新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测标准操作规程（复星）文档格式.doc

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3.1人员：

具有临床医学检验技术职称证、PCR上岗证、生物安全培训合格证，经新型冠状病毒相关生物安全、检测技术能力等培训，取得实验室主任授权。

3.2设备：

适用于Lepgen-96全自动PCR仪；

可调移液器（0.5-10μl、5-50μl、100-1000μl）及配套Tip枪头，生物安全柜（B2级）；

PCR反应板、台式离心机、台式震荡混合器等。

4试剂

4.1厂家：

上海复星长征医学科学有限公司。

4.2组分

4.2.1提取试剂组分：

裂解液、清洗液I、清洗液II、磁珠、洗脱液

4.2.2扩增试剂，包含以下组分：

组分名称

包装规格

每个反应中用量

组成成分

32人份/盒

48人份/盒

96人份/盒

2019-nCoV反应液

448μL

672μL

672μL*2

14μL

脱氧核糖核苷酸、氯化镁、2019-nCoVORF1ab、E、N基因引物、荧光探针

RT-PCR酶

192μL

288μL

288μL*2

6μL

TaqDNA聚合酶、逆转录酶、UNG酶

2019-nCoV阳性对照

200μL

200μL*2

-

假病毒

阴性对照

氯化钠

内参A

160μL

240μL

240μL*2

5μL

4.3不同批号、同批号不同批次试剂，要对试剂性能进行比对，填写《实验室间/实验室内部比对记录表》。

4.4使用和储存要求

4.4.1试剂使用要求：

不同批号产品的成分之间不可混用或互换。

4.4.2试剂应避光密闭保存，提取试剂盒常温保存12个月；

扩增试剂盒置于-20±

5℃保存，有效期6个月，具体生产日期、批号见外包装盒，扩增试剂盒反复冻融应≤3次。

5样本要求

5.1适用样本类型：

咽拭子、鼻拭子

5.2样本采集：

5.2.1咽拭子：

用无菌拭子适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，取出咽部分泌物，应避免触及舌部，迅速将拭子头浸入含1ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖，密封送检。

5.2.2鼻拭子：

用无菌拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出，迅速将拭子头浸入含1ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖，密封送检。

5.3样本保存和运送：

待测样本可在2℃～8℃放置24小时，长期保存应置于≤-20℃条件下，避免反复冻融。

样本运送采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。

5.4不合格样本处理：

5.4.1发现样本采集管管盖破损或未盖严导致样本泄漏，填写《不合格样本退单通知》。

5.4.2出现样本泄漏使用5500mg/L有效氯消毒液处理被污染区域与物品，并追溯配送和样本包装流程。

5.4.3退单后不合格样本、被污染的手套等直接高压灭菌处理。

6检测步骤

6.1试剂准备（试剂准备区）

6.1.1进入试剂准备区缓冲间，换上该区专用工作服、工作鞋、口罩、帽子、手套，做好温湿度等相关记录。

6.1.2进入试剂准备区，取出试剂盒，检查是否在有效期内，新开启试剂盒，在试剂盒上标注开启日期、开启人、开启有效期。

取出《新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）》中的各组分，如为新开启试剂盒，将试剂盒中阴阳性质控品通过传递窗传至样本制备区，放入放置质控品的冰箱内。

其余组分室温放置30分钟至平衡室温，混匀后待用。

6.1.3根据待扩增样本数n按比例配制反应试剂PCR-反应液，配制方法如下：

n=待测样本数+4（3管阴性质控+1管阳性质控）

组分

配制量（μl）

6

14

×

（n+1）

总体积

20

注：

一般整盒试剂一次性配制完毕。

充分混合均匀，瞬时离心后，通过传递窗，转移至样本制备区待用。

新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测试剂盒（荧光PCR法）其余组分及所需耗材，如PCR反应板、滤芯枪头等，通过传递窗传至样本制备区。

