食醋酿造过程中微生物多样性与产品多样性的研究进展Word格式.docx

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关键词：

传统食醋；

微生物多样性；

酿造工艺；

产品多样性

Abstract

Traditionalvinegar,ispeopleindispensablecondimentinonethousandyears,thetraditionalcraftbrewingvinegar,notonlytasteunique,andhasthecharacteristicofthehealthcarefunction.Traditionalvinegarbrewingprocesscontrolbyexperience,brewingmicroorganismsthroughenrichmentintheproductionofrawmaterials,spontaneouslyformedthecommunitystructureofcomplex!

Vinegarbrewingprocessafterthousandsofyearsofimprovementandinheritance,brewingmicroorganismstakesplacecontinuouslythedomestication,graduallyformedarelativelystablestructureofflora,differentmicrobialcommunitystructuremaybethecauseofdifferentvinegarflavor,ifonmicrobialtrainingscientifically,anditcanimprovetheprocess,makethetraditionalcrafttostabilize.Differentareas,differentmaterial,differentcraft,aswellastheneedsofdifferentpeople,theproductdiversity,tosatisfythedifferentculture,customsandhabits,thecrowdofdifferentconsumptionlevels.Inrecentyears,researchersfromallovertheworldforthevinegarbrewingintheprocessofmicrobialdiversityandproductdiversityshowedstronginterest,thispapersummarizesthedomesticandforeignscientificresearchpersonnelinthediversityofmicrobialcommunitiesintheprocessofthetraditionalbrewingvinegarandtheresearchprogressonproductdiversity!

Keywords:

traditionalvinegar;

Microbialdiversity;

Brewingprocess;

Productdiversity

前言

食醋是中国传统的调味品，已有近3000多年的历史，食醋不仅有特殊酸味，而且还有一定的鲜味，它能够增进人的食欲、帮助消化，并且还具有良好的保健功能，可以用来防治多种疾病，经常食用食醋可以软化血管，降低血压，预防动脉硬化治疗糖尿病等。

中国地大物博，随着历史的变迁以及地域的不同，传统食醋分化出不同的品种，其中以山西的老陈醋、镇江香醋、四川的保宁麸醋、福建的永春老醋最为著名，早在明清时期即被誉为中国四大名醋。

然而，多少年来，中国食醋主要以家庭小作坊酿造为主，规模小，产量低，技术落后，延承了传统的酿造工艺，依靠经验来控制整个发酵的过程。

进入到当代，尤其是近些年来，由于我国食醋市场需求量日渐剧增，一方面，农村消费向城市化转变的速度加快，另一方面，有越来越多的食品企业开始利用食醋作为生产原料来开发酸化食品，使得食醋出现供不应求的局面。

然而，传统食醋产品的体态口感以及酯香味突出，但是发酵周期很长，原材料的利用率及其产品出品率低，经济效益比较差，从而工业化的食醋生产得到迅速发展。

由于现代生物技术的发展，液态发酵食醋油然而生，极大地提高了食醋生产的效率，安全性也有了相应的保障。

让我们不能满意的是，产品的风味、口感等都很差，不能很好地被现代的消费者所接受。

要想生产出优质的酿造食醋，必须对传统食醋酿造技术以及生产工艺进行改革，既要保留传统食醋的风味及口感，又要实现高产量，缩短食醋生产周期，提高生产效率以及安全性。

我们知道，食醋的生产，发酵是重中之重，这样一来，研究食醋发酵过程中微生物多样性显得尤为重要，通过对传统食醋有益微生物不断地驯化，逐渐形成了相对稳定的菌群结构，不同的微生物群落结构可能是引起不同食醋风味迥异的原因，如果科学地对微生物进行驯化，这样可以改进工艺，使传统工艺趋于稳定。

