天麻的活性成分研究及其质量评价文档格式.docx

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乌天麻也称乌杆天麻、铁天麻，花茎灰褐色，带有明显的白色纵条斑。

花黄绿色，果实有棱、间隔淡黄绿与褐色条纹，为上粗下细的倒圆锥形。

块茎短柱形，前端有明显的肩，淡黄色，最大者可达1000余克，含水量71%左右。

我国东北长白山区有乌天麻生长，南方主要分布在海拔1500米以上的高山区，在高山区栽培的主要是乌杆天麻。

除上述两种天麻外，红杆天麻分布地区常混生少数绿杆天麻，花茎黄绿至蓝绿色，花黄色，果卵圆形绿色，块茎圆锥形，含水量介于红杆与乌杆之间，是较稀有的栽培天麻。

我国是世界上野生天麻分布的主要国家之一，主产于四川、云南、陕西、安徽、河南、辽宁、吉林、湖北、湖南、贵州、甘肃、西藏及台湾等地。

二、天麻的活性成分

1.总成分

　　1958年刘星楷等报道，从一麻块茎中分出针状结晶，经鉴定为香荚兰醇（Vanillyalcohol）[4]，但其它学者进一步研究后未发现这一成分。

1979年周俊等发现了天麻中含量较高的一个主要成分是1种新的酚甙，命名为天麻素（Gastrodin）,即对羟基苯甲醇－β－D葡萄吡喃糖甙（P－Hdroxyethylphenyl-B-D-glucopyranoside）[5]。

　　1981年TaguchiH等报道1种新的甙类称为Grastrodioside,为一种双（4羟苄基醚、单氧－B－D吡喃葡萄糖（Bis（4-Hydroxybenzyl）ethermono-B－lucopyranoside）以及2种首次在天然产物中发现的化学成分：

4－（4－羟苄基氧）苄基甲醚［4－（4－Hydroxybenzyloy）methylether］和双（4－羟苄基）醚Bis（4-hydroxybenzyl）ether）[6],后者周俊等已有报道。

同时还分离到另一种酚性化合物，4－羟基苄基甲醚（p-Hydroxybenzylmethylether）[7]。

胡忠等从天麻球茎中分离并纯化卫种抗真菌蛋白（Gasrtodinantifungalprotein）简称GAFP,每1kg鲜球茎中可分得GAFP约20mg,用SDS—PAGE和凝胶过滤层析测得该蛋白为单多肽链，分子量14．OKD，用离子交换结合法测得等电点为8．1，是一种碱性蛋白，富含天冬酰胺（25mol／mol蛋白）、甘氨酸、丙氨酸和亮氨酸，但未检出蛋氨酸、脯氨酸和半胱氨酸，紫外吸收入M＝278nm。

在天然状态下，GAFP与考马氏蓝试剂不发生显色反应，具这一性质的蛋白质文献中还未见报道[8]。

GAFP无几丁质酶和9—l，3—葡聚糖酶活性，表明GAFP并不属于消化真菌细胞壁的酶类。

天麻是真菌寄生植物，不含叶绿素，蜜环菌侵入初生球茎并在皮层中被消化，营养物质供次生球茎生长的需要，杨增明等从初生球茎中分离并纯化了几丁质酶和9—l，3—葡聚糖酶，分子量各为31．5KD和94KD，得率约为0．8和0．4mg／100g鲜重。

