生物工艺学习题文档格式.docx
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a．孢子培养基b．种子培养基c．发酵培养基
（5）消毒、灭菌及过滤除菌
（6）种子制备工艺
1、在抗生素发酵中，大多数品种的接种量为（）。
a．5-10%b．7-15%c．10-20%
2、在菌种的纯度考察中，主要菌型比例应占（）。
a．100%b．80%以上c．90%以上
3、在种子扩大培养过程中，级数是（）。
a．愈少愈好b．愈多愈好c．三次最好
（7）发酵工艺
1、下列产品发酵类型属于非生长关联型的是（）。
a．脂肪酶b．柠檬酸c．杀假丝菌素
2、抗生素的生产属于（）发酵类型。
a．生长关联型b．非生长关联型c．混合型
3、补料分批发酵的主要优点是（）。
a．增加发酵液体积b．提高发酵单位c．维持较低的基质浓度
4、发酵热的主导因素是（）。
a．Q搅拌b．Q蒸发c．Q生物
5、流态性泡沫出现在发酵的（）。
a．前期b．后期c．全过程
6、决定氧量的标准是（）。
a．空气流量b．空气压力c．溶解氧
7、系统压力一定，氧的溶解度与（）成直线关系。
a．总压b．各气体分压c．氧的分压
填空题
1、培养基中CaCO3主要起（调节pH或缓冲剂）作用。
2、产生抗生素的主要微生物类群是（放线菌）。
3、一般来说，斜面孢子的冷藏时间为（10天以内），大/小米孢子的冷藏时间为（0.5-1个月）。
4、在抗噬菌体菌株的选育中，菌株抗性的来源是（基因突变）的结果，与噬菌体（无关）。
5、在液体培养中，生产菌多用（菌丝断片）的方式进行繁殖。
6、根据产物生成与菌体生长的关系，分批发酵分（3）种类型。
抗生素生产属于（生长非相关）型。
7、在发酵过程中，无菌检查的方法有（显微镜观察）、（酚红肉汤培养）和（琼脂斜面培养）。
8、（甘油）在菌种的液氮超低温保藏法中为保护剂，而在真空冷冻干燥保藏法中不能用作保护剂。
9、在含有氨氮和硝基氮的培养基中，被优先利用的是（氨氮）。
10、决定氧量的标准是（溶解氧），饱和培养液的溶氧浓度为（7mg/L）。
11、在发酵过程中，加油过多，溶氧不足，会造成大量的（有机酸）累积，使pH（下降）。
12、工业微生物菌种人工诱变始于（1944）年，金属化合物在诱变育种中的作用是（增变）。
13、CO2对发酵的影响机制主要为影响（细胞膜），使其处于（麻醉）状态。
14、泡沫的种类主要分发酵前期的（机械性泡沫）和发酵后期的（流态性泡沫）。
15、菌种选育的基本原理是（遗传变异）。
16、纯种的主要标准之一是：
主要菌落类型比例占（90％）以上。
17、有效诱变因子的判别主要是以（营养缺陷型）的诱发率为指标。
名词解释（每题5分）
1、生物工程与生物技术：
p1~2
技术与工程是自然科学因生产实践而派生出的两个分支，“技术”涵盖面较广，有较强的自然科学的探索性和首创性；
“工程”面较小，重视过程的可实施性和经济上的合理性。
（1分）
生物技术（biotechnology）：
应用自然科学与工程学原理，依靠生物作用剂的作用将物料进行加工以提供产品或用以为社会服务的技术（国际经济合作与发展组织，IECDO）。
（2分）
生物工程（bioengineering）可细分为发酵工程（又称微生物工程）、生化工程、酶工程、基因工程（衍生出蛋白质工程、代谢工程）、细胞工程（衍生出组织工程、生物医学工程）。
2、发酵与发酵工程：