近年来，随着人们生活水平的提高，人们对食醋的要求开始从温饱型向保健型转移，逐渐出现了水果醋、蒜汁醋、蜂蜜醋、饮料醋等，食醋产品多样化，与消费者需求息息相关。

地域的不同、酿造原料的差异、酿造工艺的差异也是使产品呈现多样性关键所在。

食醋生产企业首先需要根据消费者的习俗、文化以及需求来确定食醋产品的卖点，确定好生产的方向；

其次要对自己的产品市场定位，对不同性别，不同年龄以及不同月收入的消费者购买食醋情况的细分，食醋品种需要根据不同消费者的需求准确提炼，找到自己产品的核心卖点与竞争品牌的差异，知己知彼，以至做到产销结合，促进发展。

1食醋的文化与现状

1.1食醋文化

1.1.1中国食醋文化

中国地大物博，历史悠久，食醋的生产是中国历史上劳动人民智慧的结晶。

我国是食醋的故乡，大约有3000多年的历史，早在公元前1058年，周公著的《周记》及孔子的《论语·

公冶长》中就已经有酿造相关文字的记载，到春秋战国时已出现了专门的食醋酿造作坊。

北魏《齐民要术》一书中，共收藏二十多种酿造方法，其中的一些方法甚至沿用至今天。

周朝的朝廷管理醋政的官员叫做“醯人”，南北朝时醋被当作是奢侈品，有醋调味成为宴请档次的一条标准，到宋时制醋业有了较大发展，食醋开始进入了百姓之家。

各地食醋酿造工艺各有不同，以致中国食醋品种繁多、风味不一，其中以山西的老陈醋、镇江的香醋、四川的保宁麸醋、福建的永春老醋最为著名，早在明清时期就被誉为中国的四大名醋。

酿造主要以小作坊为主，生产规模小，产量低。

近年来，随着社会的发展，社会需要量的提升，食醋日益工业化。

1.1.2国外食醋文化

在国外，用醋防治疾病也积累了丰富的经验。

希腊的希波克拉底医师（公园前460−733年）赞赏食醋的医疗价值，并且使用食醋对呼气器官的疾病、狂犬咬伤等疾病进行治疗。

在罗马，民间常常用用醋来治疗创伤等疾病。

《圣经》中有关于食醋能减轻一些疾病的记载。

西元18−19世纪时，欧洲人外出旅行时会携带果醋，饮水时一定会在水中滴上几滴醋，杀菌消毒预防疾病。

在日本，食醋也有悠久的历史，到现在，日本人对食醋的保健功能十分的重视，“少盐多醋”被列于“长寿十训”之二的重要位置之上。

1.2中国食醋的现状

1.2.1生产技术能力落后

中国食醋的生产已有几千年的历史，生产历史悠久，而酿造技术却相对落后，生产过程中大多数技术指标主要靠的是一代代的相传、互相帮、师傅帮带，靠的是平日观察和口感、靠的是实践和经验的积累，对食醋生产过程中所发生的一些物质的变化一直没有搞清楚，尤其是对微生物多样性的控制极度的缺乏，对食醋技术的分析基本上趋于空白。

从事食醋科研人员的相对短缺，科技投入不足，缺乏科学规范的生产管理等问题严重影响了我国食醋技术水平的提高。

这些问题都严重制约着我国食醋工业的发展。

依靠经验来生产，在安全检验等操作方面缺少科学的管理，以至安全问题难以得到保障。

1.2.2食醋生产规模小

在中国的调味品行业中，食醋一直是非常重要的一种，但发展比较迟缓，多少年来，中国食醋企业较为零散，主要以小作坊，小工厂为主，行业集中度相对低下。

据中国调味品协会统计，目前我国食醋年产量大约在300万吨左右，生产企业却高达6000多家，其中品牌企业产量约占30%，而小型企业却占到70%，而且中国食醋企业分布区域性特别强，基本没有形成全国性的大企业，小而散是整个行业的一大特点。

