植物生产与生物技术Word下载.docx
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出之癒傷組織移入不合植物生長調節劑之垮養基中之垮養方法為主來進行不
定胚之分化o
4.垮養目的與垮美材料
植物一般籍由以根、莖、黨等營養器官進行生長,而以花、果實等生殖器
官繁衍其子代來維持其物種之生存。
組織垮養就是利用這些器官或器官之一
部份,甚至利用構成各個器官之組織或細胞做為垮養材料。
這是因為植物有
分化全能性使然,也因此緣故,而開發出許多種之組織垮養方法及技術o
植物組織垮養隨培養目的之不同,其所使用之垮養材料也有所不同Q例如,
欲大量繁殖出優良種苗庭、以基因之變異率低且再生能力強之莖頂分生組織做
為垮養材料,較易獲得優良種苗（表2.1）。
而為獲得無病毒種苗則應以不今
病毒之莖頂分生組織做為材料o另'
垮養或生產單倍體植物或多倍體之之純
系植物,應以花粉或合花粉之花藥做為材料。
叉,種問雜種或遠緣屬問雜種
植物之育種,應以合受精胚之子房、胚珠或胚做為材料來進行垮養。
表2,1培養目的與部位
|目的時許按計|垮養方法與技術|（毛培養部位于:
11
|（1胸悶成!
|莖頂培養、鄉村遁|頂芽肢芽!
（）育種|@半倍體、純系之育出|花粉（1已藥）垮養|花藥、花粉門:
@）近緣種問雜種之育出胚、胚珠、子房垮養,胚、胚珠、子房;
2
試驗內垮養
@遠緣種問雜種之育出|原生質體培養、葉、幼苗、癒傷組織、
|細胞融合垮養細胞等
|@變異體之育出斗嘿|細胞（組織）培養|植物體之一部份it（:
1
|@有用基因之導~Atii基因轉換、民小ii各組織、細胞、站立i
ii|原生質體J斗位于|
fffr人jaJKJji
tEι半截心2吟呵!
!
恥芳、
（三）植物組織培養之技街及其利用
植物生物技術分野中,包括組織垮養、細胞培養、原生質體垮養、細胞融
合、基因工程等多種技術。
其中,組織細胞培-養技術包括無菌播種、莖頂垮
養、器官玲養、花藥土吾養（含花粉垮養）、胚垮養、細胞垮養、原生質體培
養、細胞融合等技術o
植物組織細胞培養技術之利用目的可分為四大部份。
@大量生產形質均一之無病種苗。
@種問雜種或屬問雜種之育種。
@變異只νr還與利用o
azfUFEJ已建1
@二次代謝產物之生產與利用。
二、組織垮養之設備、設施、機器、器具及其安全管理
（一）設備、設施、機器、器具
植物組織培養所必需之設施、設備與儀器種類極多,且不斷地繼續開發出
新產品。
隨學校條件並充份了解使用目的而做過切地添購,並要安全適當地運用操
作o
另外,設施、設備之妥善使用及維護,自行製作器具等也非常重要o例如,
垮美容器不僅可用專用試管、三角瓶,還可以果汁瓶、酒瓶等透明空瓶做為
玲養容器。
叉,諮具放置台（絮）或挑取用之刀丹等都可自行製作。
如
1.設施,與設備
（1）實驗準備室
主要是做為培養基之製備、滅菌、器具之清洗與滅菌等用途之工作室。
實
驗準備室除需實驗台、流理台外,尚需有高壓蒸氣滅茵奎、乾熱滅菌箱、純
水製造機、藥品絮、冷凍冷藏櫃（保存培養基母液）、電子點火本生燈與玻
璃器具、刀丹、鴿子等器具之收藏櫃等。
（2）無菌室
為培養材料之消毒、切取、移植等操作之工作室,是組織培養之重要工作
場所o在無菌室操作時,必須使用專用之手套、工作服、帽子與口罩。
無菌
室儘量不使外圍空氣吹入,而所使用之器具也須先行消毒後再繼續使用。
叉,
無菌室中必須照射殺菌燈（紫外燈）,因紫外燈對身體有害,所以在進行無
菌操作時必須將紫外燈關掉。
無菌室入口處應設置兩道門（空氣除塵）,以潔淨之空氣將衣服上之灰塵
儘可能地吹除o無菌室內裝置濾、清器使整個無菌室之空氣係持乾淨o
（3）無菌台
又稱無菌操作實驗台,是一種無塵、無菌,充滿乾淨空氣空間之操作台裝
置O在操作台上之空間將通過濾網之乾淨空氣流通而成。
為避免操作時材料、器具受到細菌與真菌等雜菌污染而使用的O最好在未
使用時照射殺菌燈,以保持無菌狀態。
而濾網須定期清理,濾、網之j塵、清能力
降低時須更換o
〈使用方法〉
@一般在使用前一小時關掉殺菌燈,以消毒液（70%酒精）噴灑無菌台內
之壁面及台面,必要時使用之器具先噴灑?
