ELISA所需缓冲液的配方文档格式.docx
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棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度:
①用包被液将抗原由1:
5０开始作比倍稀释后进行包被,洗涤。
②将强阳性参考血清、弱阳性参考血清与阴性参考血清用稀释液作1:
100稀释,加样,保温、洗涤、③加按工作浓度稀释得酶标IsC抗体,保温、洗涤。
④加底物显色。
加酸终止反应后读取A值。
⑤选择强阳性参考血清得A值为0.8左右、阴性参考血清得A值小于0.1得包被抗得稀释度作为工作浓度,从中选取最适工作浓度、
1。
２夹心法测抗原
ﻫ
在夹心ELISA法中,可用棋盘滴定法同时选择包被抗体与酶标抗体得工作浓度。
①抗体免疫球蛋白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为10、0、1、0与０、1微克／毫升,分别在ＥLＩSA板上进行包被,每一浓度包括３个纵行,洗涤、②在１个横行各包被孔中加入强阳性抗原液,另1横行加入弱阳性抗原液,第3横行加入阴性对照液,保温、洗涤、③将酶标抗体用稀释液稀释成３个浓度,例如1:
1
０0０、1:
5
000与1:
25000。
分别加入每个包被浓度得1个纵行中,保温、洗涤。
加酸终止反应后,读取Ａ值、⑤以强阳性抗原得A值在０.8左右、阴性参考得Ａ值小于0、1得条件作最适条件,据此选择包被抗体与酶抗体得工作浓度,从中选取包被抗体浓度与酶标抗体得稀释度。
为了进一步节省试剂,可以此浓度为基点,缩小间距再进一步做棋盘滴定。
2测定方法得标准化
2、1加样
ELIＳA中除了包被外,一般需进行９６孔加样。
定性测定中有时不强调加样量得准确性。
例如规定为加样1滴,如不具备相当得条件,要尽量使用相同口径得滴管,保持准确得加样姿势,使每滴液体得体积基本相同、在定量测定中,加样量应力求准确,最好采用量程准确得微量移液器。
加样时应将液体加在孔底,不要加在孔壁上部,避免出现气泡。
2、2保温
在ＥＬＩＳA中,一般在加标本与结合物后,反应得温度与时间应按规定得要求,保温容器最好就是水浴箱,可使温度迅速平衡、各EＬISＡ板不应叠在一起。
为避免蒸发,板上应加盖,或将板平放在底部垫有湿纱布得湿盒中。
如用保温箱,空湿盒应预先放在其,以平衡温度。
２。
3洗涤
洗涤在ＥLISA过程中不就是反应步骤,但却就是决定实验成败得关键。
在标本与结合物得稀释液与洗涤液中加入聚山梨酯一类物质即避免非特异性吸附,在ELISA中最为常用、ＥLISA板得洗涤一般可采用以下方法:
吸干孑L内反应液;
将洗涤液注满板孔;
放置2分钟,略作摇动;
吸干孔内液,也可倾去液体后在吸水纸上拍干。
洗涤得次数一般为３—4次,有时甚至需洗５-6次。
如有专用洗涤机,应设定标准得洗涤步骤,并定期检查洗涤液,保证洗涤质量。
4比色
阴性对照颜色极浅,在定性测定中一般可采用目视比色。
在目测法中,待检血清与抗原对照反应孔与待检血清与特异抗原反应孔均呈无色或极浅色,判为阴性;
待检血清与抗原对照反应孔无色或极浅色,而与特异抗原呈橘黄色,判为阳性。
如用比色计测定结果,其准确性则决定于ELISA板底得平整与透明度与比色计得质量。
三、ELISA法抗原包被得浓度如何确定?
EＬIＳＡ法进行抗原包被得时候,抗原包被得浓度就是如何确定得。
瞧到有些资料中方阵滴定法,稀释抗原与血清,以强阳性抗原液A值在0、8左右,阴性参考A值＜0。
1得条件为最适条件。
为什么选择这个为最适条件?