2食醋酿造过程中微生物多样性的研究进展

传统食醋的自然发酵微生物比较复杂，人们对发酵过程中微生物的组成及结构等缺乏深入的了解，食醋的发酵存在着诸如产品安全性较差、质量不稳定、生产周期比较长、工业化生产难等一系列的问题，研究食醋发酵过程中微生物多样性、分析食醋品质的形成机理成为解决以上这些问题的关键。

过去，人们通常采用传统的分离培养技术，针对不同微生物的特点选择并制定合适的培养基，进行专门的培养，然后通过观察菌群的外观形态、理化特征以及计算菌落数量来确定微生物的种类和数量[1]。

近年来，随着分子生物学和生物化学技术等的不断的发展，出现了越来越多关于微生物的研究方法，而不再局限于传统的分离培养技术。

科学工作者开始用非培养的生理生化方法和分子生物学的技术对微生物进行了更深的研究，使人们对自然界中99%以上不可培养微生物[2]的研究成为可能。

为食醋酿造过程中微生物的研究做出了突出贡献，并且取得了较大的进展。

2.1食醋酿造过程中微生物多样性的研究

2.1.1食醋不同生产工艺中微生物群落多样性的研究

食醋酿造是在众多的微生物作用下，原料物质发生转化的过程，传统的酿造工艺主要分为固态式发酵酿造和液态式发酵酿造，前者由淀粉糖化、酒精发酵和醋酸发酵三个主要阶段组成，后者发酵包括酒精发酵和醋酸发酵二个主要的阶段[3]。

在固态发酵中，通常需要加一些发酵曲来促进原料淀粉的糖化，这些曲是提前扩大培养的含有丰富的发酵微生物的引物。

传统的发酵工程中，让微生物自然进入生产原料中，通过菌体活化并生长繁殖，然后促进原料的转化。

这些传统的自然菌群在使原料发生转化的过程中能产生一些风味物质[4]，这些风味物质就赋予了食醋独特的风味和一定的营养价值。

如今，科学工作者们从功能性菌群上展开了大量的研究，其中多采用了现代化免培养的技术，并且已经取得了可观的成果。

2.1.1.1固态发酵工艺

固态发酵的工艺是传统食醋发酵采用的主要发酵的方式，科学人员对之十分的重视，并且对食醋固态发酵进行了一系列的研究。

研究发现，固态发酵工艺比液态工艺有更多的优点，例如废水的排放量少、污染小等，并且食醋的风味在一定程度上受原料物质的影响。

SEOH等[5]研究了韩国食醋中微生物的多样性并作了介绍，糖化阶段的主要微生物为曲霉菌属（Asper-gullussp.）、酒精发酵阶段的微生物为酵母菌属（Saccharomycessp.）和类酵母菌属（Saccha-romycodessp.），醋酸发酵阶段的微生物为醋菌属（Acetobactersp.）,并且发现用过添加一些辅料并不能影响微生物的多样性，但在一定的程度上促进了风味物质的形成。

我国的科研人员主要对传统食醋固态发酵工艺做了一些研究。

XUW等[6]对镇江香醋固态发酵中微生物多样性做了研究，主要采用了克隆文库、DGGE和实时定量PCR等现代化技术，并发现了镇江香醋中含有多种微生物，主要微生物为乳酸菌（Lactobacillus）、醋酸菌（Acetobacter）、葡萄糖醋杆菌（Gluconacetobacter）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus）、肠杆菌属（Enterobacter）、绿色假单胞菌（Pseudomonas）、黄质菌属（Flavobacterium）、苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium），真菌只是酵母菌属（Saccharomyces.）。

此外，还采用了PCR技术对镇江香醋固态发酵中微生物的含量做了相应的测定，总结发现，镇江香醋在固态发酵过程中微生物主要呈现出稳定的循环，这是长期工艺中对微生物的驯化的结果。

倪峥飞等[7]对镇江香醋中微生物的主要功能做了研究，所采用的技术为生物强化技术，发现醋酸菌能够在一定程度上能够加快乙酸的生成速度，使醋醅成熟时间极大缩短，乳酸菌则能够使乳酸的含量升高，对于改善醋的风味物质是非常重要的。

