慢病毒包装浓缩纯化滴度实验步骤Word文档下载推荐.docx
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5.放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
6.第二天观察细胞存活率。
倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。
二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定
1.所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下
5'
-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3'
（forwardprimer）,
-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3'
（reverseprimer）and
-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3'
（probe）
2.TaqManUniversalPCRMasterMix（AppliedBiosystems，cat.no.4304437）
3.TaqManDNATemplateReagentKit（AppliedBiosystems，cat.no.401970）
4.TaqManRNasePcontrolreagent（AppliedBiosystems，cat.no.4316844）
用于包装的293T细胞的培养
用于包装的293T细胞（ATCCNo.CRL-11268）必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。
任何时候细胞汇合率都不准达到100%。
慢病毒的包装
1.预先准备3个T150瓶的293T细胞，培养基为DMEM+10%FBS，1%Glutamax，1%青霉素-链霉素。
2.将细胞分到12分到12个T150瓶中，每瓶的细胞密度是8×
106个。
3.第二天，镜下检查细胞。
细胞融合度应大致为30-40%，分布均匀。
4.转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入20ml的Opti-MEM培养基，将细胞送回培养箱。
5.取两支无菌的50ml离心管，其中一支中加入252μgpNL-EGFP/CMV/WPREDU3载体质粒，168μgpCD/NL-BH*DDD包装质粒和84μgpLTR-G质粒，用Opti-MEM培养基补齐到18ml。
另一支中加入500μlTrans-EZ溶液和17.5mlOpti-MEM培养基，用电动移液器轻轻混匀。
将Trans-EZ稀释液滴加到质粒管中，边加边轻轻晃匀。
关键步骤：
推荐使用Qiagen质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。
6.室温孵育20分钟，使DNA和Trans-EZ充分结合形成转染复合体。
7.取1支5ml的移液管，将得到的DNA-Trans-EZ复合体均匀滴加入到细胞培养板中，每板3ml。
来回晃动培养板，混匀后放回到5%二氧化碳培养箱。
每一皿细胞培养盘不要超过6盘。
8.6小时后，移去细胞上清，更换为17ml的DMEM完全培养基。
9.转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接近60-80%。
如果所转染质粒带有GFP荧光，那么这时候可以看到大于95%的细胞都是带有荧光的。
10.将细胞送回培养箱继续培养2天（36-48小时）。
在这个过程中，细胞会逐渐融合形成多核体，大多数的细胞依然贴壁。
11.收集所有的上清，分装到50ml离心管中。
12.4℃，500g离心10分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片。
13.总的上清约为204ml，用250-ml0.45μmPVDF过滤装置过滤。
如果发现滤膜被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新的滤器。
慢病毒的浓缩与纯化
方法一超速离心沉淀法
1.取6个Ultra-clearSW28离心管，用70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟。
2.每个Ultra-clearSW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液。
3.取一支10ml的移液管，吸取12ml20%的蔗糖溶液。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4ml。
同样地，将剩下8ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。
4.用PBS调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g。
5.按次序将所有6个离心管放入BeckmanSW28超速离心转头中。
7.小心将管子从转头中取出。
倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干。
吸掉剩余的液滴。
在管底应当有可见的沉淀。
8.每管中加入100ml不含钙和镁的PBS洗下沉淀。
9.将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
