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金属硫蛋白的研究进展

蔡震峰任凤莲

              （中南大学化学化工学院,湖南长沙　410083）

摘　要:

金属硫蛋白（MT）是一类低分子量、高巯基含量,能大量结合重金属离子的蛋白质,因其功能独特,近年来对

MT各方面的研究日益受到重视。

本文对MT的性质、分类、常用提取方法、分离纯化方法、检测方法以及功能作了逐一综述。

重点阐述了MT的检测方法,提出了有待研究解决的问题,展望了其应用前景。

关键词:

金属硫蛋白;提取;分离纯化;检测

中图分类号:

Q51　　　文献标识码:

A　　　文章编号:

1671-3206（2007）02-0187-04 

1957年，美国科学家Margoshoes和Vallee[1]在研究金属生物学作用时，从动物器官中分离出一种新的蛋白质。

由于它是一种低分子量、高巯基含量，能大量结合重金属离子，因此将该物质称为金属硫蛋白（metallothionein，简称MT）。

根据现有研究，MT主要分为MT-Ⅰ、MT-Ⅱ、MT-Ⅲ和MT-Ⅳ。

MT分子呈椭圆形，分两个结构域，分子量为6000～7000道尔顿，直径30～50A，含有61个氨基酸，其中21个氨基酸为半胱氨酸，这样每一个MT分子就可以结合7～12个金属离子。

人体、动物、植物以及微生物体内均含有MT，而且其理化特性基本一致，具有特殊的光吸收。

MT构象较坚固，具有较强的耐热性。

对于金属硫蛋白的研究，国内外主要集中在提取、检测以及应用上。

由于在实际生产中，主要采用层析法，分离纯化后的金属硫蛋白中还含有其它的杂蛋白，因此本文作者正在进行金属硫蛋白的分子印迹聚合物的研究，使其更好地应用于金属硫蛋白的纯化。

1金属硫蛋白的理化性质

一般来说，哺乳动物的MT分子量为6000～7000道尔顿，但去金属后即硫蛋白分子量为6000道尔顿左右，而真核微生物的MT分子量范围较大，为2000～10000道尔顿，如从粗糙脉孢菌中分离出来的MT分子量为2500道尔顿左右，酵母菌中分离得到的MT分子量为8000～10000道尔顿。

高等植物的MT的分子量为10000～13800道尔顿。

MT的等电点pI一般在4左右，如哺乳动物MT的等电点在3.9～4.6之间，已发现的水生生物MT的等电点在3.5～6.0之间。

使各种金属硫蛋白中50%的金属离子发生解离的pH分别为Zn-MT3.5～4.5,Cd-MT2.5～3.5,Cu-MTpH﹤1.0，但对植物中的MT来说，相应的pH要偏高些。

MT的存在形式及稳定性与它所结合金属的种类，是否结合了金属及环境的pH密切相关。

同样，MT的光吸收特征除了与它的氨基酸组成有关外，也与它所结合的金属种类密切相关[2]。

2金属硫蛋白的分类及分布

MT的结构在生物进化中高度保守，有四种异构体，MT-Ⅰ和MT-Ⅱ在大多数哺乳动物的内脏器官中广泛存在，尤以肝、肾细胞为主，而且参加其功能调节。

MT-Ⅲ分布主要限于中枢神经系统，主要分布于星性胶质细胞（集中于细胞体和突起中），其次为神经元细胞，也有报道称少量分布于生殖细胞、小肠、胃、肾和嗅觉皮质细胞中。

MT-Ⅳ主要分布于皮肤、舌、消化道等器官的角质细胞和复层鳞状上皮细胞中。

3金属硫蛋白的提取方法

3.1主要试剂

三羟甲基氨基甲烷（简称Tris）；5，5-二硫二（2-硝基苯甲酸）（简称DTNB）；PBS缓冲溶液。

3.2动物的处理

参考Onsaka等的方法[3]，给家兔皮下注射ZnSO44次，第1天注射60mg/只（约15mgZn/kg），第2、4天注射90mg/只，第7天注射120mg/只，第8天处死动物取其内脏。

