食品安全SOP水质取样检验规范Word文档格式.docx
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大肠菌群
MPN/100ml
余氯
标准
6.5-8.5
≤150
≤450
≤3
≤1
≤100
不得检出
0.05-0.3
注：
其中硬度、碱度均以CaCO3计
6.1.3工艺水水质必须达到以下要求：
浊度
电导率
μs/cm
≤75
≤200
≤0.1
其中硬度、碱度均以CaCO3计
6.1.4取样时间与频率：
a.生产过程中，原水（井水或自来水）理化指标检测取样检测频率1次/12小时
b.生产过程中，工艺水理化指标检测取样检测频率1次/2小时
c.井水、工艺水微生物检测取样检测频率1次/1周
6.2水质测定
6.2.1水样微生物检验
6.2.1.1取样前的准备工作
将带塞子的三角瓶（具体视取样点个数）放于高压灭菌锅内121℃灭菌30分钟后备用，再取一定数量的棉球（具体视取样点个数）放于塑料烧杯中，加入75%乙醇液至棉球全部浸没，浸泡30分钟以上（即酒精棉球）待用，同时将取样用的镊子（取样端）也放入上述75%乙醇液中浸泡消毒备用。
6.2.1.2取样
打开取样阀（开启度根据取样适合为宜）排水3～5分钟,取样前先用消毒后的镊子取一酒精棉球将取样口仔细擦试，再换取一酒精棉球将取样口重新擦试，然后用灭菌后的三角瓶取水样200ml左右，迅速盖上塞子，注意操作过程中手不要接触到瓶口内侧和塞子下端，以免造成操作上的污染，同时清理用过的酒精棉球,将样品带回微生物室待检。
6.2.1.3样品的处理
取回的水样必须在2小时内进行菌落总数和大肠菌群的检验，以免过长时间的放置造成检验结果的不准。
6.2.1.4菌落总数（平皿计数法）
培养基与试剂:
营养琼脂
成分（g/L）：
蛋白胨10g氯化钠5g牛肉膏粉3g琼脂15g
配制：
称取本品33克，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用；
仪器
高压蒸汽灭菌器、干热灭菌箱、培养箱36±
1℃、电炉、天平、冰箱、放大镜、pH计或精密pH试纸、灭菌试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管、采样瓶等。
检验步骤
以无菌操作方法用灭菌刻度吸管吸取1ml充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，倾注约15ml已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。
每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。
待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36±
1℃培养箱内培养48h,进行菌落计数，即为水样1ml中的菌落总数。
菌落计数及报告方法
作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。
在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。
在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。
若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半平皿计数后乘2以代表全皿菌落数。
然后再求该稀释度的平均菌落数。
不同稀释度的选择及报告方法
首先选择平均菌落数在30-300之间者进行计算，若只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则讲该菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例1）。
若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间则视二者之比值来决定，若其比值小于2应报告两者的平均数（如表1中实例2）。
若大于2则报告其中稀释度较小的菌落总数（如表1中实例3）。
若等于2亦报告其中稀释度较小的菌落数（见表1中实例4）。
若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告（见表1中实例5）。
若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应以按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例6）。
若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则应以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例7）。
若所有稀释度的平板上均无菌落生长，则以未检出报告之。