弓晓艳等[8]以山西陈醋的酿造为研究对象，对酿造过程中各阶段的可以培养微生物的微生物种类及其变化规律做了研究，研究发现，山西老陈醋在酒化阶段的酵母菌主要有毕赤酵母菌属、德克酵母菌属、酒香酵母菌属等，产酸发酵阶段的产酸功能菌主要为植物乳杆菌属和巴斯德醋酸杆菌属。

山西老陈醋酿造过程中的微生物的变化呈现出一定的规律，在酒化阶段，以酵母菌和细菌为主导的菌属，在数量上变化比较大，呈现出先增加后减少的变化趋势，产生酒精的量持续增加；

在酸化阶段，主要以醋酸细菌属为主导，其他菌群数量较少，并且，所有菌群进入了残留期，该阶段的代谢产物较多。

裘纪莹等[9]研究了浙江玫瑰醋醋酿造过程中微生物的多样性，研究发现，整个发酵中，微生物呈现出由复杂到简单的变化，并且各个阶段都有着明显的差异。

2.1.1.2液态发酵工艺

传统式的液态发酵技术是与如今液态深层发酵技术是不同的，传统液态发酵通常采用了自然接种的方式，酿造工程中的微生物无法得到合理控制，种类十分复杂。

意大利传统香醋、日本米醋等，就是利用传统的自然接种的方式酿造的，生产过程主要靠代代相传的经验来控制的，这样使得不同的食醋间微生物多样性差异很大，而各种食醋的独特风味通常都来自这些经长期经验驯化的微生物。

现在，科学工作者研究液态发酵，主要从酵母菌群及醋酸菌群着手研究。

意大利香脂醋，一种意大利著名的传统发酵调味品，在酿造时，风味菌主要是醋酸菌，但是，醋酸菌培养困难，采用传统培养技术无法对其实现培养、检测变化等研究。

2.1.2食醋中主要微生物功能的研究

2.1.2.1霉菌

在酿造食醋的过程中，霉菌是其中一种不可或缺的微生物，它能产生催化多种反应的酶，能使蛋白质、脂类、淀粉等物质催化分解，生成氨基酸、多肽、葡萄糖这些小分子物质，有利于更近一步的转化。

对于发酵食品的生产，曲霉菌属是应用最广的菌属之一，其中米曲霉用更为途广泛，常被用于生产食醋、酒、酱油等，黑曲霉也常常用于葡萄糖淀粉酶的生产中。

研究发现，麦芽糖可以很好地用于诱导曲霉菌分泌水解酶，很好地利用麦芽糖的诱导与调控作用将对发酵生产极为重要。

NOVAKS等[10]研究了麦芽糖对酿酒酵母的调控机制，结果发现，麦芽糖的代谢调控需要有MAL基因调控位点，在此基础上，日本人常用米曲霉生产调味品，研究发现，米曲霉分泌酶的量在很大程度上影响到发酵的效果。

科学工作者研究发现了控制分泌细胞水解酶的基因，该基因在固态发酵中能很好地表达，在液态发酵中却不能很好地表达。

研究发现，传统发酵工程中搅拌、降温等对高效生产十分重要，这对于曲霉的高效生长代谢至关重要。

2.1.2.2酵母菌

食醋发酵过程中，在原料酒化，即发酵成酒精的阶段，酵母菌起到了至关重要的作用，它能够使单糖转化为二氧化碳和酒精，在进一步转化成为醋酸的阶段，酵母菌也逐渐降解，同时把大量的营养物质被释放到原料中，被其他微生物利用。

酵母菌在整个发酵过程中有以下三个方面的作用，一是将糖分解转化为乙醇，二是在发酵过程中产生大量的风味物质，三是对原料物质进行物理化学转化。

在食醋中，乙醇含量的高低对酵母菌和醋酸菌的含量多少有一定的影响，比如，高浓度的酒精抑制了醋酸菌的增殖，同时，原料中氧气、糖分对酵母菌生长繁殖及代谢产酒精的能力有影响。