3.3MT粗制品的制备

1）称重：

将前一夜放-4℃冰箱中解冻的试样拿出来用托盘天平称重，试样重量M，精确到0.1g；

2）搅碎：

将试样用剪刀剪成碎片后，用捣碎机捣约30～50s，捣成匀浆；

3）提取：

加入相当于试样重量两倍体积的0.02MTris-HCl，用磁力搅拌器搅约半分钟；

4）变性：

加入等体积氯仿：

乙醇（0.08：

1）变性除杂蛋白，搅拌约5分钟；

5）离心：

5000rmp、4℃离心25min，弃沉淀，取上清；

6）热变性：

75℃热变性3～5min除杂蛋白；

7）过滤：

用冰块速冷后用8层纱布过滤，取清液，静置约2h；

8）离心：

8000rmp、4℃离心25min，弃沉淀，取上清，得到匀浆液。

9）层析、冻干：

对匀浆液进行层析，然后收集富含MT的层析液进行冻干即得MT粗品。

4金属硫蛋白的纯化方法

所谓纯化，也就是MT粗品（60%～90%）、MT精品（≥90%）以及纯品（≥95%）的形成过程。

由报道的资料看，纯化方法大概是一致的，首先是根据MT-1和MT-2所带电荷不同的性质[4]，进行离子交换将MT-1和MT-2分开，然后将收集MT-1和MT-2的层析液分别进行脱盐，最后收集冻干、保存。

取匀浆液直接上SephadexG-50柱（4.5×100cm）进行分离，以0.01mol/LTris-HCl，pH8.6缓冲液洗脱。

收集含MT组分层析液，再上预先用0.01mol/LTris-HCl，pH8.6缓冲液平衡好的DEAE-SepharoseFastFlow（3×70cm）柱进行离子交换层析，以Tris缓冲液进行直线梯度洗脱（A液：

0.01mol/LTris-HCl，pH8.6；B液：

0.25mol/LTris-HCl，pH8.6）。

分别收集含MT-1和MT-2组分，冷冻干燥浓缩成体积15～20mL，再分别上预先用0.01mol/L碳酸铵平衡好的SephadexG-25柱（1.6×120cm）进行脱盐。

所得MT-1和MT-2冷冻干燥后保存于-20℃冰箱中[5]。

虽然文献中讲到许多分离纯化方法，但是多为实验室研究，真正运用到实际生产的并不多，这主要与实际生产中的各种环境因素的影响有关。

在实验中发现，诱导后家兔肝脏中MT的含量愈高，实际生产中MT的提取率就愈大，相反，MT的提取率就愈低。

5金属硫蛋白的检测方法

随着对MT研究的进一步深入，建立的MT检测方法较多，但所有这些方法都是建立在MT的理化特性和生物特性以及免疫学特性基础上，主要分以下几大类。

5.1金属亲和分析法

这类方法主要是基于MT对金属的高亲合力且不同金属的亲和力具有差异性及其热稳定性而建立的。

主要通过测定MT结合金属—竞争性替换金属含量来检测MT中金属含量的增高，从而计算出MT的含量。

张保林等[6]运用银饱和分析法结合原子吸收光谱（AAS）检测了兔肝Zn-MT，具体方法为：

向含MT的溶液中加入过量的Ag+，待反应完全后，再逐次加入血红蛋白，以结合剩余的Ag+，加热使血红蛋白沉淀，与MT结合的Ag+则完全存在于上清液中，通过AAS测定其中Ag+含量，便可计算出MT的浓度，该方法与其它方法比较，不需要去除样品中共存的其它蛋白质和含-SH基剂，可直接计算出MT含量，且不需要特殊的仪器设备，操作简便，具有很高的重复性和准确性。

金属亲合分析的缺陷在于，采用的金属除与MT结合外，还与其它一些小分子量化合物结合，由于利用金属含量间接推算MT含量，因此特异性较差[7]。

5.2电化学法

此方法主要是利用巯基（-SH）在汞滴表面产生氧化还原出现的电位变化建立的，以测定巯基来计算MT的含量，是一种可以直接用于测定MT总量的方法，具有一定的特异性。

其检测限可达ng/ml水平。

运用检测MT的电化学方法有：

示差脉冲极谱法（DPP）[8]、微分脉冲极谱法[9]、示差脉冲阳极溶出伏安法（DPASV）和循环伏安法（CV）等。

Bordin等通过改变检测体系的pH值，利用DPP可以很方便地检测出样品中多种形式的MT，同时能快捷地分析出还原型的MT。

5.3色谱分析法

对MT中不同亚型的检测，色谱分析法较为适合，应用的色谱分析法主要有HPLC、RP-HPLC、HPLC-ICP-MS、HPLC-AAS等，利用这类分析方法可以对Zn-MT的性质进行检测分析[10]，但此类方法需要有标准的MT样品进行对照。