这两种酶对平板上培养的木霉菌丝的生长均有抑制作用，被认为在天麻初生球茎消化蜜环菌菌丝过程中起重要作用。

除上述成分外，天麻块茎中还含—谷笛醇、胡萝卜甙、柠檬酸、棕搁酸、琥珀酸等。

微量元素以FG含量最高，F、Mn、Zn、1次之[9]。

2.天麻中多糖类化合物

胡梅清等从生产天麻注射液后的残渣中分得白色粉末状的天麻匀多糖，经检测本品不含酸性多糖和杂多糖，而是由葡萄糖分子组成的匀多糖[10]。

天麻中除己分得蔗糖外，又报道从天麻中分出三种杂多糖：

GE—I，GE—II，GE—III，均为白色粉末，元素分析不含氮，经纸上电泳和凝胶柱层析，证明为单一组分。

GE—I：

分子量3000；

GE—II：

3100，[a]＋17l。

；

GE—III：

22lO[a]＋162．96。

。

三种杂多糖经水解和纸色谱分析主要为葡萄糖组成，制备乙酰衍生物进行气相与已知单糖乙酰物比较和计算，结果得出三种多糖的组成及克分子比是：

GE—I组成是葡萄糖：

甘露糖：

木糖：

阿拉伯糖＝70：

1：

0．5：

0．3；

GE—II是葡萄糖：

甘露糖＝19：

1，GE—III是葡萄糖及微量甘露糖，三种多糖均具有细胞免疫活性[11]。

3.不同产地天麻有效成分含量的变化

周俊等报道了不同产地药用天麻和天麻属中少数品种中的9种酚性成分：

1）天麻索，2）对羟基苯甲醇，3）对羟基苯甲醛，4）3，4-二羟基苯甲醛，5）4，4-二羟基二苯基甲烷，6）4，4’-二经基二苄醚，7）对羟基乙基醚，8）4-乙氧甲苯基-4’-羟基醚，9）三[4-（9-D-葡萄吡喃糖基）-氧-节基]-柠檬酸酯[12]。

测试结果表明，东北道化和云南昭通的药用天麻所含酚性成分基本上是一致的；

原天麻中只检出l，2，3，其中2和3是酚性成分中结构最简单者，据测原天麻可能是天麻属中的原始类型，药用天麻可能是进化类型，并与形态比较的植物分类学观点很吻合。

河南省为全国天麻主产地之一，沙振方等采用HPLC方法检出18份天麻样品中天麻素含量。

结果表明这些样品中天麻素的含量为O．17—1．O%，平均含量为O．46%，其差别可能由干存放时间、加工炮制、采收季节、生长环境等的影响[13]。

王桂英对四川省5个产区购买的商品天麻采用薄层分光光度法测定天麻素、天麻贰元含量，按药典方法测定天麻成品中的水分含量，表明各地商品的质量有差别,生药等级并不能淮确地代表质量[14]。

4.不同栽培条件对天麻有效成分含量的影响

天麻在不同栽培条件下其有效成分有一定差异，曾有报道，用天麻注射液的含量测定方法，对室内家种天麻和野生品比较，以及不同海拔高度野生天麻质量比较，说明在平原、丘陵或室内培植天麻其有效成份并不低于野生品种[15]。

但用HPLC方法，测定贵州省野生与家种天麻中天麻素的含量，结果10份野生天麻中天麻素含量在0．5～1．0%之间，家种天麻天麻素含量则明显高于野生天麻[16]。

天麻人工栽培时培养蜜环菌一般多用小叶青岗等树种，为了扩大菌材的树种，曾研究了14种树种作为菌材使用。

有

（1）小叶育岗，

（2）法国梧桐，（3）乌柏，（4）槐树，（5）柳树，（6）桃树，（7），马尾松,（8）黄檀，（9）白毛杨，（10）桑树，（11）梢树，（12）沙梨，（12）枫香树，（14）枫杨。

结果以小叶青岗、枫杨、黄檀、法国梧桐、柳树为菌材栽培的天麻生长情况较好。

从薄层定性检查发现14种样品所含的成分未见差异，但天麻贰的含量有较大差异。

研究表明，多种树种可作菌材，并不限于小叶青岗。

5.不同采收期对天麻有效成分的影响

对不同采收期天麻中天麻贰的含量测定，结果表明不同收获期的天麻中天麻甙的百分含量有较大差别，7月份为0．93～O．03％，9月份为0．3l～O．0l％，l2月份为O.23～O．01％，其中以7月份采收的天麻甙含量最高为传统收获期（12月份）的3倍[17]。