ppt
发酵狭义指在无氧条件下，以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。
发酵广义上泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程，包括厌氧与好氧培养的生产过程，产品既有细胞代谢产物也包括菌体细胞与酶等。
发酵工程：
通过改造发酵所用的菌及应用技术手段控制发酵过程来大规模工业化生产发酵产品。
工业生物技术的发展最早始于发酵生产。
3、Bio-X：
p1
指生物学科与其他学科的交叉学科，X泛指物理学、化学、工程学、医学等其它学科。
（2）菌种选育及保藏
1、富集培养：
p34，ppt
又称加富培养或集菌培养；
通过控制培养基组分，培养条件以及加入特定物质，创造有利于目标菌株而不利于杂菌生存的条件，使目标菌株由原来自然条件下的劣势菌株变成人工环境下的优势菌株。
富集培养仅具有相对选择性，杂菌仍然伴随目标菌株存在，为了获得目标菌株的纯种培养，还必须要进一步进行菌种的分离纯化工作。
2、自然选育：
p36
定义：
不经过人工处理，利用菌种的自然突变进行菌种筛选；
方向是筛选出维持原有生产水平的菌株或是筛选出正变（产量增加）菌株，淘汰负变（产量降低）菌株。
特点：
自然突变速度慢，产生负变菌株多于正变菌株，因而筛选高产菌株的效率低。
流程：
制备菌悬液→单菌落分离→斜面种子→摇瓶初筛→摇瓶复筛→生产实验→菌种保存。
应用：
多用于菌种的复壮。
3、诱变育种：
p37~43
使用诱变剂，人为加速基因突变，通过筛选获得高产菌株的一种育种方法。
诱变剂种类：
物理诱变因子、化学诱变因子、生物诱变因子。
相对自然选育提高了突变频率、扩大了变异幅度、增加了获得优良特性突变株的概率。
不足之处是随机突变，非定向进化、筛选工作量大，需与高通量筛选方法配合使用。
多次诱变后，诱变热点钝化、变异幅度下降，菌种生活力逐渐衰退。
地位：
迄今为止，发酵工业所用生产菌种绝大部分是通过人工诱变育种得到，尤其是抗生素工业的生产菌种。
由于其方法简单、有效、对实验条件（设备、成本）要求低，至今仍被广泛使用。
4、杂交育种：
p43~48
将两个基因型不同的亲株（供体与受体）通过特定杂交方法使遗传物质重新组合，把不同菌株的优良性状集中于组合体中，形成新的遗传型个体的过程。
具有定向育种的性质。
该技术对实验条件要求高，操作复杂，需妥善选择亲本及遗传标记。
杂交范围：
种间、属间。
杂交方法：
真核生物主要包括有性生殖和准性生殖；
原核生物有接合、转化、转导等方式。
5、原生质体融合：
p48~49
两个带有不同遗传标记（营养缺陷、抗药性、温度敏感、色素等）的亲本通过酶解作用，使其细胞壁脱除或部分脱除，制成原生质体，并在高渗条件下混合，用聚乙二醇（PEG）促进其发生融合，接着两亲本遗传物质交换，从而实现遗传重组。
然后高渗条件下，重新生成细胞壁，在筛选培养基上生长筛选出具有理想性状的融合子。
（4分）
意义：
打破了微生物种属间的界限，使远源杂交成为可能。
6、代谢控制育种：
应用生物化学和遗传学原理，深入研究微生物合成代谢途径及代谢调控机制，设计出选择性筛选子，通过遗传育种技术获得解除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株，即定向选育某种特定的突变型，以达到大量积累目标产物的目的。
（3分）
