细胞工程 动物组织和细胞培养Word格式文档下载.docx
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计数结果以每毫升细胞数表示。
细胞计数的
原理和方法与血细胞计数相同。
血细胞计数器:
手工计数细胞
(三)培养细胞活力测定
任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组
成,从形态上区别死、活细胞是困难的。
总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力.
1.台盼蓝法
方法:
1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中;
2、加入0.5ml0.4%台盼兰染液,染色2
一3分钟;
3、吸取少许悬液涂于载玻片上,加上
盖片;
4、镜下取几个任意视野分别计死细胞
和活细胞数,计细胞活力;
死细胞能被台盼兰染上色,镜下可见
深兰色的细胞,活细胞不被染色,镜下呈
无色透明状。
2.四唑盐(MTT)比色法
四唑盐(MTT)商品名为噻唑蓝;
MTT比色法的原理:
活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝
紫色产物(formazan),并沉淀在细胞中,而死细胞没有这种功能。
二甲亚砜(DMSO)能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物,溶液颜色深
浅与所含的formazan量成正比。
再用酶标仪测定OD值;
细胞活力检测
操作步骤:
(1)单细胞悬液接种于96孔培养板;
103-104细胞/孔,每孔培
养基总量200微升(96孔培养板每孔容积370微升),37℃、5%
CO2培养箱中培养一段时间(根据实验目的决定培养时间);
(2)加入2毫克/毫升的MTT液(50微升/孔);
继续培养3
小时;
(3)吸出孔内培养液后,加入DMSO液(150微升/孔),
将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟,使结晶物溶解;
(4)酶标仪检测各孔OD值(检测波长570纳米)。
(5)该法可以绘制细胞生长曲线。
培养板
微孔板扳荡器
酶标仪
(四)细胞冻存和复苏
细胞冷冻程序
简易程序:
将冷冻管(管口要朝上)放入纱布袋内,纱布袋系以
线绳,通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口,按每分钟
温度下降1~2℃的速度,在40分钟内降至液氮表面温度,
停30分钟后,直接投人液氮中。
标准程序:
当温度在-25℃以上时,1~2℃/min
当温度达-25℃以下时,5~10℃/min
当温度达-100℃时,可迅速放入液氮中
液氮罐
-196℃
低温保护剂的应用
在细胞冻存时加入低温保护剂,能大大提高冻存
效果。
常用的低温保护剂是二甲亚砜(DMSO),它是一种
渗透性保护剂,可迅速透入细胞,提高胞膜对水
的通透性,能使细胞内水分在冻结前透出细胞外,
在胞外形成冰晶,减少胞内冰晶.
细胞冻存方法
1.预先配制冻存液:
含20%血清培养基,10%DMSO,
DMSO液用培养液配好.
2.取对数生长期细胞,经胰酶消化后,加入适量冻存液,
用吸管吹打制成细胞悬液(1×
106~5×
106细胞/ml);
3.加入1ml细胞于冻存管中,密封后标记冷冻细胞名称和
冷冻日期。
4.于液氮中冷冻.
细胞复苏方法
(1)从液氮中取出冷冻管,迅速投入37~38℃水
浴中,使其融化(1分钟左右);
(2)5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上;
(3)低速离心10分钟;
(4)去上清,加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。
(五)细胞培养的污染和检测
细胞污染的种类可分成:
细菌、酵母菌、霉
菌和病毒。
1.细菌和真菌的污染和检测
细菌
显微镜观察法
霉菌
2.支原体的污染和检测
造成支原体高污染率的原因:
1.支原体大小0.1-0.8um,无细胞壁,可透过一般过滤
膜(0.22-0.45um);
2.支原体污染时,没有明显的肉眼或一般光学显微镜可
观察到的特征变化
支原体之检测:
1)DNA荧光染色法
原理︰利用荧光染剂(bisbenzimide,Hoechst
33258)检测支原体污染。
此染剂会结合到DNA之
A-T区域,因为支原体之DNA中A-T含量占多数
(55~80%),所以可将其染色而检测。
被支原体
污染之细胞经染色后,在细胞核外可看到许多大小
均一之荧光小点,即为支原体之DNA,证明有支原
体之污染。
2)PCR方法检测
原理:
利用具特殊专一性之primers,经由PCR反应来
复制mycoplasmaDNA。
所用之primers来自
mycoplasma之conserved16S和23SrDNA序列,由
于此段序列依mycoplsma种类不同而不同,因此可
依所复制之DNA来作侦测与鉴定。
PCR方法
支原体菌株来源:
M.ArgininiATCC23838精氨酸支原体,
M.Fermentane
ATCC19989发酵支原体,
M.SalivariumATCC23064唾液支原体,M.Hominis
ATCC23114人型支原体,M.Orale
ATCC23714口腔支原体,M.Hyorhinis
ATCC29052猪鼻支原体。
其共同引物序列来自16s和23s保守区域:
外部引物为:
F15′-ACACCATGGGAGCTGGTAAT-3′,
R15′-GTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT-3′;
3.病毒的污染和检测
电子显微镜观察;
免疫学检查;
PCR技术