实验动物标书大鼠铅中毒docxWord格式.docx
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其中对脑的影响最为严重，由于脑是铅最敏感的器官，微量铅即可引起神经系统的功能障碍,严重中毒可引起中枢神经细胞退行性改变，导致脑病，儿童可导致智力低下，认知缺陷[5]，因此，铅中毒的很多深入研究是关于脑部的毒性损害。
铅对脑的损害集中在一些特殊的区城。
最首要的部位包括大脑皮质的额前区，海马回和小脑。
这些区域的神经元如颗粒细胞和小球周细胞等主要参与学习记忆，而在这些区域的胆碱能系统中重要的神经环路，如隔-海马、斜角带-嗅球、
Meynert基底核（NBM-新皮层等具有维持正常的学习记忆功能“。
星状胶质细胞参与维持正常的学习记忆功能[9]。
铅中毒的一些特征性的临床表现有可能正是与这种特殊的解剖部位的特点密切相关。
如大脑皮质额前区的损伤可以引起认知功能的损害，并可引起进行性的注意力分散[10]。
大量研究显示[11]，铅引起氧化应急损伤，一方面铅作为氧自由基的启动剂而诱发氧自由基的产生，铅通过线粒体产生活性氧,同时还可抑制氧自由基的清除酶（SODCAT）舌力，使血，肝和脑中MDA含量增高。
另一方面铅作为琉基的亲合物质易于与含疏基的酶（GSHPxG6PDGR或物质（GSH结合而使相应酶活力下降和琉基耗竭，因此使机体的抗氧化能力下降，进一步增强脂质过氧化的毒理效应。
Yiin和Lin等人的研究证明[12]，铅能显著增加油酸，亚油酸和花生四烯酸中MDA的含量，且脂肪酸中双键数目越高，其相应体系中MDA含量也越高。
铅能诱导花生四烯酸的聚集，从而增加细胞膜脂质过氧化的敏感性[13]。
铅在体外能与磷脂双分子膜紧密结合[14]。
体内实验也证明[15]，脂质过氧化水平的增加和磷脂水平的下降与脑区的铅浓度显著相关。
因此，转变的膜脂质成分可导致细胞膜完整性，渗透能力的变化,使细胞质膜结构受损，细胞内的线粒体和内质网释放凋亡相关物质，促进细胞凋亡。
铅可取代钙的作用，影响细胞内多种激酶的活性等多个环节，铅可以通过与钙离子竞争进入细胞内，干预突触前终端钙离子而对LTP起作用[16]。
还可作用于突触后膜上电压依赖性的钙离子通道，阻断钙离子电流[6],铅可以激活蛋白激酶C（PKC）系统，引起细胞内游离钙浓度的升高，而胞内钙离子超载是神经细胞损伤死亡的重要原因。
铅还作用于钙调素-蛋白激酶和CAMP蛋白激酶等使钙调蛋白依赖性蛋白激酶U（CaMK!
）失活[5,17]，减少ERK2活性维持时间，降低ERK2!
过调节细胞骨架蛋白、核蛋白和信号蛋白等发挥其对突触可塑性的调节和学习记忆的形成。
铅还可以通过抑制腺苷酸环化酶间接抑制蛋白酶磷酸化过程，从而影响学习记忆过程[18]。
铅可以破坏星形胶质细跑[19]。
另外的几项研究表明[20,21],铅模拟钙样作用，激活NMDA5体复合物、活化NOS引发自由基气体分子（NO合成增加及自由基连锁反应，导致组织细胞的变性与坏死；
同时，NMD受体复合物的激活与NO对sGC的活化引起胞内CAMP水平升高，进而刺激突触前膜兴奋性氨基酸释放异常，导致神经兴奋与传导异常，表现出神经行为异常。
总之，有关铅对脑损伤机制方面，国内外学者目前已经达成广泛的共识[5-6]：
铅通过诱发细胞内过氧化物含量升高，破坏细胞的结构；
通过影响钙离子代谢、细胞内多种激酶的活性等多个环节，影响脑内少突胶质细胞和星状细胞的正常功能，并诱导神经元凋亡的过度表达。
这个机制解释了许多铅致脑损伤的毒理原理，但仍有一些机理任未明确，如神经环路受损便出现严重的学习记忆障碍的问题，虽然国内外学者普遍认为铅中毒可引起严重的认知障碍，但这种神经行为障碍是否与基底前脑胆碱能系统异常有关仍未明确。
针对目前很多铅中毒研究主要集中在发育脑，对成熟脑研究比较少，且一些铅中毒的作用机制不明的情况下，本研究采用系统研究法：
通过选用幼年和成年大鼠分别建立急性和慢性铅中毒模型[22]，测定铅中毒大鼠学习记忆能力，同时观察铅对大鼠脑神经发生、基底前脑成熟胆碱能神经元及星形胶质细胞的毒性效应，另外分析引起铅中毒的主要机制涉及的指标在不同模型动物的表现，发现铅对不同生长时期的脑损伤差异，寻找差异产生的可能原因，进行有关指标的进一步研究，寻找可能的新机制，为铅神经毒性机制的进一步研究积累实验基础。