6.1.4在出试剂准备区前,处理生物垃圾，做好所有登记、清洁和消毒工作。

进入缓冲间，换下本区专用工作服，取下手套、口罩和帽子。

6.2样本处理（样本制备区）

6.2.1进入样本制备区缓冲间，操作人员按Ⅲ级防护要求穿戴连体防护服、靴套、N95口罩、护目镜、面罩、帽子及手套。

6.2.2将从试剂准备区传递的试剂，放入冷藏（2～8℃）冰箱待用，核酸提取试剂室温待用。

6.2.3核酸提取

1）将核酸提取仪电源开关打开，待机待用；

2）按照15μL/孔的用量，添加蛋白酶K至孔位1/7（裂解液中）,并在每个待提取样本孔位（含对照品）中加入5μL内参A；

3）生物安全柜内，在核酸提取预装板A1孔中加入1号样本400ul，B1孔中加入2号样本400ul。

按此顺序依次加入各孔。

3）完成加样后，盖好剩余样本溶液管盖并暂存于生物安全柜中。

4）将预装板放入仪器卡槽内固定，再将搅拌套插入仪器指定位置；

关闭仪器舱门，确认程序名称后，点击“运行”。

5）提取结束后，将使用过的搅拌套放入样本袋中，取出预装板。

6.3加样（样本制备区）

6.3.1取出PCR反应板，计算本批次所需孔位数量，即本批次拟检测样本数+4（3管阴性质控+1管阳性质控），按照《临床基因分析实验室检测流程表》做好标记。

6.3.2根据样本数量选择PCR反应板，按《临床基因分析实验室检测流程表》要求，在PCR反应板反应孔中加入PCR-反应液20μl/孔。

6.3.3依次在对应的孔位中，加入提取完毕的待检样本、阴阳质控品10μl。

6.3.4取出封板膜，左手捏住短边缘，右手将底层塑料薄膜撕掉备用，用双手拉平封板膜，对准PCR反应板，轻轻覆盖后，将撕掉的塑料薄膜放置在封板膜上方，用刮片板从中间向两边轻刮，使封板膜与PCR反应板紧密粘合（如图1，以96孔板为例）。

图1

6.3.5将封好膜的PCR反应板用75%酒精擦拭消毒后通过传递窗传递至扩增区。

6.3.6当日样本报告发布后,将样本和实验中的废弃物以及后续产生的医疗废弃物一起放入高压灭菌器。

6.3.7使用75%酒精消毒移液器、生物安全柜、喷洒外层防护服和外层手套，然后拉开防护服拉链、摘外层手套，再使用75%酒精消毒双手、摘护目镜/防护面罩、脱防护服、脱鞋套，将外层防护服、鞋套和外层手套放入高压灭菌器高压，实验室采用次氯酸喷洒灭菌，进入潜在污染区打开紫外灯灭菌，更换工作服后洗手。