对不同采挖期（11月至翌年6月，每月取样）家种和野生天麻中大麻素、天麻甙元进行比较研究发现，天麻以11月至翌年4月收获为好。

6.不同加工炮制方法对天麻中有效成分的影响

采用HPLC方法测定贵州省严的天麻中天麻素含量，凡新鲜天麻经过除去表皮（或因挖掘时损伤块茎），不论煮法或蒸法加工品，其天麻素含量均有降低，而原皮蒸法加工者含量一般较高，这与天麻素易溶于水有密切关系。

天麻经不同加工处理后天麻素和天麻甙元的含量，结果以煮法加工为好，煮5～10分钟为宜。

如用蒸法，应严格控制时间。

如鲜品不经杀酶处理，直接切片干燥，成品率及有效成分含量均较低。

天麻的加工炮制方法，除用水煮或蒸外，还有用于热炮制方法进行加工。

丁敖林曾对天麻的3种炮制方法（浸润法、干热法、蒸软法）进行了比较，采用分光光度法检测天麻经3种不同方法炮制后天麻素的含量。

认为干热法较其它两种方法为优，工艺简单，周期短，成品率高，天麻素含量不下降。

蒋礼年等曾对天麻不同切制方法进行了比较，并用分光光度法检测其天麻素的含量。

认为蒸切法较好，天麻素含量高[18]。

测定天麻不同加工方法和未经加工天麻中天麻素和甙元含量。

结果表明：

加工后天麻中天麻素含量显着高于末加工天麻中天麻素的含量，而甙元含量却显着低于未加工者。

三、天麻的质量评价

天麻的质量评价可以从真伪的鉴别和含量测定两个方面去考察。

目前，常用的鉴别方法有经验鉴别，显微鉴别，理化鉴别和薄层色谱法；

天麻素是天麻的主要成分，含量高达0.33～0.67％[19]，考察天麻的质量多以天麻素为指标，就目前来说其含量测定的方法一般为高效液相色谱法，反相高效液相色谱法，紫外分光光度法，薄层色谱法，薄层扫描以及二阶导数光谱法，其中以高效液相色谱法（HPLC）最为多见。

1.鉴别

1.1经验鉴别　由于天麻是与蜜环菌共生,所以天麻有如下主要特征:

块茎两端无根须,一端有从母体脱落遗留的圆脐痕,一端有红棕色至深棕色干芽苞称“鹦哥嘴＂。

鲜品体形呈长椭圆形,干后扁缩稍弯曲,表面黄白色或淡黄棕色,多纵行皱纹及由潜伏芽排列而成的横环纹和鞘状鳞片,有时可见附着的棕褐色蜜环菌丝;

质地坚实,断面平坦,半透明角质样,气味特异香,嚼之不粘牙,味甘微辛,春麻幼嫩,母麻有较大空腔。

常见的伪品有紫茉莉、大丽菊、马铃薯、多花黄精、羊角天麻、绿天麻、硬毛地笋、豆薯,它们虽有某些相似处,但不具有天麻的典型特征。

1.2显微鉴别　天麻块茎横切面最外层有残留的表皮,细胞呈切向延长,皮层为10数列多角形细胞,有草酸钙晶束。

中柱散在周韧型维管束,2至数个导管成群,薄壁细胞亦含针晶束。

粉末呈米黄色或淡黄棕色,薄壁细胞中可见充满长卵形、长椭圆形颗粒,草酸钙针晶多成束存在其中;

木化厚壁细胞呈多角形或类椭圆形,纹孔明显,或散在的类长方形厚壁细胞,纹孔不明显。

螺纹、网纹及环纹导管,含粘液质或黄棕色块状物。

1.3理化鉴别　取天麻粉末1ｇ,加水10ｍｌ,浸4ｈ,振摇过滤,滤液加碘试液2～4滴,呈紫红色或酒红色,加45%乙醇10ｍｌ,浸4ｈ过滤,滤液加硝酸汞试剂0.5ｍｌ,加热,溶液呈玫瑰红色,并发生黄色沉淀。

伪品试验与此不同。

1.4薄层色谱鉴别取样品粉末0.2ｇ,加70%乙醇1ｍｌ,振摇,放置4ｈ,取上清液点于硅胶Ｇ板上,点样基线距底边2.5cm,样点圆形,直径不超过3ｍｍ,点间距1.5～2ｃｍ。

