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1立论依据（所选课题的科学意义和应用前景，国内外研究现状分析）：

一、研究意义：

川崎病（KawasakiDisease，KD）是一种急性全身性中小血管炎性综合征，主要累及冠状动脉，可以引起冠状动脉扩张、冠状动脉狭窄甚至心肌梗死，是儿童后天性心脏病的主要原因，并属于自身免疫性疾病之一。

其发病率近年来呈上升趋势，且发现该病至今其发病机制尚未明确，因此，探寻与川崎病相关的细胞因子并对其机制进行深入研究具有重要的临床意义。

趋化因子与自身免疫性疾病的关系已经成为人们日益研究的热点，但是趋化因子与川崎病的研究报告目前还较少，尤其是趋化因子CCL5及其受体CCR5在川崎病中的表达作用，目前国内外尚无报道。

二、川崎病研究现状：

川崎病（KawasakiDisease，KD），又称为皮肤黏膜淋巴结综合征（Mucocutaneouslymphnodesyndrome,MCLS），是一种好发于5岁以下儿童和婴幼儿的急性全身性血管炎性疾病，可累及动脉、静脉和毛细血管，其中以冠脉受累最为严重。

它导致冠脉扩张、冠脉瘤、狭窄甚至闭锁，[冠状动脉损害包括冠状动脉扩张（冠状动脉内径>

3mm）和冠状动脉瘤（冠状动脉内径≥8mm）]，已经成为发达国家中儿童获得性心脏病的最常见原因[1-3]。

川崎病的严重性取决于冠状动脉损伤程度，部分患儿发展为冠状动脉瘤后容易形成血栓，可进展为冠状动脉阻塞性扩张，从而引起心肌缺血甚至发生心肌梗死及青壮年猝死。

自从上世纪60年代日本医生川崎富作首次报道后，世界各地均有报道，其发病率在日本、韩国、台湾等亚洲地区5岁以下儿童中为69-213/100000，并且近年来呈上升趋势[4-9]。

因此，越来越多的学者对其发病机制进行深入的探究，但尚未明确具体发生机制。

目前研究显示，川崎病发病主要与以下因素有关：

微生物毒素类超抗原介导作用，某些微生物产物对T细胞有超强激活能力；

免疫系统异常激活，T细胞和B细胞异常激活产生大量的细胞因子、炎性介质引起血管内皮损伤；

种族遗传因素等。

其中，T细胞异常活化是川崎病免疫系统激活导致血管免疫损伤的始动环节，川崎病急性期和亚急性期外周血T细胞亚群失衡，T淋巴细胞总数下降，CD4+T细胞数目增多，CD8+T细胞数目减少，使细胞处于免疫活化状态。

异常活化的T细胞和单核细胞释放大量的细胞因子和炎性介质，如肿瘤坏死因子、干扰素、白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素8、白细胞介素10、内皮素、血小板源生长因子、超氧自由基、可溶性黏附分子P-选择素、一氧化氮等［10］，以上多方面因素影响损伤血管内皮。

综上不难看出，川崎病的发生与CD4+辅助性T细胞有密切关系，由此推出CCR5作为活性Th1淋巴细胞的表面标志物，与其配体CCL5一起在川崎病的发病中占有相当重要的地位。

国外学者Jhang［11］等已从基因多态性方面证实了CCR5与川崎病的关系，该研究发现CCR5（-2135C/T）启动子上T等位基因纯合子的概率明显高于先天性心脏病患儿，但2种基因型（CC+CTvsTT）在冠状动脉瘤患者和非冠状动脉瘤患者中比较无差异，提示CCR5（-2135C/T）启动子多态性同KD的发病相关，但与冠状动脉瘤的发生无关。

三、趋化因子CCL5及其受体CCR5的研究现状：

1.趋化因子及其受体的生物学特征：

趋化因子（chemokines）是细胞因子超家族中的成员之一，是一类对细胞具有定向趋化吸引作用的小分子蛋白质，它可以定向吸引免疫细胞参与免疫应答和免疫病理过程[12]。

到目前为止，至少有50种趋化因子被发现，其由70-125个氨基酸组成，分子量在8-11KD不等。

大多数趋化因子含有4个保守的半胱氨酸形成的两个特征性的二硫键，故其有很相似的高级结构，C端为α螺旋，N端不规则，有比较高的生物学活性，与受体相结合。

根据趋化因子N端4个保守半胱氨基酸的前两个半胱氨基酸残基的位置和数目，将其分为四类：

①若两个保守的半胱氨基酸残基位置相邻时，归类于CC家族，例如CCL5（RANTES）、CCL3（MIP-1α）、CCL2（MCP-1）等。

②若两个保守的半胱氨基酸残基被一个任意的氨基酸隔开，则属于CXC家族，例如CXCL8（IL-8）、CXCL10（IP-10）等，根据第一个半胱氨基酸前是否存在谷氨酸-亮氨酸-精氨酸（ELR）序列将其分为含ELR的CXC趋化因子和不含ELR的CXC趋化因子。

