实验十一 聚丙烯酰胺凝胶电泳Word下载.docx

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F＝QE质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：

F′＝6πrην式中r为质点半径，η为介质粘度，ν为质点移动速度，当质点在电场中作稳定运动时：

F＝F′即QE＝6πrην

可见，球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。

除了自身状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率。

电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类。

前者包括Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。

区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。

自由电泳法的发展并不迅速，因为其电泳仪构造复杂、体积庞大，操作要求严格，价格昂贵等。

而区带电泳可用各种类型的物质作支持体，其应用比较广泛。

影响电泳的因素

1．电泳介质的pH值

溶液的pH值决定带电物质的解离程度，也决定物质所带净电荷的多少.对蛋白质，氨基酸等类似两性电解质，pH值离等电点越远，粒子所带电荷越多，泳动速度越快，反之越慢。

因此，当分离某一种混合物时，应选择一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差别的pH值，以利于各种蛋白质的有效分离.为了保证电泳过程中溶液的pH值恒定，必须采用缓冲溶液。

2.缓冲液的离子强度

溶液的离子强度（Ionintensity）是指溶液中各离子的摩尔浓度与离子价数平方的积的总和的1/2.带电颗粒的迁移率与离子强度的平方根成反比。

低离子强度时，迁移率快，但离子强度过低,缓冲液的缓冲容量小，不易维持pH恒定.高离子强度时，迁移率慢，但电泳谱带要比低离子强度时细窄。

通常溶液的离子强度在0.02～0.2之间。

I=1/2∑CiZi2（I:

离子强度；

Ci:

离子的摩尔浓度；

Zi:

离子价数.）0.154MNaCl溶液的离子强度为：

I=1/2（0.154×

12+0.154×

12）=0.1540.015MNa2SO4溶液的离子强度为：

I=1/2（0.015×

2×

12+0.015×

22）=0.045

3．电场强度

电场强度（电势梯度Electricfieldintensity）是指每厘米的电位降（电位差或电位梯度）.电场强度对电泳速度起着正比作用，电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。

根据实验的需要，电泳可分为两种：

一种是高压电泳,所用电压在500～1000V或更高.由于电压高，电泳时间短（有的样品需数分钟）,适用于低分子化合物的分离，如氨基酸，无机离子，包括部分聚焦电泳分离及序列电泳的分离等。

因电压高，产热量大，必须装有冷却装置，否则热量可引起蛋白质等物质的变性而不能分离，还因发热引起缓冲液中水分蒸发过多，使支持物（滤纸，薄膜或凝胶等）上离子强度增加，以及引起虹吸现象（电泳槽内液被吸到支持物上）等，都会影响物质的分离.另一种为常压电泳，产热量小，室温在10～25℃分离蛋白质标本是不被破坏的，无需冷却装置，一般分离时间长。

4．电渗现象

在电场中液体对于一个固体的固定相相对移动称为电渗.在有载体的电泳中,影响电泳移动的一个重要因素是电渗。

最常遇到的情况是γ-球蛋白，由原点向负极移动，这就是电渗作用所引起的倒移现象.产生电渗现象的原因是载体中常含有可电离的基团，如滤纸中含有羟基而带负电荷，与滤纸相接触的水溶液带正电荷，液体便向负极移动。

由于电渗现象往往与电泳同时存在，所以带电粒子的移动距离也受电渗影响；

如电泳方向与电渗相反，则实际电泳的距离等于电泳距离加上电渗的距离.琼脂中含有琼脂果胶，,其中含有较多的硫酸根，所以在琼脂电泳时电渗现象很明显，许多球蛋白均向负极移动。

除去了琼脂果胶后的琼脂糖用作凝胶电泳时，电渗大为减弱.电渗所造成的移动距离可用不带电的有色染料或有色葡聚糖点在支持物的中心，以观察电渗的方向和距离。

同工酶

同工酶（isozyme，isoenzyme）广义是指生物体内催化相同反应而分子结构不同的酶。

按照国际生化联合会（IUB）所属生化命名委员会的建议，则只把其中因编码基因不同而产生的多种分子结构的酶称为同工酶。

最典型的同工酶是乳酸脱氢酶（LDH）同工酶。

同工酶的基因先转录成同工酶的信使核糖核酸，后者再转译产生组成同工酶的肽链，不同的肽链可以不聚合的单体形式存在，也可聚合成纯聚体或杂交体，从而形成同一种酶的不同结构形式。