以氯仿/甲醇（9︰1）为展开剂,展距18ｃｍ,用10%磷钼酸无水乙醇喷雾,于110℃烘烤5～10min,天麻苷显紫红色斑点,,天麻苷元显紫红色斑点[20]。

2.含量测定

2.1药典方法[21]

色谱条件与系统适应性试验：

用八（或十）烷基硅烷健合硅胶为填充剂；

甲醇－磷酸盐溶液（含磷酸二氢钾和磷酸氢二钠各为0.1mol/L）－水（1.5:

3:

95.5）为流动相；

检测波长为270nm。

理论板数按天麻素峰计算应不低于1500。

对照品溶液的制备：

精密称取天麻素对照品（80℃干燥1小时）25mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，（每1ml中含天麻素1mg）。

供试品溶液的制备：

精密称取经80℃干燥后的本品粉末0.5g，置10ml量瓶中，精密加甲醇5ml,超声处理30分钟后，静置24小时，振摇后再超声处理15分钟，摇匀，静置。

取上清液离心，即得。

测定法：

分别精密吸取对照品溶液5μl与供试品溶液5～10μl,注入液相色谱仪，测定，即得。

本品按干燥品计含天麻素（C12H10O）不得少于0.10％。

2.2改良的高效液相色谱法

对照品溶液：

精确称取天麻素对照品（80℃干燥1ｈ）10ｍｇ,置10ｍl容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得（每1ｍl中含天麻素1ｍｇ）。

精确称取经80℃干燥后的天麻样品粉末约1.0ｇ,置10ｍl容量瓶中,精确加入甲醇5ｍl,称定重量,超声处理30ｍｉｎ,静置24ｈ,振摇后再超声处理15ｍｉｎ,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,静置。

取上清液离心,并用4μｍ滤膜过滤,即得。

最大吸收波长的选择：

取对照品溶液,用流动相稀释后,用紫外分光光度计测定,测得天麻素最大吸收波长为279ｎｍ、270ｎｍ、221ｎｍ,本试验选定270ｎｍ为测定波长。

天麻素的吸收波长谱见图1。

色谱条件：

色谱柱:

Ｃ18中科院大连物化所（200ｍｍ×

4.6ｍｍ,10μｍ）;

柱温:

室温;

流动相:

甲醇：

水（30：

70）;

流速:

2.0ｍl/ｍｉｎ;

纸速:

5ｃｍ/ｍｉｎ;

检测波长:

270ｎｍ;

保留时间:

7.6～7.8ｍｉｎ。

标准曲线的绘制：

准确吸取对照品溶液1,2,3,4,5,6,7,8μl,按上述色谱条件测定,以进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,回归方程为Ｙ=95980Ｘ+2828,ｒ=0.9999。