2.1.2.3醋酸菌

对于食醋的生产，除了酵母菌，醋酸菌是又一大重要的菌株，工业生产食醋时常用醋杆菌属（Acetobacter）和葡糖醋杆菌属（Gluconacetobactor）的醋酸菌作为菌种，这是因为这两个菌属具有较强的耐醋酸性。

而醋酸菌主要的作用是氧化糖和乙醇，能将酒精进一步氧化成醋酸，并且还能生成一定量的有机酸。

醋酸菌属于细菌域、变形菌门、变形菌纲、红螺菌目、醋杆菌科。

科学工作者对醋酸菌的研究对在于耐酸性的功能方面，研究发现，醋杆菌属（Acetobacter）比葡糖醋杆菌属（Gluconacetobactor）更具有耐酸性，原因在于醋杆菌属（Acetobacter）脱氢酶活性一般在高浓度的醋酸中要比葡糖醋杆菌属（Gluconacetobactor）更加稳定。

醋酸的通化作用与醋化醋杆菌（Acetobacteraceti）中负责编码柠檬酸合成酶的基因有关，一种是aarA基因，另一种是aarC基因，而顺乌头酸酶表达的增强会促使醋酸耐受性的提高。

醋酸耐受性蛋白aarA是琥珀酰CoA、乙酰CoA的转移酶，可以将琥珀酰CoA与醋酸转化为琥珀酸与乙酰CoA，这使醋酸即使不经过底物水平磷酸化也能被很好的消耗掉。

SAKURALK等[11]对醋化醋杆菌在不同碳源中的转录响应的机制做了相应的研究，分析了乙醇、酸、糖等不同的碳源中生长细胞转录的特点，所利用的技术是基因芯片技术。

研究发现，A.aceti细胞在不同的生长条件下，随着呼吸系统成分的改变能量节约率也做相应的调整。

2.1.2.4其他微生物

在食醋的发酵过程中，有些微生物作为功能性物质的生产者，对食醋的风味及其功能有重要的作用。

如乳酸菌、芽孢杆菌等对食醋的风味也有着积极的影响。

食醋中，通常含有一些不挥发的乳酸，这种乳酸通常是一类重要的益生菌，具有改善人体免疫系统的作用，同时可以改变食醋的风味，缓解醋酸带来的刺激性酸味，使得食醋口感更佳。

这种乳酸是由乳酸杆菌产生的。

芽孢杆菌通过三羧酸循环产生有机酸，这种有机酸也可以缓解食醋的酸味，同时带来独特的风味，是一类好氧菌。

除此之外，芽孢杆菌还可以产生一种高活性的蛋白酶，这种蛋白酶可以使一些蛋白质水解生成氨基酸，这些氨基酸对食醋的风味以及颜色起着十分重要的作用。

2.2食醋酿造过程中微生物多样性研究方法进展

2.2.1传统微生物培养方法

传统的微生物分离培养方法常用并且易于操作，主要是将要培养的微生物接种到已经配置好的有利于其生长繁殖的培养基中，过一定的时间后，通过细胞学形态的观察、菌落计数、生理生化特性等方面的鉴定来分析鉴定微生物的数量、种类。

然而，自然界中仅有不到1%的微生物群可以培养[12]，从而人们对微生物认识存在局限性。

我们知道，微生物实际能够生存的自然环境是与制定的培养基是有偏差的，这也是局限过去人们对微生物分析研究的一个方面，因此，人们开始寻求更科学的方法或技术，结合传统的培养方法，使人们对食醋发酵中微生物多样性的研究更加方便、科学。

2.2.2脂肪酸甲酯（FAME）分析法/磷脂脂肪酸（PLFA）分析法

我们知道，磷脂是其中一种细胞膜的重要组成成分，而构成磷脂的脂肪酸结构上具有多样性并且有生物特异性等特点，从而可以用作标记物[13]，用来分析提取的磷脂脂肪酸的含量的多少和组成结构，在适当程度上能反映出微生物的数量多少以及微生物的群落组成。