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（2）国内外研究现状和发展趋势
铅对环境的污染日益加剧，铅中毒已经是比较严重的社会问题，探索铅中毒的毒性机理，对研究防治措施和筛选相关药物有非常重要的现实意义。
虽然国内外学者普遍认为铅中毒可引起严重的认知障碍，但这种神经行为障碍是否与基底前脑胆碱能系统异常有关仍未明确。
针对目前很多铅中毒研究主要集中在发育脑，对成熟脑研究比较少，且一些铅中毒的作用机制不明的情况下，本研究采用系统研究法：
通过选用幼年和成年大鼠分别建立急性和慢性铅中毒模型[22]，测定铅中毒大鼠学习记忆能力，同时观察铅对大鼠脑神经发生、基底前脑成熟胆碱能神经元及星形胶质细胞的毒性效应，另外分析引起铅中毒的主要机制涉及的指标在不同模型动物的表现，发现铅对不同生长时期的脑损伤差异，寻找差异产生的可能原因，进行有关指标的进一步研究，寻找可能的新机制，为铅神经毒性机制的进一步研究积累实验基础。
（3）项目主要研究开发内容、技术关键及主要创新点
研究内容
1不同类型铅中毒大鼠模型建立
（1）急性铅中毒模型。
A幼年急性铅中毒大鼠模型建立。
幼年铅中毒大鼠模型选用新生大鼠出生当天采用腹腔注射醋酸铅溶液，根据血铅浓度变化，确定急性铅损伤动物模型建立，B成年急性铅中毒大鼠模型建立。
选用成年大鼠,采用腹腔注射醋酸铅溶液，根据血铅浓度变化，确定急性铅损伤动物模型建立，
（2）慢性铅中毒模型。
幼年铅中毒大鼠模型选用新生大鼠出生当天采用自由饮用醋酸铅水溶液，根据血铅浓度，确定慢性铅损伤动物模型建立，B成年急性铅中毒大鼠模型建立。
选用成年大鼠,采用自由饮用醋酸铅水溶液，根据血铅浓度，确定慢性铅损伤动物模型建立
2行为学实验（Morris水迷宫实验）
（1）采用定位航行实验，测定大鼠对水迷宫学习和记忆的能力。
（2）空间收索实验，测定大鼠学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的能力。
3组织学实验组织病理实验。
取材大脑皮质的额前区，海马回和小脑，进行肉眼形态观察和病理切片观察，同时进行免疫组织化学分析，了解神经干细组织病理实验胞分化为星形胶质细胞或神经元的趋势和状态和新增殖细胞和胆碱能神经元的趋势和状态。
4生化、酶联免疫法和分子生物学实验
米用试剂盒、原子吸收仪和PCR仪测定各组大鼠脑匀浆中相关离子，神经递质，信号分子以及相关酶的含量和活力，了解氧化应激损伤机制，钙离子代谢机制，主要激酶代谢变化情况。
通过对以上实验结果的数据分析，寻找发育大脑与成熟大脑在铅中毒中的差异性，急性和慢性铅中毒的差异性，为铅对中枢神经系统的毒性机制进一步研究积累基础数据为提供理论支持，同时为排铅药物筛选研究提供实验基础。
拟解决的问题
1.幼年大鼠和成年大鼠的给药剂量选择，急性铅中毒和慢性铅中毒的时程选择。
找出最佳建模方式。
2.了解与学习记忆相关的大脑皮质的额前区，海马回和小脑等组织在铅中
毒后的变化情况，从形态、组织病理到免疫组化，为铅中毒的后期机制变化寻找物质基础。
3.比较中枢神经系统铅中毒机制中主要相关代谢和信号通路的差异，结合行为学和组织学情况，全面了解中枢神经系统铅中毒机制，寻找引起差异的可能机制。
主要创新点
1.比较不同大鼠铅中毒模型的特点，为不同实验要求提供合适动物模型。
2.结合不同层面（行为学、组织学、代谢和信息学）的改变分析了不同类型铅中毒大鼠中枢神经系统变化情况，寻找其差异，了解差异的可能原因，发现可能的新机制，为铅中毒防治提供理论支持。
（四）项目预期目标（主要技术经济指标、社会效益、技术应用和产业化前景以及获取自主知识产权的情况）
通过本项目实施，预期达到以下目标：
1.成功建立大鼠不同类型铅中毒模型
2.在国内外重要期刊发表论文2-3篇
3.系统比较大鼠不同类型铅中毒模型的中枢神经系统变化异同，为深入开展
铅中毒机制研究通过实验数据。
（5）项目实施方案、技术路线、组织方式与课题分解
项目实施方案
