消除
n不会造成同一组分被分离称几个峰
C梯度洗脱的策略
a梯度形状的选择
n线性梯度：
目的物首次分离，NaCl0~0.5mol/L
n凸形梯度：
梯度末尾部分分辨率不好时使用
n凹形梯度：
梯度起始部分分辨率不好时使用
n混合梯度
☆组分吸附能力相近需改善分辨力的位点提供足够分辨率
☆分辨力不作要求的位点采用陡峭的梯度缩短时间
b梯度的高度和斜率
n较低斜率：
吸附能力相近组分间分辨率↑，峰宽加大，分离时间↑
n较大斜率：
快速分离，尖峰，不同组分的分离度差异减小
c流速：
适当降低流速可提高层析的分辨率
n分离低分子量物质分子：
扩散速度快，迅速平衡，流速仅受到介质机械强度、系统压力的限制
n分离生物大分子物质分子：
扩散速度慢，达到吸附和解吸平衡需一定时间，加样和洗脱过程中流速限制
d常用洗脱策略
n组分不多，相差较大，用阶段洗脱
n组分多，相差较大，用简单梯度洗脱
n组分复杂，线形洗脱→凸形/凹形洗脱
n初次分离，先连续梯度洗脱（确定样品特性和洗脱条件）→再阶段洗脱
色谱（层析）聚焦Chromatofocusing：
据生物分子pI的不同，在动相中动速不同进行分离（适于水溶性的两性分子）。
特点：
⑴.自动形成pH梯度，不需特殊实验装置；
⑵.蛋白质聚焦自身pI范围，有浓缩效应，峰宽达0.04-0.05pH单位，分辨率很高。
PB（polybuffer）-多组分缓冲液：
分子量不同的多羧基多氨基化合物（两性电解质性缓冲剂），特点：
⑴.I不高，但缓冲力强；
⑵.缓冲能力是均匀的。
PBE（polybufferexchange）—多缓冲交换剂：
以交联琼脂糖SepharoseCL-6B为基质，并在糖上通过醚键偶合上配基而成如低聚乙烯亚胺。
要求：
确保很宽的pH范围有均衡的缓冲容量。
色谱（层析）聚焦的应用：
蛋白质类（包括酶）的分离；
蛋白质类（包括酶）等电点测定。
亲和色谱（层析）AC：
利用生物分子和其配体之间的特异性生物亲和力可逆结合的特性而建立的色谱分离方法。
亲和层析的必要条件：
合适的配体（配基、ligand）；
合适的载体（Matrix）；
合适的吸附和洗脱条件
配体的选择：
1.
考虑亲和势（要求Kl在10-4～10-8mol/L之间）；
2.
与L的偶联不破坏L与S的结合；
3.
需了解L-S的作用机制
作为配体的条件：
亲和力大；
具有解离平衡；
与载体偶联不失活
亲和层析载体的条件：
1.亲水；
2.惰性；
3.具有活化基团；
4.大网孔；
5.机械性能好
连接臂（Spacerarm）：
在载体和配基间引入适当长度的“手臂”，减少载体的空间阻碍，增加配基的活动度。
非专一性洗脱：
改变缓冲液的离子强度；
改变缓冲液的pH值；
改变缓冲液的极性；
使用洗涤剂；
使用促溶盐（chaotropicsalt）；
使用蛋白质变性剂
专一洗脱（亲和洗脱）：
（1）使用配体；
（2）使用能与配体结合的分子；
（3）采用酶促反应的多元专一性洗脱
洗脱方式总结：
:
㈠.pH变化（破坏静电引力）；
㈡.I变化（减弱静电引力、范德华力）；
㈢.亲和洗脱；
㈣.表面活性剂（减少疏水作用、范德华力）;
㈤.解离试剂（主要破坏氢键，如尿素、盐酸胍等）;
㈥.
降低温度t（较高t吸附、较低t洗脱、减少疏水力）;
㈦.
电泳解吸（在柱两端连上电极进行电泳）。
共价色谱：
利用形成和破坏共价键能力的差异分离。
其共价键常为二硫键—S-S—，主要用于分离分子中含巯基的Pr、多肽。
疏水色谱：
将疏水的L连到Gel上。
作用力—蛋白质的疏水区与疏水性配基间形成疏水键。
可高盐上柱，低盐洗脱或高温上，低温洗。
金属螯合色谱：
HisCysTrp能与某些金属离子形成复合物，若将金属离子固定，可将含这些外露AA的Pr吸附。
蛋白质分子表面的组氨酸咪唑基、半胱氨酸巯基和色氨酸吲哚环能与铜、锌、镍离子间形成稳定的螯合物。
洗脱方式：
采用增加I或降低pH或加入EDTA。
有机染料亲和色谱：
有机染料如蒽酮化合物和偶氮化合物具类似于NAD+的结构。
一些需核苷酸类物质为辅酶的酶，对这些染料具一定亲和力。
亲和层析应用：
抗体和抗原的纯化；
酶的纯化；
糖蛋白和脂蛋白的纯化；
细胞的纯化
反相层析RPC：
基于溶质分子
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