定向性、降低工作量、提高了筛选效率。
初级代谢产物（氨基酸、核苷酸）的育种中得到了广泛的应用。
7、基因工程育种：
利用DNA重组技术将外源基因导入到微生物细胞中，使后者获得前者的某些优良性状或者利用后者作为表达场所来生产目的产物的新菌种。
实现真正意义上的远源杂交，革命性，要注意其安全性。
步骤：
目的基因的获得、载体的选择与准备、目的基因与载体连接、外源基因导入、重组体筛选。
8、真空冷冻干燥保藏法：
p59
原理：
在低温、干燥、真空无氧条件下使菌种处于休眠状态，其生长繁殖代谢活力尽可能降低，从而减少变异，是目前较为理想的一种菌种长期保存（五年左右）的方法。
方法：
将微生物制成菌悬液，并与保护剂混合，然后置于安瓿管内，低温下（-18oC以下）使其迅速冻结，继续在低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管熔封，并低温（-70~-80oC）保藏。
保护剂多采用脱脂牛奶和血清，作用是在脱水过程中代替结合水，稳定细胞膜构型，并起到支持作用，使微生物疏松的固定在上面。
9、液氮超低温保藏法：
p59~60
液氮温度为-196oC，远低于新陈代谢停止的温度（-130oC），在此条件下菌种生长繁殖、代谢全部停止，不会产生变异。
是一种长期保存菌种的方法。
待保藏菌种制备菌悬液，加入甘油作为保护剂，甘油终浓度为10%；
然后冻结，从0oC到-35oC，其降温速度为每分钟1oC，这样可以使细胞内的自由水通过膜渗出而不形成冰晶刺破细胞；
然后放入液氮保存；
重新培养时，需将安瓿管在35~40oC水浴中迅速解冻，打开安瓿管，转移菌种至适宜的培养基培养。
10、钝化：
即灭活，用物理或化学方法处理原生质体，使其存活率在10-5～10-6以替代对亲株的遗传标记。
11、随机筛选：
将诱发突变后的菌株凭经验随机选择一定数量的菌落，其中包括未发生突变的野生型菌株和发生突变后的正向突变株和负向突变株，进行筛选的方法。
筛选方法包括：
直接摇瓶法、琼脂柱预筛选法、自动化筛选法。
12、理性化筛选：
根据遗传和生化原理，设计出具有选择性的筛子，淘汰大部分不符合要求的菌株，使有效的性状突变株在大量菌落中得以很快的筛选出来，从而大大提高筛选效率。
（3）代谢调节
1、初级代谢与次级代谢：
初级代谢：
普遍存在于生物体内、与生物生存息息相关，它涉及能量的产生和消耗。
其产物为初级代谢产物，如糖、氨基酸、脂肪酸、核苷酸及其高聚物多糖、蛋白质、脂类和核酸等。
次级代谢：
以初级代谢产物为前体，特定时期合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质过程。
其产物为次级代谢产物，大多是分子结构比较复杂的化合物，如：
抗生素、毒素、激素、生物碱及色素等。
两者关系：
初级代谢为次级代谢产物合成提供前体物质和能量，次级代谢是初级代谢在特定条件下的继续和发展，避免初级代谢过程中某种或某些中间体或产物过量积累对机体产生的毒害作用。
2、分解代谢与合成代谢：
分解代谢指生物体将各种大分子营养物质和细胞物质降解成简单的小分子产物，包括各种中心途径如TCA循环、EMP途径和HMP途径以及外周途径（指其他碳源、氮源物质通过分解后进入中心途径）。
合成代谢将分解代谢所提供的能量和中间体或从环境中所吸收的小分子物质合成大分子物质的过程，如合成氨基酸、核酸等单体。