弱阳性血清有什么用处？
ﻫ在摸索包被浓度得时候,血清中抗体得含量就是固定得不？
需要提前定值不？
急需答案
一般我们做得时候抗原抗体两个变量,抗原得浓度就是根据您得抗原得纯度来定得,一般纯化得蛋白就是2nｇ,有时候就是要抗体得滴度,抗原浓度固定,抗体或者血清就要拉稀释度,
这与酶标仪得灵敏性有关.ﻫ一般OD值在1.0左右酶标仪比较灵敏,测量得数据比较准确。
OD值如果很深,达到2点几就不灵敏了、所以我们一般选OD值在1。
０左右进行分析.
ＯD1.0—1.５之间最佳,当然依据酶标仪得性能而定。
个人觉得棋盘ELＩＳA一定要选择ＯＤ1.０得点就是个误区。
首先不同型号得灵敏度应该就是不一样得;
其次ＯD为１、0指得就是某个抗原抗体浓度条件下得ＯD值,并不代表通过此次棋盘得到得最佳抗原抗体得浓度所做得各种后续ELISＡ实验得值也就是1、0左右,所以说选择处于酶标仪灵敏度得最佳状况并不一定符合后续得实验。
（不善表达,不知自己描述清楚没有）
ﻫ我自己觉得要根据不同得实验类型（间接,双抗夹心或就是竞争等）来选择最佳抗原抗体工作浓度。
象竞争EＬISA,做棋盘得目得就是包被抗原与一抗得量,试想如果包被抗原太浓,意味着需要竞争抗原浓度也不能小（毕竟就是竞争对手不能悬殊太大）,这就注定了竞争ELIＳA得检测限不好（因为竞争抗原往往就是要检测得东西,所需浓度越大IC50也就越大）、而一抗也不能足量,否则即能与包被抗原反应又能与检测抗原反应,就不能称为竞争EＬISＡ了。
也不能太少,否则整体ＯＤ读数太低、
ﻫ双抗夹心EＬIＳA也就是同样得道理,找到包被抗体与酶标抗体得平衡点,即能ﻫOD与本底之间得平衡点。
四、eliｓa试剂盒
Elisa试验就是一种敏感性高,特异性强,重复性好得实验诊断方法。
由于其试剂稳定、易保存,操作简便,结果判断较客观等因素,已广泛应用在免疫学检验得各领域中。
EＬISA检测试剂盒就是用于体外定性检测人血清或血浆中得抗人类戊型肝炎（HEＶ）病毒IgＭ抗体ＥLＩＳA检测。
（一）、EＬISA简介
elｉｓa技术流程
ELISＡ得基础就是抗原或抗体得固相化及抗原或抗体得酶标记、结合在固相载体表面得抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记得抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶得活性。
在测定时,受检标本（测定其中得抗体或抗原）与固相载体表面得抗原或抗体起反应。
用洗涤得方法使固相载体上形成得抗原抗体复合物与液体中得其她物质分开。
再加入酶标记得抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上、此时固相上得酶量与标本中受检物质得量呈一定得比例。
加入酶反应得底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物得量与标本中受检物质得量直接相关,故可根据呈色得深浅进行定性或定量分析。
由于酶得催化效率很高,间接地放大了免疫反应得结果,使测定方法达到很高得敏感度。
ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。
然而,影响Ｅｌisａ试验结果得因素很多,故加强各个环节得质量保证才能充分发挥其方法学得优点。
（二）Eｌisa试剂盒测定技术得发展
临床测定技术得发展主要在于方法学得发展,而方法学得发展依托于试剂生产技术不断进步更新与型标记物得应用、目前,分子生物学正在并最终肯定会让我们对整个生命科学有一个全面而彻底得认识,其对免疫测定技术发展得影响也就是直接而又有效得,它使我们对以前一些难以检测得生物活性物质得测定变得轻而易举,并且大大提高了检测得灵敏度与特异性。
（三）基因工程试剂对免疫测定技术发展得影响
免疫测定技术得基础在于抗原抗体之间得特异结合反应,所以任何优质得诊断试剂离不开优质得原料,如抗原抗体,酶等、以前用于免疫测定得抗原通常为各种纯化抗原,而抗体则为纯化抗原免疫动物后获得得多克隆抗体与使用杂交瘤技术得到得单克隆抗体,而抗原或抗体得标记物如酶标结合物则通过各种化学合成方法制备、近年来,随着分子生物学得发展,使用基因工程方法制备各种特殊得抗原或抗体及其酶结合物等免疫测定试剂几成为现实得新一代试剂,各种新型使用得测定方法也不断出现。
HＢsＡg试剂特点（检测模式:
临床抗体夹心法）:
包被抗体为山羊多抗。
多抗具有高亲与性与对抗原各种表位得反应性。