為毒液,之後移入無菌台並以方便
使用為原則地排列於內,再放動無菌台之濾、清馬達。
@操作前必須先關掉殺菌燈,且不可直視殺菌燈o
@操作前必須以消毒液噴灑手部和指甲後,再行操作o
（4）無菌箱
其目的與無菌台相同,將其當做無菌台使用O與無菌台所不同處為大多數
情形為箱內空氣不流通。
由於灰塵容易進入,因此手部、器具等之出八二欠教
儘量減至最低,此點非常重要。
而其他操作則以無菌台之操作情形為準。
（5）培養室
是將垮養環境條件調至最佳狀況之培養場所。
主吾養室內必須設置空調設備
及放置垮養容器之垮養架（附有照明燈）。
有時還需設置迴轉振盪垮養器與
振盪垮養器。
垮養室內不僅要保持空氣清淨,並儘可能避免溫度變化過大,
而空調之放置位置與垮養架之放置位置也必須通切o
叉,需要較精密之環境設定情形貝lj會使用到垮養箱（植物生長箱）、恆溫
箱、恆溫水槽等o
2.機器
（1）高溫蒸氣滅菌妥
是一種滅菌倉內充滿著高溫、高壓之水蒸氣（一般是120℃、l2kg/cm2）
快速減菌裝置o做為垮養基及實驗器具之清毒用,其熱;
原有電器與瓦斯兩種o
@確認消毒倉底水量是否適量O
@將銘箔紙包住之器具或瓶裝之水盛裝於不銬鋼網籃內,再放入消毒倉
內。
@蓋緊消毒倉蓋並關好排水管及排氣管閑闕,再將溫度設定於120℃,而
時間設定為12~20分鐘o
@當定溫器停止時,電源、會自動切斷,而須符消毒倉內壓力,降為O時,
才可以打開排氣管閑闕,待排氣管蒸氣排完之後,再打開消毒倉蓋子。
滅菌裝置除高壓蒸氣滅菌堂外,尚有乾熱滅菌箱。
這是一種將清毒倉內空
氣加熱至150~18OOC進行滅菌處理ld小時之裝置。
一般是用來消毒不合培
養基之玻琦器具及金屬器具。
（2）竣撿度計
培養基pH值（氫離子濃度）之調節測定儀器。
由於電極先端易破損,故
須小心使用。
@使用前十分鐘開敢電源,並確認儀表之穩定性。
@拔除電極橡皮套,並以蒸餾水沖洗附著於電極先端之結晶。
@將電極先端插入pH7之標準液中,並就溫度之標準pH值（一般言主明滿
於標準液之容器上）將pH調整為7,再利用調節旋扭調至該溫度之標準pHf
值。
@pH4之調節方法也相同。
@將電極插入溶液內,並輕輕地攪拌溶液,待儀表指針穩定後,3賣取pH
@電極由溶液中取出後,必須將電極先端以蒸餾水沖洗,再用波、紙或面
紙輕輕地貼上,以吸除蒸餾水o
@電極是以飽和之氯化鈣溶液進行保存（也可用蒸餾水保存）。
（3）天平
主要做為垮養基製備時量秤之用o有上血天平、分析天平等。
近來以操作
方便且精密之電子分析天平最為常用。
〈使用之注意事項〉
@具有潮解性之藥劑（氣化鈣、硝酸鈣、蛋白凍等）在高溫狀態下量秤
峙,動作須迅速。
@電子分析天平由於極為精密,故易受到氣流影響,應禁止置放於通風
強及人走動頻繁之場所。
另,在電極微量不易秤量之情況下可先將藥劑配製成高濃度,再以定量吸
管抽取使用。
（4）顯微鏡
解剖顯微鏡最常使用,但細胞融合則必須使用倒立顯微鏡。
叉,可在顯微
鏡上連接傳真螢幕或加裝照相機。
@依照材料色澤之不同做適合使用之觀察台、色澤之選擇（黑色或白色）,