天麻素在1.20～12.50μｇ范围内与峰面积呈良好的线性关系。

标准品及样品的HPLC图谱见图2、图3。

稳定性试验：

准确吸取同一标准品溶液5μl,间隔一定时间进行测定,进样5次,天麻素的RSD=1.42%。

说明样品溶液在48ｈ内稳定。

稳定性结果见表1。

重复性试验：

对同一批样品（Ⅰ）,分别称样5次,照3.2法处理,测定天麻素含量,结果见表2。

精密度试验：

吸取对照品溶液5μL,重复样品5次,5次测得峰面积值的RSD=1.11%,结果见表3。

样品的含量测定：

取3个产地的各2批天麻样品,共计6批,按3.2法处理,制成供试液。

准确吸取对照品液5μl、供试品液10μl,在上述色谱条件下进样和测定,按照干燥品计算样品中天麻素含量,测定结果见表4。

回收率试验：

《中国药典》2000年版中天麻素作为控制天麻质量主要定量指针,已进行了收载。

本试验的测定方法与药典方法相比较在流动相配制的简便性和对色谱柱的保护等方面有一定的优越性,避免了长期使用缓冲液流动相对色谱柱柱效的影响[22]。

2.3高效液相色谱分离/蒸发光散射和紫外检测法

蒸发光散射检测器（ELSD）作为一种半通用型质量检测器，可用于检测类酯、糖等物质。

近年来，在对天然药物的检测方面应用得也越来越多，如对人参皂甙和银杏内酯的检测等。

用HPLC/ELSD测定天麻甙尚未见报道[23]。

正相HPLC和反相HPLC都可用于天麻及其制剂中天麻甙的分离，本试验采用紫外检测法，检测波长在20nm或270nm处。

ELSD和DAD检测均使用同样的色谱条件。

色谱柱：

ZorbaxRX-SIL[4.6mm（i.d.）×

25cm,5μm]硅胶柱（HP公司产品）,配有预柱MicroPakSI-5[4mm（i.d.）×

4cm,5μm]硅胶柱（Parker公司产品）。

流动相：

正己烷/甲醇/乙酸乙酯（体积比6：

3：

2）,流速0.8mL/min;

进样量20μL.

ELSD参数：

漂移管温度65℃,氮气流速1.55L/min;

DAD检测波长270nm。

样品处理：

将天麻干燥块茎粉碎后,准确称取100g。

用70%的乙醇水溶液热回流3次，每次回流后再用超声提取。

将提取液过滤后进行浓缩,浓缩液用甲醇稀释至适当浓度,放入冰箱内冷冻。

澄清液经0.45μm滤膜过滤后直接进行HPLC分析。

标准溶液的配制：

分别称取89.0mg和21.3mg的天麻甙溶于100mL甲醇中,配制成两个储备液。

使用前以甲醇稀释成适当浓度的工作溶液。

天麻甙的分离：

天麻的乙醇提取物中成分很多.当流动相正己烷/甲醇/乙酸乙酯的体积比为5:

2时,从DAD检测的色谱图（图1）可见,各种物质已经得到了较好的分离,但从ELSD检测色谱图（图2）上发现,天麻甙峰左侧有肩峰,说明有弱极性物质与天麻　分离不完全,只是该物质在270nm处无紫外吸收.增大正己烷比例,当正己烷/甲醇/乙酸乙酯的体积比达到6：

2时,无论从DAD检测结果[图1（B）],还是ELSD检测结果[图2（B）]来看,提取物中的天麻甙与其它成分完全分离.从图1（B）可知,天麻提取物中的天麻甙元和对羟基苯甲醛与其后相邻的其它组分的分离不完全,本方法的重点是比较ELSD和DAD检测天麻甙,故未对其它组分的分离条件进行优化.继续增大正己烷的比例,各组分之间的分离程度可进一步提高,但将导致分析时间过长。

Fig.1　

1.4-Hydroxybenzylalcohol;

2.4-hydroxybenzaldehyde;

3.Gastrodin.

Fig.2　

1.Gastrodin;

2.unknown.

天麻甙可以使用反相条件进行分离.我们采用ZorbaxSB-C18（4.5mmi.d.×

25cm,5μm）色谱柱,水（含0.02mol/LKH2PO4）/甲醇（体积比65：

35）为流动相,使用DAD检测,成功地从天麻的乙醇提取物中分离并定量了天麻甙、天麻甙元和对羟基苯甲醛.对于ELSD检测,首要条件是要使流动相基本挥发,由于反相条件下流动相中含水较多,即使不加入KH2PO4添加剂,在ELSD工作时相应的漂移管温度和氮气气速都较高（95℃,2.7L/min）,大大降低了天麻甙的检测灵敏度.故选用正相色谱条件来分离天麻甙.由于天麻甙元和对羟基苯甲醛的挥发性较大,即使在正相色谱条件下,也几乎不能被ELSD检测。

ELSD条件优化：

通过改变漂移管温度和氮气流速,选定在较小噪音水平上产生最大检测响应值的条件为:

漂移管温度65℃,氮气流速1.55L/min。

线性关系考察：

将贮备液稀释配成浓度在21.3～890mg/L范围内的一系列待测溶液,依次进样20μl,根据ELSD和DAD测得的峰面积对相应的标准溶液浓度进行线性回归.将最小浓度的标准溶液再逐级稀释,依次进样20μL,计算当信噪比为3时,对应的标准溶液的浓度以确定检出下限.结果列于表1.