酶表抗体为与HＢsAg有不同结合位点得鼠复合单位,可测得HＢsAｇ变异样品,提高检测得特异性（99、98％）提高检测得灵敏度,应用ParlEhricｈ 学说（PEI）ＨＢsＡg标准品,对ad标准品得灵敏度为0.05ｎg／ml对ay标准品灵敏度为0、0２5ng/ｍl
（四）测试剂盒检测原理
ELISA检测试剂盒应用定性夹心免疫检测技术,用合成得HEＶ多肽抗原包被微孔板板条,这些多肽就是中国型HEV毒株核心氨基酸序列中抗原性很强得肽段,分别来自于该毒株得开放阅读框2与开放阅读框3、将样品或标准品加入孔中并孵育,如果其中存在HEVIgM抗体,这些抗体就会与ＨＥＶ得多肽抗原结合,并固定在上面,洗板除去其它非特异性抗体与样品中得其它成份。
然后加入羊抗人IｇM-ＨRP（辣根过氧化物酶）酶结合物,经第二次孵育后,酶结合物就会与第一次孵育结合上得ＨEVIｇＭ抗体相结合,洗板除去未结合得酶结合物,加入TMB底物溶液,在第三次孵育时会发生酶—底物反应,只有那些含有HＥV ＩｇM抗体与酶结合物所形成得复合物得孔才会发生颜色变化,加入硫酸溶液终止酶与底物间得反应,并在波长:
4５０nm处测量O。
D。
值,按照本HＥVIgM抗体eliｓa试剂盒得测试标准,O、D。
值大于或等于Cuｔ—Ｏｆf值得样品被认为就是初试阳性。
（五）操作步骤
方法一用于检测未知抗原得双抗体夹心法
1。
包被:
用０。
０５MPH9、牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~１０μg／ｍl。
在每个聚苯乙烯板得反应孔中加0。
1ｍl,4℃过夜。
次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次３分钟。
（简称洗涤,下同）。
2、加样:
加一定稀释得待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
（同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔）。
3.加酶标抗体:
于各反应孔中,加入新鲜稀释得酶标抗体（经滴定后得稀释度）０、1ml。
37℃孵育０、５～1小时,洗涤。
４。
加底物液显色:
于各反应孔中加入临时配制得TMB底物溶液0.1ｍｌ,3７℃10~３0分钟。
5。
终止反应:
于各反应孔中加入２M硫酸0、０５ml、
6.结果判定:
可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:
反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色得深浅,以“+”、“-”号表示。
也可测OD值:
在ELISA检测仪上,于45０nm（若以ＡＢTS显色,则４10ｎm）处,以空白对照孔调零后测各孔OＤ值,若大于规定得阴性对照OD值得２、１倍,即为阳性。
方法二用于检测未知抗体得间接法
1。
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml,每孔加0.１mｌ,4℃过夜;
2。
次日洗涤３次;
3。
加一定稀释得待检样品（未知抗体）0、1mｌ于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤;
4、（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中,加入新鲜稀释得酶标第二抗体（抗抗体）0、１mｌ;
37℃孵育3０—60分钟,洗涤;
６.’最后一遍用DDＷ洗涤、
其余步骤同“双抗体夹心法"
得４、5、６。
（六）试剂器材
试剂
（1） 包被缓冲液（PH9.60。
05M碳酸盐缓冲液）:
ＮaHCＯ３1。
５9克
NaHCO3２。
93克
加蒸馏水至１00０ｍl
（２） 洗涤缓冲液（PH7。
4PBS）:
０。
15Ｍ
ＫH２PＯ4 ０。
2克
Na２HPO4·
12H２O 2。
9克
NaCl8、0克
ＫCl 0。
Tｗeen－２00。
05％0。
5ml
加蒸馏水至1００0ml
（3）稀释液:
牛血清白蛋白（BＳＡ） 0、1克
加洗涤缓冲液至1０0ｍｌ
或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成５～１0％使用、
（4）终止液（2MH2SＯ4）:
蒸馏水１78.3ｍｌ,逐滴加入浓硫酸（98％）21.7ml。
（５） 底物缓冲液（PＨ5。
0磷酸枣柠檬酸）:
０.2ＭNａ2HPO4（28、4克/L）2５.７ｍl
0。
1M柠檬酸（19、２克/L） ２4.3mｌ