分解代谢为合成代谢提供原料和能量，合成代谢为分解代谢提供物质基础，两者协调统一，偶联进行。
3、前体与中间体：
p73
前体是指加入到发酵培养基中的某些化合物能被微生物直接结合到产物分子中去，而自身的结构无多大变化，且具有促进产物合成的作用。
中间体指基质进入代谢途径后被转化为一种特定的中间代谢产物，并非途径的终产物，还需进一步代谢。
前体与中间体区别在于，前体结构往往略需改变才能进入到代谢途径中去。
4、能荷：
指细胞中ATP、ADP、AMP系统中可为代谢反应供能的高能磷酸键的量度。
高能荷可促进分解代谢，并抑制合成代谢。
相反，低能荷则促进合成代谢，抑制分解代谢。
5、分解代谢物阻遏：
葡萄糖效应、二次生长
是指那些能被快速利用的基质，如葡萄糖，其分解代谢物会阻遏另一种较难异化利用基质的酶的合成。
当这类基质耗尽时，才能解除其对参与其他代谢的酶的阻遏，菌体才能由生长阶段转入代谢产物合成阶段。
6、亚正常调节：
指一些工业生产菌株的代谢调节。
为达到工业生产的目的，原始菌株经过多次选育后，在代谢调节方面呈现出一种非正常的、变性的菌株，其代谢调节称亚正常调节。
7、效应物：
是一种酶的基质、产物或调节性代谢物。
促进或抑制酶的反应速率，影响酶对基质的亲和力。
1、孢子培养基、种子培养基、发酵培养基
2、生理酸性物质、生理碱性物质
3、快速利用碳源、快速利用氮源
4、氨氮、硝态氮
5、生长因子
6、产物促进剂
7、碳氮比
8、理论转化率
9、正交实验设计
10、响应面分析
（5）灭菌
消毒、灭菌与过滤除菌：
灭菌：
指杀灭或去除物体上所有微生物的方法，包括抵抗力极强的细菌芽胞。
除菌：
将微生物隔离开，并不杀死，如空气过滤除菌。
消毒：
指杀死物体上病原微生物的方法，芽胞或非病原微生物可能仍存活。
用以消毒的药品称为消毒剂。
湿热灭菌：
利用饱和蒸汽具有的强穿透能力，以及蒸汽在冷凝时放出的大量热能，使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，造成微生物死亡。
方法一：
0.11MPa（表压），121℃，保温20~30min（1分）
方法二：
0.07MPa（表压），115℃，保温30min（1分）
使用范围：
一般培养基、玻璃器皿、无菌水、缓冲液、金属用具等都可以采用此法灭菌。
连续灭菌：
指培养基在罐外，通过专用灭菌装置，使培养基和高压蒸汽快速混合接触，经保温及冷却，然后输入发酵罐的灭菌方法。
因为随着灭菌温度的升高，微生物比死亡速率的增加超过营养物分解速率常数，高温快速灭菌可减少培养基营养成分的破坏，所以说，高温快速灭菌所得培养基的质量比较好。
介质过滤除菌：
过滤介质：
逐渐由天然材料棉花过渡到玻璃纤维、超细玻璃纤维和石棉板、烧结材料（烧结金属、烧结陶瓷、烧结塑料）、微孔超滤膜等。
过滤机制：
绝对过滤和深层介质过滤。
绝对过滤是利用微孔滤膜，深层过滤是靠惯性、阻截、扩散、重力沉降和静电等作用将细菌截留。
一般认为惯性、拦截和布朗运动的作用较大，而重力和静电引力的作用较小。
对数残留定律:
湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比（以对数速度递减），（3分）
即dN／dτ＝－kN（2分）
（6）种子扩大培养
1、种子
2、种子扩培
3、种子罐级数
4、发酵级数
5、接种龄与接种量
6、双种法、倒种法
（7）发酵工艺控制
连续发酵：