③若两个保守的半胱氨基酸残基被三个任意的氨基酸隔开，则属于CX3C家族，该家族只有一个成员即CX3CL1。

④只有一个保守的半胱氨基酸残基，属于C家族。

趋化因子受体（chemokinesreceptor）属于G蛋白偶联受体超家族，其结构中均具有7个富含疏水氨基酸的跨膜片段，N端与相应的配体相结合，C端位于细胞内含有丝氨酸/苏氨酸结构，参与细胞内信号的激活与传导，引起一系列的生理和病理活动。

趋化因子受体主要表达于骨髓来源的各种白细胞，也表达于上皮细胞、血管内皮细胞及神经细胞等。

目前所知的趋化因子受体约有19种，根据与其结合的配体不同而命名，包括1种XC受体（XCR1）、6种CXC受体（CXCR1~CXCR6）、11种CC受体（CCR1~CCR11）和1种CX3C受体（CX3CR1），其中CXCR和CCR研究较多[13]。

一个亚家族内，一种趋化因子可与几种趋化因子受体相结合，一种趋化因子受体也可与几种不同的趋化因子结合。

CCR5的分子结构：

平均分子量为40.6kDa，由352个氨基酸残基组成，结构上可分为：

胞外N-末端，3个胞外环（EL1-3），3个胞内环（IL1-3），7个跨膜α螺旋和胞内C-末端。

图1CCR5结构图

2.趋化因子及其受体与自身免疫性疾病的关系：

趋化因子首先作为趋化性介质被发现，但随着对趋化因子研究的深入，现在已经认识到趋化因子不但对白细胞具有趋化作用，而且在免疫细胞和器官的发育、免疫应答过程、炎症反应、病原体感染、创伤修复及肿瘤形成和转移等方面发挥广泛的生理和病理作用［14-16］。

随着近年来对趋化因子及其受体研究的深入，国内外众多学者均已发现其二者结合在自身免疫性疾病中对T细胞的募集及趋化进行作用，并将相应T细胞聚集至靶器官发生组织器官损伤。

Wenzel［17］等在研究系统性红斑狼疮（SLE）时发现CXCL10及其受体CXCR3的结合可定向招募细胞毒性T细胞进入靶器官最终造成皮肤损害；

Barone等［18］研究表明，干燥综合征（SS）患者泪腺角膜上皮细胞CXCL9、CXCL10、CXCL11及受体CXCR3表达均升高；

Goulvestre等［19］通过对甲状腺组织中表达的细胞因子和相应趋化因子研究，得出CCL21、CXCL12、CXCL13、CCL22在自身免疫性甲状腺疾病（AITD）患者的甲状腺组织中的表达增加，其中自身免疫性疾病甲状腺组织中有异位二级淋巴滤泡形成的CXCL12、CXCL13、CCL22的表达显著增加。

目前对于趋化因子及其受体的研究点在于趋化因子在自身免疫性疾病中所起的募集、趋化T细胞至靶器官的作用，但其在川崎病中的具体作用研究尚不多，本课题即以此为出发点进行相关探讨。

3.趋化因子CCL5及其受体CCR5与自身免疫性疾病的关系：

趋化因子CCL5，又称为RANTES（regulateduponactivationnormalTcellexpressedandsecreted），属于CC趋化因子家族的成员，是一类调节正常T细胞表达和分泌的细胞因子，具有介导T细胞、单核细胞、树突状细胞、NK细胞、嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞定向趋化的作用。

CCL5的受体有三个，分别是CCR1、CCR3和CCR5，其中以CCL5与CCR5的亲和力最强，构成了CCL5/CCR5生物轴。

CCR5属于趋化因子受体的一种亚型，主要在记忆性静止期T淋巴细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞及树突状细胞的细胞膜上表达，是活性Th1淋巴细胞的表面标志物。