加蒸馏水5０ml。
（6） TMＢ（四甲基联苯胺）使用液:
TMB（１0mｇ／5mｌ无水乙醇）0.５ml
底物缓冲液（PH5、5）10ｍl
0。
75%H2O232μl
（7） ABTＳ使用液:
ABTＳ0。
5ｍg
底物缓冲液（PＨ5.５）1ml
３%H2O2 2μｌ
（8） 抗原、抗体与酶标记抗体。
（９）正常人血清与阳性对照血清。
器材
（１）聚苯乙烯塑料板（简称酶标板）40孔或96孔,ELＩＳA检测仪,5０μl及１00μl加样器,塑料滴头,小毛巾,洗涤瓶。
（2） 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管与量筒等。
（3） 4℃冰箱,37℃孵育箱。
（七）注意事项
做好对照
正式试验时,应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件,待检样品应作一式二份,以保证实验结果得准确性。
有时本底较高,说明有非特异性反应,可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
实验条件得选择
在EＬISＡ中,进行各项实验条件得选择就是很重要得,其中包括:
（1）固相载体得选择:
许多物质可作为固相载体,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺与纤维素等。
其形式可以就是凹孔平板、试管、珠粒等。
目前常用得就是４0孔聚苯乙烯凹孔板。
不管何种载体,在使用前均可进行筛选:
用等量抗原包被,在同一实验条件下进行反应,观察其显色反应就是否均一性,据此判明其吸附性能就是否良好。
（2）包被抗体（或抗原）得选择:
将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时,要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9、0~9、6之间、吸附温度,时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～２4小时。
蛋白质包被得最适浓度需进行滴定:
即用不同得蛋白质浓度（0.１、1。
０与10μg/ｍl等）进行包被后,在其它试验条件相同时,观察阳性标本得OD值。
选择OD值最大而蛋白量最少得浓度。
对于多数蛋白质来说通常为1～1０μg/ml、
（３）酶标记抗体工作浓度得选择:
首先用直接ＥLIＳA法进行初步效价得滴定（见酶标记抗体部份）。
然后再固定其它条件或采取“方阵法”（包被物、待检样品得参考品及酶标记抗体分别为不同得稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
（4）酶得底物及供氢体得选择:
对供氢体得选择要求就是价廉、安全、有明显地显色反应,而本身无色、有些供氢体（如OＰＤ等）有潜在得致癌作用,应注意防护。
有条件者应使用不致癌、灵敏度高得供氢体,如ＴＭB与AＢTS就是目前较为满意得供氢体。
底物作用一段时间后,应加入强酸或强碱以终止反应。
通常底物作用时间,以10-30分钟为宜。
底物使用液必须新鲜配制,尤其就是H2Ｏ2在临用前加入。
（八）试剂盒得清洗
试验原理
试剂盒就是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ＥＬIＳA）.已知浓度得标准品、未知浓度得样品加入微孔酶标板内进行检测、先将生物素标记得抗体同时温育。
洗涤后,加入亲与素标记过得HRＰ。
再经过温育与洗涤,去除未结合得酶结合物,然后加入底物A、Ｂ,与酶结合物同时作用。
产生颜色。
颜色得深浅与样品中得浓度呈比例关系、
自备材料
1.蒸馏水。
2。
加样器:
５uｌ、１0ul、５0uｌ、100uｌ、20０ｕl、５0０ul、1００0ul。
3. 振荡器及磁力搅拌器等。
安全性
１、避免直接接触终止液与底物A、Ｂ。
一旦接触到这些液体,请尽快用水冲洗。
2.实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
３.不要用嘴吸取试剂盒里得任何成份、
操作注意事项
１。
试剂应按标签说明书储存,使用前恢复到室温、稀稀过后得标准品应丢弃,不可保存、
实验中不用得板条应立即放回包装袋中,密封保存,以免变质、
３。
不用得其它试剂应包装好或盖好。
不同批号得试剂不要混用。
保质前使用、
4.使用一次性得吸头以免交叉污染,吸取终止液与底物A、B液时,避免使用带金属部分得加样器。
５、使用干净得塑料容器配置洗涤液。