如果所有平板上都有菌落密布，不要用“多不可计”报告，而应在稀释度最大的平板上，任意数其中2个拼版1cm2中的菌落数，除2求出每平方厘米内平均菌落数，乘以皿底面积63.6cm2，在乘其稀释倍数坐报告。
菌落计数的报告：
菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零也可用10的指数来表示（见表1“报告方式“栏）。
表1稀释度选择及菌落总数报告方式
实例
不同稀释度的平均菌落数
两个稀释度菌落数之比
菌落总数（cfu/ml）
报告方式/（cfu/ml）
10-1
10-2
10-3
1
1365
164
20
—
16400
16000或1.6×
104
2
2760
295
46
1.6
37750
38000或3.8×
3
2890
271
60
2.2
27100
27000或2.7×
4
150
30
8
1500
1500或1.5×
103
5
多不可计
1650
513
513000
510000或5.1×
105
6
27
11
270
270或2.7×
102
7
305
12
30500
31000或3.1×
6.2.1.5总大肠菌群（多管发酵法）
培养基与试剂
乳糖胆盐发酵培养基
成分（g/l）：
蛋白胨（20g）、乳糖（10g）、猪胆盐（5g）、溴甲酚紫（0.01g）；
配制方法：
称取乳糖胆盐发酵培养基35g，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装于有倒立发酵管的试管中，115℃高压灭菌15min，备用；
伊红美蓝琼脂
成分：
胨（10g）、牛肉浸粉（3g）、氯化钠（5g）、曙红钠（0.4g）、亚甲蓝（0.065g）、乳糖（10g）、琼脂（14g）；
称取本品42.5克，加入1000ML蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌,20min后备用；
革兰氏染色液
结晶紫染色液
A成分：
a结晶紫1g
b乙醇（95%，体积分数）20mL
c草酸铵水溶液（10g/L）80mL
B制法：
将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
结晶紫不可用龙胆紫代替，前者是纯品，后者不是单一成分，易出现假阳性。
结晶紫溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。
革兰氏碘液
a碘1g
b碘化钾2g
c蒸馏水300Ml
将碘和碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水。
脱色剂
乙醇（95%，体积分数）。
沙黄复染液
a沙黄0.25g
b乙醇（95%，体积分数）10mL
c蒸馏水90mL
将沙黄溶解于乙醇中，待完全溶解后加入蒸馏水。
染色法
A将培养18h-24h的培养物涂片。
B将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min,水洗。
C滴加革兰氏碘液，作用1min,水洗。
D滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止，约30s水洗。
E滴加复染剂，复染1min,水洗，待干，镜检。
培养箱：
36±
1℃、冰箱：
0℃-4℃、天平、显微镜、平皿：
直径为90mm、试管、分度吸管：
1mL,10mL、锥形瓶、小导管、载玻片。
检测步骤
乳糖发酵试验
取10mL水样接种到10mL双料乳糖蛋白冻培养液中，取1mL水样接种到10mL单料乳糖蛋白冻培养液中，另取1mL水样注入到9mL灭菌生理盐水中，混匀后吸取1mL（即0.1mL水样）注入到10mL单料乳糖蛋白胨营养液中，每一种稀释度接种5管。
检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种1,0.1,0.01mL甚至0.1,0.0.1,0.001mL每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。
接种1mL以下水样时，必须作10倍递增稀释后，取1mL接种，每递增稀释一次，换用一支1mL灭菌刻度吸管。
将接种管置36℃±
1℃培养箱内，培养24h±
2h,如所有乳糖蛋白胨培养管都不产气产酸，则可报告为大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。
分离培养
将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于36℃±
1℃培养箱内培养18h-24h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验。
深紫黑色、具有金属光泽的菌落；
紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；
淡紫红色、中心较深的菌落。
证实试验
经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽胞杆菌，同时接种乳糖蛋白冻培养液，置36℃±