Hunziker等[11]使用RP-HPLC从兔组织样品中可以分离出7种亚型，通过AAS来检测样品中的金属含量，可以对MT进行定量测定。

Jin等[12]利用HPLC分离MT，然后根据样品对250nm紫外吸收特征来直接对MT定量，该方法的灵敏度小于1μg/mL。

由于常见的两种MT所带的电荷不同,与其它方法相比，利用毛细管电泳法可以更好地分离纯化MT-Ⅰ和MT-Ⅱ[13]。

5.4蛋白质分析法/免疫法

此类方法主要是通过蛋白质含量测定来计算MT浓度，免疫法是最主要的方法。

它尤其适合于微量检测，具有灵敏、特异的特点，灵敏度在pg/ml级，对存在体液中含量甚微的MT具有较好的检测效果。

在近些年，先后建立了WesternBlotting法、放射性免疫检测法（RIA）和酶联免疫吸附法（ELISA）。

RIA法首先由Mallie等在1979年检测大鼠血清中MT的含量时建立的，随后Mulder等建立了测定人体液中MT含量的RIA，ZahirShaidhA等报道了用RIA检测镉污染地区人群的尿液MT含量[14]。

此方法的检测范围在0.1～100ng/ml之间，但是此方法要用放射性同位素，需要3天左右的时间，给检测带来不便。

1986年Thomas等建立了ELISA法，与RIA法无显著差异，灵敏度可达100pg/ml，与RIA相比具有测定相对迅速，且不需昂贵的仪器设备和接触放射性同位素。

Akintola等在1995年利用MT-1制备抗体建立了ELISA测定人血浆和尿液中的MT含量，检测限可达5ng/ml。

郑军恒等[15]在检测人血液中的MT过程中建立了2种ELISA方法，直接型ELISA的检测范围为1～10ng，可用于检测较纯样品，竞争性ELISA较好的检测范围是50～500ng，用于检测较粗的样品中MT的含量。

5.5光谱法

采用液相色谱（LC）和紫外（UV）相结合检测确定家兔肝脏中分离脱金属硫蛋白的最佳条件，同时，利用LC-ES-MS可以确定家兔肝脏中不同结构的脱金属硫蛋白，主要对MT-Ⅰ和MT-Ⅱ的结构及其同分异构体进行了研究[16]。

由于目前金属硫蛋白的测定主要采用紫外-可见分光光度法以及原子吸收光谱法测定其中的金属离子。

前一种方法灵敏度较低，由于检测取样少，检测过程中造成的误差较大，后一种方法却因为分离纯化过程中可能有部分金属脱离蛋白造成损失引起误差，且测定费用昂贵[17]。

针对这种情况，建立了镉金属硫蛋白的非原子化测定方法，检出限与石墨炉法（GFAAS）相近[18]。

5.6MT克隆及MT-mRNA检测

随着分子生物学技术的快速发展，使MT克隆技术、RNA印迹技术和PCR技术应用于MT的定量检测成为现实。

MT克隆检测是通过MT多克隆和单克隆抗体，运用免疫扩散、免疫电泳等方法来检测组织中的MT-mRNA含量进行定量分析，这在MT分子的生物学研究中有很重要的意义。

MT多采用联机检测，虽然以免疫法最为可靠，但是检测过程复杂，时间消耗大，联机检测大大节省了时间，同时可以减少检测过程中产生的误差。

MT在逐步产业化，然而目前还缺乏一种简便、灵敏、快捷适宜产业化的分离纯化和检测技术，这也成为MT研究的热点。

6MT的功能

对于MT的功能，Vallee[19]从基因调节、大脑的神经元生长抑制以及与谷胱甘肽的相互作用三方面做了详细介绍。

随着对MT的不断深入研究，报道出的功能也开始多面化，国内关于MT功能方面的综述报道很多[2，20]，其主要作用有：

清除体内自由基、防止机体衰老；解除重金属的毒性；参与体内微量元素的代谢；增强机体对各种不良状态的适应能力；锌元素的贮存库；防止细胞癌变等。

7结语

金属硫蛋白的研究已经近半个世纪，对MT的结构和生理学功能研究取得了许多成就，而且对于MT与一些疾病的关系研究也取得了许多重要成果。

但是仍有一些问题需要进一步的探讨和研究。

譬如MT在分离纯化时，需要进一步改进工艺，提高提取率，更适合工业化生产；尚没有一个MT的标准检测方法；MT在体内的代谢途径仍未探明;MT在体内浓度的影响因素以及在疾病方面发生的机理还需要进一步研究；MT的基因结构及调控还有待深入研究。

总之，MT具有很大的开发潜力和无法估量的应用价值，随着人们对MT研究的不断深入，对MT作用机理的不断探明，MT的应用也将越来越广泛。

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