再將材料置於觀察台之正中央。
@先將光量旋轉至最小光量,再開放電源、照亮材料o
@將按目鏡距離調至適合之眼距o
@一邊注意接物鏡避免觸及材料,一邊調整焦距o
（5）電磁攪拌器
製備垮養基時做為攪拌溶解藥品或禁液之裝置。
也有加熱電磁攪拌器,可
做為攪拌溶解之用o
φ依攪拌量之多少而選用適合之攪拌子。
@攪拌迴轉速度快則會有溶液飛飛與無法充分攪拌之情形發生,應特別
注意O
3.器具
（1）垮養容器
是裝入垮養基或垮植體進行垮養之容器o玻王為製品常用的有三角瓶、一般
試管、大型試管、垮養且等,只要是透明之各種空瓶皆可使用o最近,極輕
便之塑膠垮養且也常被使用o
又'
培養容器之封蓋以銘箔紙最為常用,海綿透氣矽膠詮、不銬透氣才全等
可重複使用,最近也開撥出可透光之透明封口膜或透氣封口祺o
（2）吸管
量液體用之器具在組織垮養中主要是做為調整玲養基之用。
吸管種類有定
量吸管、牛乳白及管等,也可做為分離原生質體用,因此應選用可清毒（高壓
蒸氣滅菌筆）之吸管o使用後,在清洗乾淨前應避免乾燥。
（3）過at器
做為因高壓蒸氣滅菌而易分解物質之溶液或酵素液之滅菌用。
有注射筒型
及抽真空型,二者皆須以小口徑之濾、騏進行滅菌oj庭、朕孔徑大小一般約
1.2~0.45μIno
已使用方法〉
@過濾消毒器裝置組裝好之後,將整個裝置以銘箔紙包住,再於高壓蒸
氣滅菌筆內進行滅菌。
@在無菌操作台內將試料抽引通過波、朕或無菌j皮、紙進行滅菌。
（4）分注器
是一種將調製好之培養基定量分注至容器內之器具。
培養容器數量少之情
形下,可利用吸管或定量吸管進行分注,然而當數量大時,則須使用注連續
式分注器o
@囝體垮養基當冷卻時即會凝固,因此須快速地分注。
@使用後必須在洋菜凝固前以熱水清洗乾淨。
（二）玻璃器具使用前之清潔處理法
1.一殼玻璃器具（燒杯等）
（1）以高壓蒸氣滅菌全消毒後去除培養基等內容物。
（2）容器內混合調製高濃度之中性洗潔液,再將玻璃器具浸於其中。
（3）使用刷子或海綿清洗玻璃器具之內外。
（4）一直到玻璃表面無法沾附水滴為止做充分之清洗。
（5）沖洗後,再以蒸餾水充分沖洗。
（6）置於昧乾祭上,自然昧乾（自然乾燥）或於乾熱乾燥箱內（105~120℃）
充分乾燥（乾熱乾燥）。
（7）乾燥後以銘箔紙封住閉口,收藏於收藏櫃中。
2.定量用器具（定量瓶、定量吸管等）之清洗
（1）浸泡於中性清潔液中（內側無法以刷子清洗之物）。
（2）以自來水充分沖洗（吸管可用橡皮管接自來水通水沖洗）。
（3）以蒸餾水充分清洗。
（4）自然味乾（禁止乾熱乾燥）。
3.新購入玻璃器具之清洗處理
@以中性清潔液沖洗後,盛滿蒸餾水行高壓蒸氣滅菌消毒o
@倒除蒸餾水,將玻璃器具以高壓蒸汽滅菌消毒後再使用。
另外也可浸
泡於1%稀鹽酸→水洗→浸泡於中性清潔液→水洗→以蒸餾水充分沖洗後再
使用。
向組叫操的..EE----E
@高壓蒸氣滅菌筆必須留意隨時加入適量之水量。
打開蓋子時,注意避﹒
兔蒸汽噴及面頰及手部o」﹒
@清洗波璃器具峙,過度施力會有破裂情形發生,自此必須加以留意。
..