10.在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
11.4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
12.用200μl移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
避免产生泡沫。
将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中。
13.集中后的病毒悬液分装成50μl每份，保存在成品管中。
用碎干冰速冻后储存在-80℃。
方法二PEG-8000浓缩法
PEG（聚乙二醇）是高分子聚合物，具有高亲水性，在溶液中会吸收大量水分，减少病毒之间的距离，使病毒与病毒能够很容易的聚合在一起，病毒的相对浓度提高，达到沉淀浓缩的目的。
5XPEG8000+NaCl配制称取NaCl8.766g;
PEG800050g溶解在200mlMilli-Q纯水中；
121摄氏度30min湿热灭绝30min；
保存在4℃。
1.使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；
3.每20～30min混合一次，共进行3-5次；
4.4度放置过夜；
5.4度，4000g，离心20min；
6.吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；
7.加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；
8.集中后的病毒悬液分装成50μl每份，保存在成品管中。
用碎干冰速冻后储存在-80℃
病毒滴度的测定
稀释计数法
滴度单位：
TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。
”TU”为”transducingunits”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
第一天细胞准备
将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×
105/ml，加入96孔板，100μl/孔，为每个病毒准备10个孔。
放入37℃，5%CO2培养箱中培养。
第二天加病毒
在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。
稀释方法如下：
每种病毒准备10个1.5mlEP管，每管加入90μl培养液，往第一个管中加入10μl病毒原液，混匀后，吸取10μl加入第二个管混匀。
依此类推，做十个稀释度（10~10-8）。
吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。
并做好标记。
第三天追加培养液
在每个孔再加入100μl完全培养液，利于细胞的生长。
第五天观察结果并计算滴度
在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。
假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y*10）*1000/2/X孔的病毒液的含量（μl）。
定量PCR法
病毒感染1天前，取6孔板接种HOS细胞。
每孔细胞为5×
104个。
接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N。
弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5μg/mlpolybrene的新鲜培养基。
将浓缩病毒用培养基稀释200倍，也就是取1μl病毒加入到199μl的培养基中。
在3个培养孔中分别加入0.5μl，5μl和50μl的稀释病毒。
感染开始后20小时，除去培养上清，换为500μl含DNaseI（TakaraMirusBio，终浓度为10U/ml）的新鲜培养基。
在37℃消化15分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA。
然后换为2ml正常的培养基，继续培养48小时。
用0.5ml0.25%胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃放置1分钟。
用培养基吹洗下，离心收集细胞。
按照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA。
每个样品管中加入200μl洗脱液洗下DNA。
用DNA定量试剂盒定量（Bio-Rad）。
基因组DNA可以稳定保存在-20℃至少2个月。
准备PCR所需的试剂和样品。
为病毒序列检测引物配总管Ⅰ：
2×
TaqManMasterMix
25μl×
n
Forwardprimer（100pmolml-1）
0.1μl×
n
Reverseprimer（100pmolml-1）
Probe（100pmolml-1）
H2O
19.7μl×
n=numberofreactions.例如：
总反应数为40，将1ml2×
TaqManUniversalPCRMasterMix，4μlforwardprimer，4μlreverseprimer，4μlprobe和788μlH2O混和。
震荡后放在冰上。
为人基因组序列检测引物配总管Ⅱ：
10×
RNasePprimer/probemix
2.5μl×
17.5μl×
TaqManUniversalPCRMasterMix，100μl10×