6.4核酸扩增（扩增区）

6.4.1进入扩增区缓冲间,换上该区专用工作服和工作鞋、口罩、帽子、手套。

6.4.2打开微孔板离心机，将PCR反应板封板膜面向内，插入离心机转子卡位中，如一次离心一块PCR反应板，应将平衡板放置在对侧转子卡位中（图2-3）。

启动离心机，2000rpm离心30秒。

图2图3

6.4.3小心取出PCR反应板，避免震动及倾覆，水平放置在桌面上待用，开启扩增仪，放置PCR反应板。

6.4.4设置并保存反应程序，运行反应程序。

步骤1：

50℃反应15分钟，循环1次；

步骤2：

95℃保温3分钟，循环1次；

步骤3：

95℃5秒→60℃40秒，循环5次；

步骤4：

95℃5秒→60℃40秒，循环40次，于60℃采集FAM、JOE、ROX和CY5荧光通道的信号。

6.4.5样本设置：

在仪器软件的样本设置窗口内相应位置，录入样本编号、质控品类型。

6.4.6荧光通道设置：

1）选择FAM通道定性检测新型冠状病毒（2019-nCoV）ORF1ab基因；

2）选择JOE通道定性检测新型冠状病毒（2019-nCoV）N基因；

3）选择ROX通道定性检测新型冠状病毒（2019-nCoV）E基因；

4）选择CY5通道检测内参

6.4.7保存设置后的程序并启动运行。

6.5结果分析（扩增区）

6.5.1反应结束，检查PCR仪检测过程有无故障提示。

6.5.2反应结束后保存检测数据文件，并对FAM、JOE、ROX和CY5通道分别进行参数设置、结果分析。

6.5.2.1基线（Baseline）设置：

可自动设定基线（AutoBaseline），或根据扩增曲线形状自行调节基线。

6.5.2.2阈值（Threshold）设置：

应高于试剂盒正常阴性对照检测荧光值的最高点（可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线）。

6.5.3查看质控是否在控

1）以下要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，需重新进行。

质控品

质控要求

FAM通道

JOE通道

ROX通道

CY5通道

Ct≤32

Ct值不作要求

2019-nCoV阴性对照

Undet

2）将阴阳性质控结果录入质控表中，判断是否失控。

如有失控，参照《临床基因扩增实验室扩增区工作管理制度》室内质控管理规定处理。

6.6结果审核：

6.6.1结果判读

本试剂盒对新型冠状病毒（2019-nCoV）检测参考值为Ct值≤36。

每个通道的结果判断

FAM有扩增信号，Ct≤36，扩增曲线呈典型S形，则ORF1ab基因（+）；

否则为（-）

JOE有扩增信号，Ct≤36，扩增曲线呈典型S形，则N基因（+）；

ROX有扩增信号，Ct≤36，扩增曲线呈典型S形，则E基因（+）；

FAM、JOE和ROX的Ct均>

36，或无数值；

且CY5的Ct>

32，或无数值，则样本或操作存在问题，需复检

根据上述通道检测结果，判断结果如下：

试验结果

结果判断

ORF1ab基因、N基因和E基因有两个或两个以上（+）

2019-nCoV阳性

仅ORF1ab基因（+）

重复扩增仍为阳性，则2019-nCoV阳性

仅N基因或E基因（+）

2019-nCoV阴性

ORF1ab基因、N基因和E基因均为（-）

6.6.2临床疑似患者样本或检测结果阳性样本，用其他品牌试剂复测，结果一致发布报告；

结果不一致应外送疾控中心确认。

6.7结果报告

6.7.1阴性结果，发布报告。

6.7.2阳性结果，报告提交实验室负责人或其授权人审核后发布。

6.7.3实验室负责人或其授权人应在报告发布的同时：

1）上报医院生物安全委员会负责人；

2）通知送检疾控，并及时上报疾控中心。

6.7.4次日12：

00时前，将前一天的样本检测数量及阳性病例上报。

6.7.5患者信息保密要求：

除因疫情防控需要向卫生健康等部门提供信息外，任何人不得向其他机构、组织或个人泄露相关信息，不得擅自在互联网散播。

7参考值

阴性。

8超限结果处理程序

无。

9危急值及处理程序

10方法学性能

本试剂盒最低检测限为1000copies/mL。

11注意事项

11.1本品仅用于体外检测，使用前请仔细阅读本说明书。

11.2实验前请熟悉和掌握需使用的各种仪器的操作方法和注意事项，对每次实验进行质量控制。

11.3实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行，所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用。

11.4所有检测样本应视为具有传染性物质，实验过程中穿工作服，戴一次性手套并经常替换手套以避免样本间的交叉污染；

样本操作、废弃物处理均需符合相关法规要求：

卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。

11.5试剂盒采用泡沫箱加蓄冷剂的方式运输7天，温度不高于20℃不会影响产品效期。

12临床意义

冠状病毒属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，是一类具有囊膜，基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒，直径约80-120nm，目前只感染人、鼠、猪、猫、犬、禽类脊椎动物。

新型冠状病毒（2019-nCoV）经确认为新的变种，可引起病毒性肺炎、呼吸困难等症状，属于RNA病毒。

本试剂盒用于新型冠状病毒（2019-nCoV）的核酸检测，结果可用于新型冠状病毒感染患者或疑似新型冠状病毒感染患者的辅助诊断，为感染患者提供分子诊断依据。

检测结果仅供临床参考，不得作为临床诊断的唯一标准。

建议结合患者临床表现和其他实验室检测对病情进行综合分析。

13参考资料

13.1尚红，王毓三，申子瑜．全国临床检验操作规程[M].4版.北京：

人民卫生出版社，2014：

892-901．

13.2李金明.实时荧光PCR技术[M].2版.北京：

科学出版社，2016.9:

394-405.

13.3新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书

13.4新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南（第二版）国家卫健委办公厅

14相关文件

14.1《临床基因扩增实验室扩增区工作管理制度》

14.2《PCR室报告单结果审核管理制度》

15记录

15.1《实验室间/实验室内部比对记录表》

15.2《不合格样本退单通知》

15.3《临床基因分析实验室检测流程表》

15.4《新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测室内质控记录表》

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