以中性洗潔劑清洗峙,應使用橡皮手套以防止清潔劑之傷害o區,ii圖
@次氣酸納等清毒液常因升溫或光照、而會冒出瓦斯氣體,使清毒容器內﹒
之壓力升高,因此每次打開容器蓋子時,應留意避免因壓力而使蓋子彈出之﹒
危險發生。
@濃鹽酸或氮氧化銷等腐蝕性藥劑,不慎滴減至皮膚時,應的lj以大量﹒
之水沖洗乾淨oJEE
三、組織垮養之培養基組成與製備1.
培養基是組織垮養中最主要之成功因子之一,至今藉由許多研究專家已開..
發出各種組成之培養基。
然而,最適合之垮養基必須符合植物種類、品種、..
培植體及培養目的等,因此如何快速地將垮養物順利地垮育出,貝1!
須隨時針..
對培養基做檢討與改良o..
首先,要針對從過去所用之資料加以選拔、測試,並加以修改,進而找出..
最適合之培養基組成oEall-
（一）培養基之組成1.
垮養基之組成大體上可分成,@水,@無機營養物（又叫無機鹽類）,@有..
機營養物（又叫有機物）,@植物生長調節劑,@天然物質,@垮養基支撐物..
等所組成（表2.2）。
培養基就其組成成分而言,可分成以人工合成而且化學物質組成明確等物..
質所調製之合成（人工）垮養基,與利用夭然物且化學物質組成不明確之夭..
然物質所製成之天然垮養基兩種。
J..
1.水叮..
組織垮養所使用之水一般是利用蒸餾水製造氣器、離子交換製造器、逆滲..
透麟、過濾消毒等裝置或幾種裝置配合精製而成之純水（純度高之水）。
-EEE
2.無機營養物..
需要氣素（N）、磷（P）、針（K）、鈣（Ca）、鎮（Mg）、硫（S）等多量..
無機鹽類與各種微量無機鹽類成分。
各組成分是利用令該成分之無機鹽類做..
為各無機鹽類之來源（請參考表2.2）。
以不同無機鹽類及劑量而製造出各種..
組成之培養基o...E.E.-..E.E.-E.E.-E
3.有機營養物
有機營養物主要有糖及維他命。
糖有砂糖（又叫濤、糖）、前萄糖與果糖,
其中以菜、糖最為常用o維他命除維生素Bl（Thiamine-HCl）外,有用維生素
BG（Pyridoxine-HCi）、維生素F（又叫菸鹼酸,Nicotinicacid）等做為輔助o
為促進植物生長之物質常添加叭,醇（1ny0.inositol）及氯基酸等。
表2-2垮養基之組成分
|水|純水（你等）明哲掃121山|
:
告氣素的MUSO卜KN03）,?
織（FbEDTA）|
贅I磷（IGLP0小NaHzPO1）錯（CoCl2）i
岫物j紳（ItNOJ〈Cl）鉛（ZnS01）于
（成鈣（CaCl2,Ca（NOR）2）鐵（NiCl2）」
（）份鎮（MgsO4、MgClJ嘲（HS01）1
內之硫（NLSO勻）銘（AICIJ持
可織,鍋（Na島2MOO1）|
做鹽:
銅（CGtuI滔SOiJ）ι位L1fJ品t品J;
字幸11J去i拷
L
j烏鳥類碘（K則I）1
該〕:
主一一←;
戶干?