CCR5的三个特异性配体为CCL5/RANTES、MIP-1β/CCL4和MIP-1α/CCL3，其中前两者所引起的活化信号比MIP-1α要强的多。

当三个配体与CCR5结合后，可以激活G蛋白引起细胞内的Ca2+浓度的上升并活化蛋白激酶C，使得白细胞表现为趋化性及炎性反应等[20]。

自1996年人们克隆该基因并发现CCR5可以作为HIV的共受体（coreceptor）参与HIV的感染，CCR5就引起人们极大的兴趣并一直是科学研究的热点之一，后来又陆续发现在一些自身免疫性疾病如类风湿关节炎、幼年特发性关节炎、多发性硬化及恶性肿瘤等的病程中CCR5可能起着关键作用。

早期有学者在对于幼年特发性关节炎（JIA）的研究中发现，趋化因子CCL5的表达水平、表达部位在JIA时发生了明显的改变，且在体外诱导JIAT细胞活化后，其表达更多的CCL5，且滑液中T细胞产生CCL5的能力显著强于外周血中的T细胞，提示JIA时关节局部T细胞在一定的促活化条件下，可产生大量的趋化因子CCL5，从而趋化CCR5阳性T细胞（主要为Thl细胞）和单核细胞侵入病变关节部位，这种反馈机制使得关节的炎症迁延不愈[21,22]。

但是CCL5/CCR5生物轴在川崎病中的表达，国内外尚未见报告。

⑵研究内容、预期目标或成果（具体说明课题研究内容、要重点解决的关键问题和本课题所要达到的目标或要取得的成果）：

一、研究内容：

1．检测KD患儿表达CCL5、CCR5的具体细胞

1）.收集KD患儿和正常对照组外周血3~4ml，PBMC分离：

无菌肝素钠抗凝血3~4ml，经Ficoll密度梯度离心法分离提取外周血单个核细胞（PBMCs）；

2）.分别用抗人CCL5及抗人CCR5抗体对细胞表面、细胞内进行染色；

3）.流式细胞技术（FCM）检测分析T、B细胞和单核细胞中CCL5、CCR5阳性细胞的比例。

2．检测KD患儿外周血单个核细胞CCL5mRNA、CCR5mRNA的表达

1）.PBMC总RNA抽提及逆转录反应合成cDNA；

2）.RT-PCR检测KD患儿外周血急性期CCL5/CCR5的mRNA水平。

3．检测将T细胞活化后CCL5、CCR5的表达水平

1）.采用抗CD3单抗及抗CD28单抗联合刺激T细胞，使其活化增殖；

2）.FCM分析T细胞表面CCL5、CCR5的表达水平。

4.对实验结果进行分析

1.明确CCL5、CCR5分别在外周血PBMC中的具体表达细胞；

2.对于活化前后的T细胞，CCL5、CCR5的表达水平有何变化；

3.找到CCL5、CCR5之间在川崎病患儿中表达的联系。

经过上述比较，研究CCL5与CCR5在川崎病患儿外周血中的表达变化，从而为川崎病发病机制和治疗手段提供新的思路。

二、关键问题：

1．对研究对象的临床数据资料和临床标本收集、整理以及实验分组。

2．对实验数据进行分析。

3．阐明CCL5、CCR5与KD的相关性。

三、预期目标：

1.明确CCL5、CCR5分别在外周血PBMC中的具体表达细胞。

2.找到活化前后的T细胞CCL5、CCR5的表达水平变化。

3.对CCL5、CCR5与KD的相关性得出结论。

4.在核心期刊发表论文2-3篇。

⑶拟采用的研究方法、技术路线、试验方案及可行性分析、现有的研究基础：

一、研究方法：

1．进行临床数据资料和临床标本收集、整理。

采用病例-对照研究方法，采集入组KD患儿组和健康对照组儿童外周血3-4ml放置于0.2%EDTA抗凝管中，于-80℃冻存，备用。

同时收集入选对象的临床资料并进行整理。

2．检测KD患儿表达CCL5、CCR5的具体细胞

1）.PBMC分离：

Ficoll密度梯度离心法分离提取外周血单个核细胞（PBMCs）；

3．检测KD患儿外周血单个核细胞CCL5mRNA、CCR5mRNA的表达

4．检测将T细胞活化后CCL5、CCR5的表达水平

5．用统计学方法对实验结果进行分析

二、实验方案：

1.标本

1.1研究对象选取及分组

1.1.1病例组

选取2013年10月-2014年7月在三峡大学仁和医院、宜昌市中心医院及宜昌市二医院就诊的川崎病患儿20例，年龄波动于6月~8岁，平均年龄（2.10±

1.83）岁，男：

女=2:

1。

受检对象按入选顺序编号，如第1个入选对象编号为1。

诊断标准选用美国心脏病协会制定的川崎病诊断标准[23]:

1）发热持续5天以上，抗生素治疗无效，不能被其他已知疾病所解释；

2）双眼结膜充血（非渗出性）；

3）口唇鲜红、皲裂，口唇點膜弥散性充血，杨梅舌；

4）多形性红斑、皮瘆；

5）在急性期有手足硬肿，掌距红斑；

在恢复期指（趾）端甲床皮肤移行处有膜状脱皮；

6）急性非化脓性颈淋巴结大，常为单侧，其直径>

1.5cm或更大。

以上标准至少满足5项，可确诊为川崎病，其中1）为必备条件。

若患儿不明原因发热超过5天，伴其他诊断标准中的3项，并经二维超声心动图或冠状动脉造影确诊存在冠状动脉扩张或冠状动脉瘤，除外其他疾病，亦可确诊。

本研究中所有患儿均符合上述标准，同时亦满足日本厚生省川崎病研究课题组第5版修订川崎病诊断标准。

参照美国心脏病协会及日本卫生部川崎病并冠状动脉损害诊断标准，将病例组分为冠脉损害组（6例）和冠脉无损害组（14例）。

冠状动脉损害的诊断标准如下：

1）冠状动脉壁辉度增强；

2）冠状动脉扩张标准：

3岁以下患儿冠状动脉内径≥2.5mm，3-9岁患儿冠状动脉内径≥3mm，9-14岁患儿冠状动脉内径义≥4mm；

冠状动脉某一节段内径超过相邻段内径比值的1.5倍。

3）冠状动脉瘤：

冠状动脉扩张段内径超过相邻段内径比值的1.5倍，且内径≥4mm；

冠状动脉呈瘤样扩张,其形态呈囊袋形或梭形，内径<

5mm为小型冠状动脉瘤，内径5-8mm为中型冠状动脉瘤，内径>

8mm为巨大型冠状动脉瘤。

1.1.2对照组

为同期以上三家医院门诊儿童20例，年龄波动于6月~7岁，平均年龄（2.32±

1.75）岁，男：

1，除外感染性疾病、免疫系统疾病、川崎病等疾病家族史。

所有入组成员均为汉族，在性别、年龄等方面均无显著性差异，具有可比性。

受检对象按入选顺序编号，如第3个入选对象编号为C3。

1.2对临床数据资料和临床标本收集、整理

1.2.1血液的采集

分别采集入组KD患儿和健康对照组儿童外周血3-4ml，以枸橼酸钠抗凝，于-80°

C保存备用，其中KD组釆取时间为急性期（病程的10天内），对照组为门诊第1天，所有采集对象取血时均为清晨空腹状态。

1.2.2收集入选对象的临床资料并进行整理。

2．实验方法

2.1检测KD患儿表达CCL5、CCR5的具体细胞

2.2检测KD患儿外周血单个核细胞CCL5mRNA、CCR5mRNA的表达

2.3检测将T细胞活化后CCL5、CCR5的表达水平

3．分析结果

3.1明确CCL5、CCR5分别在外周血PBMC中的具体表达细胞；

3.2对于活化前后的T细胞，CCL5、CCR5的表达水平有何变化；

3.3找到CCL5、CCR5之间在川崎病患儿中表达的联系。

三、技术路线：

进行临床标本和临床数据资料收集、整理

将研究对象分组

采用抗CD3单抗及抗CD28单抗联合刺激T细胞，使其活化增殖；

FCM分析T细胞表面CCL5、CCR5的表达水平。

检测表达CCL5、CCR5的具体细胞；

Ficoll密度梯度离心法分离提取外周血PBMCs；

细胞染色；

FCM检测分析CCL5、CCR5阳性细胞的比例

外周血PBMC总RNA抽提及逆转录反应合成cDNA；

RT-PCR检测KD患儿外周血急性期CCL5/CCR5的mRNA水平

分析实验结果，研究CCL5与CCR5在川崎病患儿外周血中的表达变化

四、可行性分析：

1.本课题是根据国内外研究现状和前期实验研究结果基础上充分论证提出的，有充分的理论依据。

2.本课题拟在三峡大学免疫重点实验室及第二临床医院完成，指导老师具有良好的理论基础和扎实的实验技术知识。

五、现有研究基础：

1.已采集了部分研究对象资料，并进行了相对应的分组及采血。

2.国内学者已进行过CCL5、CCR5在其他疾病中的表达研究，可提供相应的研究方法及路线参考。

3.前期预实验已分离出PBMC并成功进行了T细胞的活化增殖。

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