1．不同类型铅中毒大鼠模型建立
A、幼年急性铅中毒大鼠模型建立。
幼年铅中毒大鼠模型选用新生大鼠出生当天，采用腹腔注射醋酸铅溶液，0.36%、0.12%醋酸铅溶液0.1mL,隔日注射1次,共8次,至17d时实验结束。
根据血铅浓度变化，确定急性铅损伤动物模型建立，
B、成年急性铅中毒大鼠模型建立。
选用成年大鼠（200-300g）,采用腹腔注射醋酸铅溶液，0.36%、0.12%醋酸铅溶液0.1mL,隔日注射1次,共8次,至17d时实验结束。
幼年铅中毒大鼠模型选用新生大鼠出生当天，采用自由饮用醋酸铅水溶液，醋酸铅溶液浓度为2、0.2、0.05g／L醋酸铅水溶液。
染毒60-90天，根据血铅浓度，确定慢性性铅损伤动物模型建立，
选用成年大鼠（200-300g）,采用自由饮用醋酸铅水溶液，醋酸铅溶液浓度为2、0.2、0.05g／L醋酸铅水溶液。
染毒60-90天，根据血铅浓度，确定慢性性铅损伤动物模型建立，
2．行为学实验（Morris水迷宫实验）
（1）采用定位航行实验，实验历时4天半，每天分上、下午两个时间段，共9个时间段，大鼠每时间段测试4次，分别从水池的东、南、西、北4个点入水，入水时大鼠面朝池壁。
设定120秒为最长逃避潜伏期（escapelatency），超过120秒的记录为120秒。
每只大鼠在120秒内仍未能找到平台，则由实验者将其引向平台，时间则记为120秒，每次测试间隔为15秒。
测试结果记录大鼠寻找平台的逃避潜伏期、运动路程和运动速度。
（2）空间探索试验。
测试第五天下午将平台移去，将大鼠固定一点放入水
中120秒，记录它在120秒内穿过平台位置的次数（穿环次数）。
3．组织学实验取材大脑皮质的额前区，海马回和小脑，进行肉眼形态观察看有无异常。
进行病理切片，进行常规染色，观察脑细胞及周围组织变化情况，同时进行免疫组织化学分析，ChATBrdU、NFGFAP单标或双标反应切片，观察中枢神经元和胶质细胞的存在状态和新增殖趋势和状态。
4．生化、酶联免疫法和分子生物学实验。
采用原子吸收仪测定血铅含量，生化试剂盒测定NOGTP谷氨酸、谷胱甘肽、钙含量，SOD,MDA,GSH-Px,AChE舌性。
ELISA测定钙调素、蛋白激酶和cAMp腺昔酸环化酶，鸟昔酸环化酶，磷酸二酯酶，NOS和CaMKt活力，PCR
仪测定cNOS和CaMKtmRNA表达情况。
技术路线
综合各种结果全面评价不同类型铅中毒大鼠中枢神经系统损害差异，寻找可能原因，发现可能新机制。
（六）计划进度安排。
2012年7月〜2013年3月：
大鼠铅中毒模型的建立与验证。
2013年3月〜2013年12月：
行为学实验（Morris水迷宫实验），组织病理实验。
免疫组织化学分析星形胶质细胞或神经元的状态。
生化、酶联免疫法和分子生物学实验。
通过测定血液和脑组织铅含量及生化指标，了解各种动物的铅含量状况，酶法及酶联免疫方法测定脑组织中主要代谢酶的活性，酶联免疫法测定相
关蛋白的表达状况，RT-PCF测定相关指标的基因变化。
对项目进展及成果评估，并进行指导交流。
（七）现有工作基础和条件。
1、工作基础
对本次所列的项目，我们是有信心的。
首先，在申请者本人方面，申请者长期在实验动物和动物实验领域从事研究工作。
在工作中，开展了多种药物的安全性评价，包括中药、西药的各种剂型的评价。
同时积极开展各种疾病模型的建模工作，其中动物涉及家兔，猫，豚鼠，大鼠和小鼠。
针对大鼠就已经在实验室成功建立了高脂血症模型、高血压模型、心肌梗塞模型、糖尿病模型、炎症模型、肝纤维化模型、脑缺血模型、老年痴呆模型。
在这些工作开展过程中，申请者已经熟练掌握了疾病模型建立的各种基础理论及研究技术手段。
其中在脑缺血模型、老年痴呆模型建立中，熟悉了大鼠脑的结构，大脑分区，血管走行，脑片的制作，中枢神经元和胶质细胞的病理识别，神经递质测定，掌握了学习记忆功能的多项测试，如跳台，避暗，水迷宫实验等。
其次，申请者在过去的工作中，曾经建立了小鼠铅中毒模型，研究了“好神采排铅口服液”对铅中毒的排铅作用，并对其排铅机理进行研究，最后发表了论
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