RNasePprimer/probemix和700μlH2O混和。
在预冷的96孔PCR板上完成PCR体系建立。
从总管Ⅰ中各取45μl加入到A-D各行的孔中，从总管Ⅱ中各取45μl加入到E-G各行的孔中。
分别取5μl质粒标准品和待测样品基因组DNA加入到A-D行中，每个样品重复1次。
另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照（no-templatecontrol）。
分别取5μl基因组标准品和待测样品基因组DNA加入到E-G行中，每个样品重复1次。
所使用定量PCR仪为ABIPRISM7000定量系统。
循环条件设定为：
50℃2分钟，95℃10分钟，然后是95℃15秒，60℃1分钟的40个循环。
数据分析：
测得的DNA样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。
滴度（integrationunitsperml，IUml-1）的计算公式如下：
IUml-1=（C×
N×
D×
1000）/V
其中：
C=平均每基因组整合的病毒拷贝数
N=感染时细胞的数目（约为1×
105）
D=病毒载体的稀释倍数
V=加入的稀释病毒的体积数
慢病毒的储存与稀释
慢病毒的储存
1.病毒的运输采用干冰保温，收到病毒液后若几天内用于实验，可于4℃保存（于一周内用完）。
2.若病毒量较大，需长期保存。
则根据每次实验用量分装后放于-80℃冰箱。
一般病毒可以放于-80℃约12个月以上，但若超过6个月后使用，请重新检测病毒滴度。
3.避免反复冻融，否则会降低病毒滴度。
每次冻融会降低病毒滴度10%。
慢病毒的稀释
需要稀释病毒时，将病毒取出后置于冰上融解，用细胞培养用D-Hank'
s、PBS或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后4℃保存，并尽快用于实验（于一周内用完）。
慢病毒在细胞水平的使用
什么是MOI？
“MOI”为”multiplicityofinfection”的缩写，中文为“感染复数”或“复感染指数”，含义为感染时病毒和细胞数量的比值，即平均每个细胞感染的病毒活性单位数（TUnumber/cell）。
在实验中将某种细胞感染达到80%时的MOI定义为这种细胞的MOI。
MOI与整合事件以及目的基因的表达相关。
一定范围内，表达水平和MOI呈正相关。
MOI取决于多种因素，如细胞状态，目的基因的大小与性质，细胞的感染效率等。
所以，实验前需查阅相关文献，确定慢病毒对目的细胞的亲嗜性、MOI以及在体（invivo）注射所需病毒量。
若无文献支持，可以通过预实验得到合适的MOI。
实际上，即使有文献支持，但由于所用细胞代数、细胞状态以及目的基因的差异，实际的MOI和文献报道也会不同，所以要安排预实验以确定所需MOI以及病毒对细胞生长的影响。
目的细胞感染预实验及实验体系的放大
实验目的：
确定细胞感染所需的MOI，以及是否需要添加感染增强剂Polybrene。
实验材料：
96孔板，1.5mlEP管，长势良好的目的细胞一瓶，已知滴度的慢病毒溶液，Polybrene（10mg/ml），目的细胞培养基等。
第一天：
细胞准备
将长势良好的目的细胞接种到96板，消化好细胞（悬浮细胞不需要消化，直接离心收集细胞后加新鲜培养基重悬即可）后把浓度调为3×
104~5×
104个/ml，按90μl/孔加入。
接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染时细胞汇合率介于30~50%之间。
第二天：
病毒感染
感染实验分两组，一组直接添加病毒液，一组同时添加Polybrene。
病毒稀释方法同病毒滴度测定时方法，10倍倍比稀释，共三个稀释度，MOI值依次为100，10和1（细胞经过一天的生长数量约为1×
104个/孔，对应的病毒数量为1×
106TU、1×
105TU和1×
104TU）。
每个MOI值加两个孔，取出一组加入感染增强剂，比例为1：
2000，终浓度为5μg/ml。
换液
感染实验同一天，8-12小时后，弃去上清液，更换为新鲜培养基，100μl/孔。
第五天：
观察荧光表达情况
在倒置荧光显微镜下观察荧光，估计慢病毒感染目的细胞的效率。
对于生长缓慢的细胞，可以适当推迟观察的时间，中途可以传代和换液，以保持细胞良好的生长状态。
通过细胞感染的效果，确认目的细胞的感染MOI以及是否需要添加Polybrene。
对于因目的基因较大，载体无法携带标志基因的，可以通过定量PCR来检测目的基因的表达来评估感染效率。
实验体系的放大
正式实验时，由于细胞数量较大，所需的病毒用量也需相应增大。
放大的原则是保持细胞的密度不变，将培养基体积，病毒量按实际细胞数与预实验细胞数的比例放大。
即使这样，正式实验时由于体系的改变，加上预实验的MOI值设置跨度较大，可进行对MOI的再次优化。
MOI的设置值为预实验最佳值0.5倍，1倍和1.5倍或自己设置合理的数值。
表1.病毒感染细胞所用培养基体积和病毒量参考值
单孔底面积（cm2）
正常培养体积（μl）
感染时体积（μl）
MOI=1病毒量（TU）
MOI=10病毒量（TU）
MOI=100病毒量（TU
96孔板
0.3
100
1×
104
48孔板
0.6
200
105
106
24孔板
1.9
500
6×
12孔板
3.8
1000
107
6孔板
9.5
2000
T25瓶
25
5000
2500
5×
*表中可培养板底参数数值为CORNING公司产品参数。
*对于孔面积较小的培养板，由于溶液张力的关系，培养基体积太少会导致病毒的分布不均与，所以不做减半处理。
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