使用前充分混匀试剂盒里得各种成份及样品。
6.洗涤酶标板时应充分拍干,不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水、
7.底物A应挥发,避免长时间打开盖子。
底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。
避免用手接触,有毒。
实验完成后应立即读取ＯD值。
8。
加入试剂得顺序应一致,以保证所有反应板孔温育得时间一样。
9。
按照说明书中标明得时间、加液得量及顺序进行温育操作、
（九）ELISＡ得应用
ＥLISA法就是免疫诊断中得一项新技术,现已成功地应用于多种病原微生物所引起得传染病、寄生虫病及非传染病等方面得免疫诊断。
也已应用于大分子抗原与小分子抗原得定量测定,根据已经使用得结果,认为ELＩＳA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点、不仅适用于临床标本得检查,而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此,也适合于血清流行病学调查。
本法不仅可以用来测定抗体,而且也可用于测定体液中得循环抗原,所以也就是一种早期诊断得良好方法、因此ＥLＩSA法在生物医学各领域得应用范围日益扩大,
可概括四个方面:
１、免疫酶染色各种细胞内成份得定位。
２、研究抗酶抗体得合成、
3、显现微量得免疫沉淀反应。
４、定量检测体液中抗原或抗体成份、
五、Proｔｏcｏlｓ／Reｃipes
20１2-03-299:
０5
Pｒotocoｌs/Rｅcipｅs
AｂC—Ａｒrａys:
10xPBSRecipefor1liter
∙Dissolvein800mldistilledwater:
o80gNaCl{Reanal,No、:
2464-1-22-38,Ná
trium-klorid,Ph、Eur、5;
MW:
58、44}
o2gKCl{Reanal,No、:
18050-1-01-38,Ká
lium-klorid,a、r、;
74、56}
o14、24gNa2HPO4*2H2O{Reanal,No、:
08973-1-01-38,di-Ná
trium-hidrogé
n-foszfá
t2-hidrá
t,a、r、;
177,99}
o2gKH2PO4
{Reanal,No、:
17890-01-38,Ká
lium-dihidrogé
136、09}
∙Adjustvolumeto1literwithH2O
∙Filtratethroughan0、22umfilteranddividein500mlaliquotes
∙Storeatroomtemperature
1xPBSRecipefor1liter[137mMNaCl,2、7mMKCl,8mMNa2HPO4,1、46mMKH2PO4]
o8gNaCl{Reanal,No、:
o0、2gKCl{Reanal,No、:
o1、424gNa2HPO4*2H2O{Reanal,No、:
o0、2gKH2PO4
∙Filtratetroughan0、22umfilterorsterilizebyautoclave
PBS-Tweenfor1liter
[0、05%Tween20,PBS]
∙Mixonmagneticstirrer:
o0、5mlTween20{SigmaNo、:
P-1379,Polyoxylethylene-sorbitanmonolaurate（Tween20）}
o1literPBS
PBS-TweenBSAfor300ml
[0、05%Tween20,5%BSA,0、05%azide,PBS]
o300mlPBS-Tween
o15gBSA{Sigma,No、:
A3059-100G,Albumin,bovineserum,FractionV}
o1、5mlSodiumazide（from10%NaN3
stocksolution）
∙Filtratethroughan0、45umfilter
∙Aliquot50ml/falcon
∙Storeat4°
C
Ca2+
Mg2+
stocksolutionfor5ml
[0、25MCa2+,0、07MMg2+]
∙Dissolvein5mlMilliQwater:
o0、1838gCaCl2*2H2O{Reanal11024MSZ24161-65Kalc
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