即在发酵过程中一边补入新鲜的料液，一边以相近的流速放料，维持发酵液原来的体积。
它使培养系统保持恒定状态。
发酵液带放：
在发酵过程中，当分泌期尚未达到高峰时，由于体积大、补料困难、溶氧不足、马达负荷过大、加油次数增多、容易逃液等现象，使继续发酵有困难，这时，可放出一定体积发酵液给下游工段，同时，再补入一些培养基继续发酵。
这种方法称为发酵液带放。
临界溶氧浓度：
发酵热:
发酵热（Q发酵）是指发酵过程中释放出来的净热量。
Q发酵＝Q生物＋Q搅拌－Q蒸发－Q辐射
其中Q生物是主导因素。
简答题
（1）请从技术发展方面谈谈发酵工业的几个历史时期。
发酵工业发展的历史时期为：
①天然发酵阶段：
以家庭工业为主，对微生物的本质缺乏认识，进展缓慢；
②纯培养技术的建立：
1857年发酵原理被发现，建立了纯培养技术，在第一次世界大战前后，进行了以丙酮丁醇发酵为代表的工业化发酵的发展，这是发酵技术发展的第一转折时期；
③通气搅拌发酵技术的建立：
该技术的建立是在第二次世界大战前后，以青霉素发酵为代表，并推广于其它发酵产品。
它使发酵生产不受限制，是发酵技术发展的第二转折时期，也是发酵工程的开端；
④代谢控制发酵技术：
1956年后建立，通过人工诱变的突变株、控制条件下的培养等，使人们能有选择的大量生产人们所需要的物质。
这项技术也在其它发酵产品中推广，是发酵技术发展的第三转折时期；
⑤发酵原料的转换：
由糖质原料向非糖质原料的转换，以节约粮食；
⑥基因工程技术：
使菌种选育、代谢控制定向化。
（2）自然界中分离微生物的流程。
主要有以下几步：
样品的采集、富集培养、分离纯化、纯培养验证。
（2）为什么要进行摇瓶复筛？
主要有4点：
①考察菌种生产能力的自然波动范围；
②考察菌种传代稳定性、效价稳定性；
③通过二级发酵，使摇瓶发酵工艺接近生产工艺；
④有较多较新鲜的孢子留种。
（2）自然变异是如何产生的？
（6）种子罐接种方法有哪些？
引起种子异常的原因有哪些？
⑴种子罐接种方法有：
①孢子悬浮液：
微孔接种法；
②摇瓶菌丝：
压差法、火焰接种法；
③罐间接种：
压差法。
⑵引起种子异常的情况及原因有：
①生长代谢缓慢：
原因是空气温度低、接种量少、培养基消毒质量差、仪表失灵造成培养温度低等；
②菌丝结团：
原因是接种量少、搅拌效率差、有机氮不足等；
③菌丝粘壁：
原因是搅拌效果不好、罐内泡沫多、种子罐的装料系数过小等。
（6）种子扩大培养的目的是什么？
主要是获得代谢旺盛、数量足够的种子。
目前工业规模的发酵罐容积已达几十立方米或几百立方米。
如按百分之十左右的种子量计算，就要投入几立方米或几十立方米的种子。
要从保藏在试管中的微生物菌种逐级扩大为生产用种子是一个由实验室制备到车间生产的过程。
其生产方法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。
如细菌、酵母菌、放线菌或霉菌生长的快慢，产孢子能力的大小及对营养。
温度、需氧等条件的要求均有所不同。
因此，种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的种子。
这种种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备利用率提高。
种子液质量的优劣对发酵生产起着关键性的作用。
（7）泡沫的性质、消长规律有哪些？
性质：
机械性泡沫,流态性泡沫.
