细胞工程 动物组织和细胞培养Word格式文档下载.docx

细胞工程 动物组织和细胞培养Word格式文档下载.docx

《细胞工程 动物组织和细胞培养Word格式文档下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞工程 动物组织和细胞培养Word格式文档下载.docx（16页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

计数结果以每毫升细胞数表示。

细胞计数的

原理和方法与血细胞计数相同。

血细胞计数器：

手工计数细胞

（三）培养细胞活力测定

任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组

成，从形态上区别死、活细胞是困难的。

总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力.

1．台盼蓝法

方法：

1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中；

2、加入0.5ml0.4%台盼兰染液，染色2

一3分钟；

3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上

盖片；

4、镜下取几个任意视野分别计死细胞

和活细胞数，计细胞活力；

死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见

深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈

无色透明状。

2．四唑盐（MTT）比色法

四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝；

MTT比色法的原理：

活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝

紫色产物（formazan），并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。

二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深

浅与所含的formazan量成正比。

再用酶标仪测定OD值；

细胞活力检测

操作步骤：

（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；

103-104细胞/孔，每孔培

养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％

CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）；

（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；

继续培养3

小时；

（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔），

将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解；

（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。

（5）该法可以绘制细胞生长曲线。

培养板

微孔板扳荡器

酶标仪

（四）细胞冻存和复苏

细胞冷冻程序

简易程序：

将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以

线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟

温度下降1～2℃的速度，在40分钟内降至液氮表面温度，

停30分钟后，直接投人液氮中。

标准程序：

当温度在-25℃以上时，1～2℃/min

当温度达-25℃以下时，5～10℃/min

当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中

液氮罐

-196℃

低温保护剂的应用

在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存

效果。

常用的低温保护剂是二甲亚砜（DMSO），它是一种

渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水

的通透性，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，

在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶．

细胞冻存方法

1．预先配制冻存液：

含20%血清培养基，10%DMSO，

DMSO液用培养液配好．

2．取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,

用吸管吹打制成细胞悬液（1×

106～5×

106细胞/ml）；

3．加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和

冷冻日期。

４．于液氮中冷冻．

细胞复苏方法

（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水

浴中，使其融化（1分钟左右）；

（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上；

（3）低速离心10分钟；

（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。

（五）细胞培养的污染和检测

细胞污染的种类可分成：

细菌、酵母菌、霉

菌和病毒。

1.细菌和真菌的污染和检测

细菌

显微镜观察法

霉菌

2.支原体的污染和检测

造成支原体高污染率的原因：

1.支原体大小0.1－0.8um，无细胞壁，可透过一般过滤

膜（0.22-0.45um）；

2.支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可

观察到的特征变化

支原体之检测：

1）DNA荧光染色法

原理︰利用荧光染剂（bisbenzimide,Hoechst

33258）检测支原体污染。

此染剂会结合到DNA之

A-T区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数

（55～80%），所以可将其染色而检测。

被支原体

污染之细胞经染色后，在细胞核外可看到许多大小

均一之荧光小点，即为支原体之DNA，证明有支原

体之污染。

2）PCR方法检测

原理：

利用具特殊专一性之primers，经由PCR反应来

复制mycoplasmaDNA。

所用之primers来自

mycoplasma之conserved16S和23SrDNA序列，由

于此段序列依mycoplsma种类不同而不同，因此可

依所复制之DNA来作侦测与鉴定。

PCR方法

支原体菌株来源：

M.ArgininiATCC23838精氨酸支原体,

M.Fermentane

ATCC19989发酵支原体,

M.SalivariumATCC23064唾液支原体,M.Hominis

ATCC23114人型支原体,M.Orale

ATCC23714口腔支原体,M.Hyorhinis

ATCC29052猪鼻支原体。

其共同引物序列来自16s和23s保守区域：

外部引物为：

Ｆ15′-ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴ-3′，

Ｒ15′-ＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴ-3′；

3.病毒的污染和检测

电子显微镜观察;

免疫学检查;

PCR技术