1℃培养箱内培养24h±
2h,有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。
结果报告
根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN（mostprobablenumber,最可能数）检索表，报告每100mL水样中的总大肠菌群最可能数（MPN）值。
5管法结果见表2,15管法结果见表3.稀释样品查表后所得结果应乘稀释倍数。
如所有乳糖发酵管均阴性时，可报告总大肠菌群未检出。
表2用5份10mL水样时各种阳性和阴性结果组合时的最可能数（MPN）
5个10mL管中阳性管数
最可能数（MPN）
＜2.2
5.1
9.2
16.0
＞16
表3总大肠菌群MPN检索表
（总接种量55.5Ml,其中5份10mL水样，5份1mL水样，5份0.1mL水样）
接种量/mL
总大肠菌群/
（MPN/100Ml）
（MPN/100Ml）\
10
0.1
＜2
9
14
15
13
17
19
22
24
接种量/mL
16
23
31
21
28
32
25
36
40
29
26
37
41
45
43
58
76
95
33
63
84
110
42
130
49
70
94
38
120
44
50
180
79
39
140
52
210
59
250
34
170
47
220
54
280
62
350
69
430
240
48
56
540
64
920
72
1600
81
＞160
6.2.1.6耐热大肠菌群
EC培养基
胰蛋白胨（20g）、三号胆盐（1.5g）、乳糖（5g）、硫酸氢二钾（4g）、氯化钠（5g）、磷酸二氢钾（1.5g）；
称取本品37克，加入1000ML蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装到有玻璃小导管的试管中，每管8ml，121℃高压灭菌15min后备用；
伊红美蓝琼脂（同上）
恒温水浴：
44.5℃±
0.5℃或隔水式恒温培养箱、其他同总大肠菌群多管发酵法
自总大肠菌群乳糖发酵试验中的阳性管（产酸产气）中取1滴转种于EC培养基中，置于44.5℃水浴箱或隔水式恒温培养箱内（水浴箱的水面应高于试管中培养基液面），培养24h±
2h，如所有管均不产气，则可报告为阴性，如有产气者，则转种于伊红美蓝琼脂平板上，置44.5℃培养18h-24h,凡平板上有典型菌落者，则证实为耐热大肠菌群阳性。
如检测未经氯化消毒的水，且只想检测耐热大肠菌群时，或调查水源水的耐热大肠菌群污染时，可用直接多管耐热大肠菌群方法，即在第一步乳糖发酵试验时按总大肠菌群接种乳糖胆盐发酵培养基在44.5℃±
0.5℃水浴中培养。
根据证实为耐热大肠菌群的阳性管数，查最可能数（MPN）检索表，报告每1000mL水样中耐热大肠菌群的最可能数（MPN）值。
6.2.2水质总碱度的测定
6.2.2.1原理：
用标准浓度的盐酸溶液滴定水样，用甲基橙做指示剂，根据指示剂颜色的变化判断终点。
根据滴定水样所消耗的标准浓度的盐酸溶液用量，即可计算出水样的总碱度。
6.2.2.2术语：
是指水中能够接受〔H+〕离子即与强酸发生中和反应的物质总量。
6.2.2.3仪器
50mL移液管
25mL酸式滴定管
250mL锥形瓶
6.2.2.4试剂
0．5%甲基橙指示剂
0.05mol/L盐酸标准溶液
甲基橙指示剂（5g/L）
硫代硫酸钠溶液（0.1mol/L）
盐酸标准滴定溶液（0.02mol/L）
6.2.2.5步骤
6.2.2.5.1水样中余氯可破坏指示剂，当水样中含有余氯时，需要加入1-2滴0.1mol/L硫代硫酸钠溶液消除。
6.2.2.5.2移取50.00mL水样于250mL锥形瓶中，加入4滴甲基橙指示剂，摇匀。
用盐酸标准溶液滴定至溶液由桔黄色刚刚变为桔红色为止。
记录盐酸标准溶液用量V1。
6.2.2.5.3水样中总碱度的计算
总碱度ρ（以CaCO3计，mg/L）=[C（HCL）×
0.05005×
V1]/V×
106
式中：
ρ（CaCO3）——水样的总碱度，mg/L；
c（HCl）——盐酸标准溶液的浓度，mol/L；
V1——滴定水样消耗标准盐酸溶液的体积，mL；
V——所取水样的体积，mL；
0.05005——与1.00mL盐酸标准滴定溶液［c（HCl）=1.000mol/L］相当的，以克表示的碳酸钙（1/2CaCO3）的质量。
6.2.3水质总硬度的测定
6.2.3.1原理:
水样中的钙、镁离子与铬黑T指示剂形成紫红色螯合物，这些螯合物的不稳定常数大于乙二胺四乙酸钙和镁螯合物不稳定常数。
当PH=10时，乙二胺四乙酸二钠先与钙离子，再与镁离子形成螯合物，滴定至终点时，溶液呈现出铬黑T指示剂的纯蓝色。
6.2.3.2总硬度术语：
水中钙、镁离子和其他金属离子的总含量，因其他金属离子的含量很少，一般情况下，总硬度表示钙、镁离子的含量。
6.2.3.3仪器
6.2.3.4试剂
铬黑T指示剂（0.5%）
缓冲溶液（pH=10）
乙二胺四乙酸二钠标准滴定溶液（0.01
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