消长规律：
⑴与通气、搅拌的剧烈程度有关。
⑵与培养基配比及原材料组成有关。
⑶与菌种、种子质量、菌丝阶段和接种量有关。
（7）如何增加发酵液中的溶氧？
提高空气流速；
提高罐的高径比；
降低培养液的浓度；
调整搅拌器。
（7）发酵分期的原因是什么？
因为，抗生素合成酶是诱导酶，诱导酶的基因平时是处于关闭状态，仅当培养基中有了诱导物时，该基因才得以解除阻遏。
所以，在分批发酵中，菌体生长期中尚未积累合成酶的诱导剂，基因就处于被阻遏状态；
而在生长期末，由于菌体的代谢变化而积累了或从外界加入某种诱导剂，就解除了生长期的被阻遏状态，开始酶的合成，进而合成产物。
这就是发酵分期的原因。
（7）试述分批发酵的分期、类型及其特点。
分批发酵是指在一封闭培养系统内含有初始限制量的基质的发酵方式。
分三期：
延滞期、对数期、稳定期。
分三个类型：
生长关联型：
特点、作图…
非生长关联型：
混合型：
（7）如何从发酵规模上来分析染菌的原因。
主要从以下三个方面来分析：
⑴大批发酵罐染菌⑵部分发酵罐染菌⑶个别发酵罐染菌
（7）高基质浓度对发酵有何影响？
⑴由于代谢产物或基质过浓而导致抑制作用，出现生长下降的趋势。
⑵基质浓度高，传质状况差，用于非生产的能量增加，对生产不利。
⑶引起碳分解代谢物阻遏现象，并阻遏产物的形成。
论述题
1、论述诱变育种的原理及一般步骤。
使用诱变剂，人为加速基因突变的一种育种方法。
诱变剂：
（8分）
2、菌种保藏的原理是什么？
试述冷冻干燥保藏法的步骤和操作注意事项。
（1）原理：
根据微生物生理、生化的特点，通过创造适宜条件，使微生物的代谢处于不活泼和生长繁殖受抑制的休眠状态，以减少菌种变异、退化、死亡。
如，低温、干燥、缺氧、营养缺乏。
（5分）
（2）步骤（9分）
①准备安瓿管：
安瓿管先用2%HCl浸泡，再水洗多次，烘干。
将标签放入安瓿中，管口塞上棉花，灭菌备用。
②制备保护剂：
用鲜奶经处理或使用脱脂奶粉兑脱脂牛奶，灭菌，并做无菌试验后备用。
③菌悬液制备及分装：
将无菌牛奶直接加到待保藏的菌种斜面内，用接种环将菌种刮下，轻轻搅拌使其均匀地悬浮在牛奶内成悬浮液。
用无菌长滴管将悬浮液分装入安瓿管底部，每支安培管的装置约为0.9mL（一般装入量为安瓿管球部体积的1/3）。
④预冻：
将分装好的安瓿管在-30以下进行预冻1h。
⑤真空干燥：
预冻以后，将安瓿管放入真空器中，开动真空泵进行干燥。
⑥封管：
封管前将安瓿管装入歧管；
真空度抽至1.333Pa后，再用火焰熔封，封好后，要用高频火花器检查各安瓿管的真空情况。
如果管内呈现灰蓝色光，证明保持着真空。
检查时高频电火花器应射向安瓿管的上半部。
⑦保藏：
做好的安瓿管应放置在低温避光处保藏。
⑧质量检查：
检查项目有，水份（5％以下）、真空度、杂菌污染情况、存活率、形态变异、生产能力。
⑨活化：
如果要从中取出菌种恢复培养，可先用75%酒精将管的外壁消毒，然后将安瓿管上部在火焰上烧热，再滴几滴无菌水，使管子破裂。
再用接种针直接挑取松散的干燥样品，在斜面接种。
操作注意事项：
（6分）
①脱脂牛奶的脱脂要完全，灭菌条件合适；
②要选择合适的菌液浓度，通常菌液浓度越高，生存率越高，保存期也越长；
③予冻要彻底（-30℃以下）；
④注意真空度（10-2托以下）；
⑤熔封时注意，火焰集中，不使菌受热；
⑥注意保藏温度。
3、如何选择出发菌株和诱变剂？
出发菌株的选择（10分）：
①选择生产菌株，稳定性强，易推广，但难有大的突破；
②选择具有某些优良特性的菌株；
③选择具有一定稳定性的菌株。
诱变剂的选择依据（10分）：
①诱变剂的作用原理；
②出发菌株的特点；
③诱变系谱。
4、你认为目前较好的菌种保藏方法是哪种，为什么？
试述其基本制作过程。
根据微生物生理、生化的特点，通过创造适宜条件，使微生物的代谢处于不活泼和生长繁殖受抑制的
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