天麻样品的测定：

对同一份样品重复进样5次,用ELSD和DAD测定其峰面积,取5次测定平均值计算样品中天麻甙含量.在样品溶液中加入已知量的天麻甙标准溶液,测定其回收率（见表2）.

ELSD和DAD检测的比较：

ELSD和DAD作为两种不同类型的检测器,其适用范围并不完全相同.DAD所能检测的物质必须具有紫外吸收,而所采用的流动相则应在检测波长下无紫外吸收.对于一些无紫外吸收的物质,可以通过衍生化的方法接上生色团.ELSD要求被测物应当比流动相难于挥发,对于一些半挥发性的物质,其检测灵敏度很低.同时,也应尽量避免使用高沸点的溶剂作为流动相.对于一些分离中常加入的添加剂,如乙酸盐和磷酸盐等,利用ELSD检测时应用易挥发的盐来代替.使用DAD和ELSD同时检测,不仅可获得更多的物质信息,还可获得更准确的定量结果[24].

2.4毛细管电泳法

仪器与设备：

美国Waters公司生产的高效毛细管电泳仪,内设恒温系统和固定波长紫外检测器。

未涂层熔硅弹性石英毛细管,内径75μm,柱长60cm,有效柱长52cm。

PH-3C型酸度计。

紫外检测波长设在214nm,检测灵敏度为0.005。

数据采集和处理由WatersMillennium2010色谱软件完成。

样品溶液的制备：

精密称取天麻样品粉末,分别以蒸馏水和70%乙醇经冷浸提取48h,精密称取商陆、黄精、天花粉和大九股牛粉末,分别以蒸馏水冷浸提取48h,各提取液经过滤后备用。

称取一定量标准品,用10mL双蒸水溶解备用。

电泳操作：

实验前,毛细管首先在室温下用铬酸洗液清洗毛细管。

每次进样前分别用0.1mol/L的NaOH溶液和双蒸水各冲洗4min,再用背景缓冲溶液冲洗4min。

样品采用重力进样,进样时间为5s.

电泳条件的选择：

天麻中含有天麻素、对羟基苯甲醇、香草醇、香草醛等有效成分,其中,天麻素的含量较高,因此本文选择天麻素作为真伪鉴别的参考标准。

为使天麻素与天麻中的其它成分分离开来,分别考察了硼酸盐的浓度、缓冲溶液的pH值、操作电压对其分离的影响,最后确定24mmol/L硼酸盐,pH值为9.4,运行电压为16kV作为鉴别和测定的条件。

天麻中天麻素的测定：

精密吸取一定体积的天麻素标准溶液,加水稀释配成不同浓度,以校正峰面积对浓度作图,绘制标准曲线。

结果,天麻素在0.0224～0.448mg/mL范围内呈良好线性关系,线性相关方程为Y=-0.048+7.79X（r=0.999）。

天麻水提取液中天麻素的含量（g/g）为0.212%,RSD=1.78%（n=5）,回收率为100.2%;

天麻乙醇-水提取液中天麻素的含量（g/g）为0.219%,RSD=2.97%（n=5）,回收率为99.0%。

两种提取方法所获得的结果一致。

　　利用毛细管电泳测定天麻素的含量具有样品处理简单、操作简便、快速的特点，该方法亦可以用于天麻真伪的鉴定[25]。

近年来对天麻的栽培，化学成分，质量控制方法的方面的研究仍在不断的深入，对研究中出现的问题，比如天麻种类的变异，天麻的化学结构，药理作用机制等等，也有了新的进展，为天麻合理准确有效的应用于临床奠定了良好的基础。

同时，问题依然存在，比方说天麻素是否为天麻的有效成分仍有争议，天麻素于天麻的作用是否完全吻合，天麻中是否还有其他的活性成分，还有哪些微量元素，如何能找到更好的天麻质量的评价方法，还有待进一步的研究。

参考文献

1FENGXiao-Zhang（冯孝章）,CHENYu-Wu（陈玉武）,YANGJun-Shan（杨峻山）.ActaC