FAME/PLFA分析法就是以此为基础研究得来的，是一种在细胞组分水平研究微生物的方法[14]。

该方法的主要特点是能够对微生物群落做定性性的研究，而且操作方法简单、技术含量要求低、成本低廉，是一种比较可靠、快捷的检测方法。

然而，该方法也存在一定的局限性，不是所有的脂肪酸都够能与其特征微生物相对应，而且脂肪酸的含量受环境条件的影响变化较大；

其次，不同的微生物脂肪酸可能出现重叠的情况，对于一些较远的微生物的区分和鉴定任然有一定的困难。

2.2.3克隆文库分析法

建立克隆文库之前，首先要从样品中提取微生物的总的DNA，然后对目标微生物总的DNA进行PCR扩增，扩增应用的引物是已经设计好。

要选择适合的克隆载体与PCR产物连接，然后转化至感受态的细胞中，用得到的这种转化子建成克隆文库。

将数据库中已有的数据与文库中的序列进行比对，就可得到与文库中序列相对应的微生物的信息。

许伟等[15]对镇江香醋中微生物的16SrRNA的一些阳性克隆子进行测序时用的就是该分析法，发现该醋中除了含有丰富的乳酸菌和醋酸菌外，还含有根瘤菌属（Sinorhizobium）、肠杆菌属（Enterobacter）、葡萄糖醋杆菌属（Gluconacetobacter）等其他微生物。

克隆文库分析法的优点是，避免了传统的培养分析方法带来的对微生物认识的局限性。

2.2.4遗传指纹图谱分析法

该方法利用的原理是，采用电泳的方法对代表微生物群落结构的核酸分子进行电泳分离，不同的核酸分子的迁移速度以及迁移行为不同，应用这些特征来构建该群落特异的遗传指纹图谱，利用遗传指纹图谱可以反映不同微生物在DNA水平上的差异，揭示了微生物的遗传多样性，也可以利用该方法，从遗传指纹图谱中还可分析出微生物个体随时间迁移的动态变化。

2.2.5DGGE/TGGE分析法

DGGE/TGGE技术，全名变性/温度梯度凝胶电泳技术，是利用聚丙烯酰胺在凝胶中的温度梯度或者变性剂梯度的分离片段大小相同而碱基组成不同的PCR的产物。

在理论上，DGGE/TGGE技术甚至能分辨出一个碱基差别的DNA序列。

ChenTingtao等[16]应用该技术对豉制曲中的菌群变化做了深入分析研究，监测了各时期细菌、杆菌、真菌的变化。

该技术的缺点是仅能分析500bp以下的DNA片段，对比较弱势的菌群检测较困难。

2.2.6单链构象多态性技术

我们知道，DNA单链当碱基发生变化时，会使DNA单链的空间构象发生变化。

通过对非变性的聚丙烯酰胺的凝胶物质电泳，可以使不同的DNA单链分开。

张锐等[17]采用单链构象的多态性技术来确定榨菜在低浓度盐的腌制过程中各个阶段的优势菌群。

该技术能检测出由碱基突变引起的基因变异，优点是引物普通，操作简单，设备要求低。

3传统食醋酿造工艺（中国四大名醋的酿造工艺）

3.1山西老陈醋

山西老陈醋以高粱为主要原料，选用大麦、豌豆制成的大曲做糖化发酵剂，常常用的辅料是麸皮、谷糠、稻壳等，经过固态发酵或者稀醪酒精发酵，然后经过固态醋酸发酵、熏醅、淋醋、陈酿等工序酿制而成，具体流程如图1所示：

图1.山西老陈醋发酵工艺流程

3.2镇江香醋

镇江香醋的主要原料恒顺地产优质糯米，采用传统复式糖化酒精发酵，