抖打f卡1jλ1壘純豆三;
r凸辛f
iU:
j!
（糖）（附附）（他生吋長
F浮蕉菩玄、糟維生素B夙l（Thiamine）肌醇（InmIn1予刊O伽叫.扎IhhIn1OωSiωtωOi刊）戶j
養i誦制萄槽維生素B臥6（P時即Mypmrn岫i
i果樺維生素F（Nicotimcacid）1
物il
素AAM
|細胞分裂素（BA、IQnetII1、Z￡atIE1）|
|漱渝素（GibberCHin）|
|脫落酸（Abscisicacid）|
|乙:
陳（Ethylene）|
劑!
椰子汁
果汁l
j舌性炭等|
4.植物生長調節劑
最常用者為生長素（auxin）及細胞分裂素（cytokinin）。
其中生長素有NAA、
IBA、294-D等,而細胞分裂素最常用者為BA、KinetiIIO此二類植物生長調
節劑均為人工合成之物質,因此即使以高壓蒸氣滅菌筆加熱消毒也不易分
解。
另外,生長索中之iAA與細胞增殖索中之Zeatirl也常被使用,唯此者均
為天然抽取之植物生長調節劑,極易因熱、光照而分解,因此使用時應特別
留意以避免被分解。
5.天然物質
常添加於培養基中之天然物質有椰子汁（未完熟椰果之汁液）、香蕉、番
茄、馬鈴薯等粗汁液及麥芽、酵母等抽出液。
這些天然物質中常含有促進植
物生長之物質,因此當人工合成垮養基無法順利地垮養出預期之垮養目的
時,添加天然物質常有良好之效果o
另,在垮養基中添加活性碳也常有促進生長之效果o其原因可能是在垮養
過程中,由垮養細胞排出之昌分類化合物或有害物質可被活性碳吸附住,而可
避免傷害到垮養物。
6.垮養基支撐物
固體垮養基之支撐物以洋菜最為常用o除洋菜外,也可利用水晶洋菜、濾
紙（紙台培養法）等O洋菜與水晶洋菜是做為固體垮養之支撐物（固定劑）,
而濾、紙等是配合液體垮養基做為支撐物o
7.酸鹼值（氫離子濃度）
垮養基之pH值必須調節o一般調節至5.O~6.0之間,欲調節至酸性時以
鹽酸滴定調節之,而欲調節至鹼性時貝lj以氫氧化納滴定調節之。
8.滲透壓
在進行原生質體玲養峙,可調節滲透壓來分離原生質體（由細胞耳其部分收
縮,而使細胞壁自細胞朕脫離之現象）,因此有必要做滲透壓之調節o
（三）培養基之製備
在此以最常用於組織垮養之MS（luturashigeandSKoog'
1962年）垮養基
做為例子,介紹垮養基之自己製方法。
MS垮養基中也有將MS之無機鹽類、
劑量稀釋成二分之一（l/2MS培養基）做為玲養基組成,常做為多種植物
之垮養基o
1.垮養基母波之製備
常用之士各養基宜先製f看其母液,將數種鹽類或組成份溶解製備成100倍左
右之高濃度母液（稱為垮養基母液）等常保存於冷藏樞,待需用時再行西己製
所需之垮養基。
無機鹽類相;
昆今日尋常有沉澱現象,故必須加以注意Q並f盡可
能以純度高之藥劑做為冷養基之組成分之來源,並依表2-3製備玲養基之母
液A至母液Eo各母液組成藥劑之溶解、混合應於每一藥劑完全溶解之後,
再依序加入下一個藥劑O
表2.3
培養基母液之組成分與製備之實例
垮養基母液之組成分與製備之實例
44g
37g
278g
3.73g
lOO
IOO
20
400
og
mg
t吾養基
母j夜
母
液
A
NH4N01（硝酸鍍）
KN03（硝且是針）
KH2P01（磷酸二氧針）
HzB03（嘲酸）
MnS014~6H,0（硫酸鐘
ZnSOI7H、0（已ftE輩輩辛）
的（碘化紳）
NLMo042H20（組酸納）
CuSOJH20（硫酸銅）
CoCl26H20（氧化鉛）
t吾養基母液之組成份
母液B
母液C
CaC122H20（氧化鈣）
MgS047HzO（硫酸鎮
D
FeSOJELO（硫酸亞鐵）
NazEDTA（乙二氧四甜酸納
16
l9
620
2230
860
83
25
2.5
5g
7g
ms
IIIR
E
（如倍液）
在l多/純水中依序加八A
母液之各個組成份,最後
再加水至終容積為2/υ
硫酸銅與氣化鈴由於不易正
確地秤量其劑量﹒因此先
各別秤壘2多（）lng溶解l{}（}
II1/純水中,再自其中取l
lnl加入A母液中υ
調製方法
lMvo--Inositol（肌酵）
Nicotinicacid（菸鹼峻﹒維生素的
|PFridoxine-HCl（維生素B6）
Thiamine-HCl（維生素B1）
Ghclne（甘氯酸）
（loof告J夜）
溶解於1i之純水
（loof告j夜）
溶解於ilj純水
（loof告j夜）
溶解於1/純水
保存於冷藏.櫃中,若發生
況:
殿現象,則以加熱方
式再行溶解υ
（200倍液）溶解於il純水由於容為長雜菌,可分裝
於PE材質之瓶罐內行
冷凍保存（盛裝於玻璃
瓶行冷凍保存時﹒玻璃
瓶會破裂,故應避免使
用）
I註l
1）A~D母液以高壓蒸氣滅菌後,另行冷藏保存,可避免草生雜菌。
2）也可製成4個母液,;
然而製成多個母液﹒其母液之沉澱現象較不易發生
2.植物生長調節劑之溶解方法
@將需要使用之植物生長調節劑秤取5Omgo
@將秤量之植物生長調節劑移入燒杯內,再加入少許95%酒精,並充份
攪拌至完全溶解為止iBA貝lj以Ol~lN（規定液）HCi進行溶解l。
@植物生長調節劑完全溶解後,將溶液移入量管,並加蒸餾水至500lnlo
@將溶液倒曰:
境杯中,充份攪拌後盛裝儲存瓶內（此植物生長調節劑溶
液濃度為lIIIg/lOml）o
3.培養基之配製
i/大燒杯中加入500IIIf純水,一邊以磁鐵攪拌器攪拌,一邊依序加入A~E
垮養基母液、植物生長調節劑及茶、糖,最後加純水至1lo
4.調節pH值
以酸鹼度計將pH值調節至5.8o以0.lNHCl或0.lNNaOH調節pH值O
另外,使用HCl或NaOH時要特別小心,即使是低濃度,若不慎減至皮膚
或衣服,務必要清洗O
R.洋菜之溶解與分注
正確地秤出8g洋菜,並加入垮養基中o主吾養基之洋菜添加量愈多,其pH
值愈接近中性,貝1j其硬度也愈高o在加熱溶解中,當洋菜完全溶解時會呈現
透明狀o
以分注器將垮養基分注至垮養容器中,然後將垮養基以銘箔紙封蓋住o
6.滅菌
以高壓蒸氣滅菌登在120℃以l2~15分鐘進行滅菌（清毒時問過長,貝lj垮
養基會軟化,造成硬度不足之情形發生）,消毒完畢後,減壓降溫,在完全
減壓後,將垮養容器連同滅菌籃一起取出,使垮養基冷卻凝固。
平板垮養基平放靜置,斜面垮養基斜放靜置,凝固後再收起保存。
以高壓
蒸器滅菌妥溶解洋菜後,再於無菌操作台內進行垮養基之分注亦可。
四、無菌操作之基本技街
真菌、細菌等雜菌由於極微小,因此不易由肉眼辨別出,
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