同工酶是指催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶

同工酶分类

因性同工酶或原级同工酶

由不同基因产生的肽链而衍生的同工酶。

这里所指的不同基因可以在不同染色体或在同一染色体的不同位点上，例如LDH中A、B两条肽链的基因分别在第11及第12对染色体上，唾液淀粉酶和胰淀粉酶的基因在第1对染色体的不同位点上。

这类同工酶因分子结构差异较大，彼此间无交叉免疫。

但同工酶的不同基因也可以是同源染色体的等位基因，这种成对的等位基因上两个基因结构不同的情况，在遗传学上称为杂合子。

杂合子在同一个体中可合成同一种酶的两种不同肽链，或亚基，这两种亚基尚可杂交，形成同工酶。

在生物群体的不同个体中，有时同一基因位点上的一个（对杂合子来说）或一对（对纯合子来说）基因也可发生遗传变异，从而产生变异的酶，出现群体中的遗传多态。

不同个体中这些遗传变异的酶也属于基因性同工酶。

其在免疫学上常有交叉反应。

由同一基因转录出前体核糖核酸（前体RNA），经过不同的加工剪接过程而生成多种不同的mRNA，再转译出多种肽链，从而组成同工酶。

这类同工酶因发现较晚，在国际上尚无统一命名，彼此间也有交叉免疫。

次生同工酶或转译后同工酶

由同一基因、同一mRNA转译生成原始的酶蛋白，再经过不同的化学修饰，如酰胺基水解、磷酸化、肽链断裂、糖链上的糖基增减等形成不同结构的酶蛋白，它们的免疫性往往相同。

国际生化协会命名委员会（CBN）建议只将原级同工酶列为同工酶，而将次生同工酶称为共合酶，但不少生化学家还是把上述各类酶的不同结构形式都包括在广义的同工酶概念中。

功能

在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，叫做组织的多态性，体现各组织的特异功能。

大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能，例如动物肝脏的碱性磷酸酯酶和肝脏的排泄功能有关，而肠粘膜的碱性磷酸酯酶却参与脂肪和钙、磷的吸收。

对LDH催化的可逆反应，心肌中富含的LDH1及LDH2在体内倾向于催化乳酸的脱氢，而骨骼肌中丰富的LDH4及LDH5则有利于丙酮酸还原而生成乳酸。

所以同工酶只是做相同的“工作”（即催化同一个反应），却不一定有相同的功能。

同工酶的应用

生物学中，同工酶可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。

例如最原始的脊椎动物七鳃鳗（Lamprey）只有一种LDH肽链，进化到较高级的鱼类才有A、B两类肽链。

又如通过对地理分布不同的物种间某一同工酶谱的普查可以推测物种的地理来源。

动、植物的遗传变异可通过子代和亲代同工酶谱的比较来鉴别。

法医学中也可用多种同工酶谱的分析来鉴定亲子关系。

细胞杂交或植物杂交育种后是否出现新品种也可用周工酶谱的比较来确定。

在个体发育中，从胚胎到出生，再到成年，随着组织的分化和发育，各种同工酶谱也有一个分化转变的过程。

某型同工酶在胚胎的大多数组织中出现，成为主要型式，称为原始型同工酶。

但出生后在某些组织中逐渐减少而被另一型同工酶取代，后者在胚胎组织中几乎不存在或含量极微，只在分化成熟的少数组织中存在，称为成年型同工酶。

在植物的不同发育阶段，同样可见同工酶谱的相应改变。

在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段，癌瘤组织的同工酶谱常发生胚胎化现象，即合成过多的胎儿型同工酶。

如果这些变化可反映到血清中，则可利用血清同工酶谱的改变来诊断癌瘤。

此外。

因同工酶谱有脏器特异性，故测定血清同工酶常可较特异地反映某一脏器的病变，如血清的LDH1（B4）或MB型肌酸激酶（CK-MB）增加是诊断心肌梗塞较特异的指标，较测定血清LDH或肌酸激酶（CK）总活力更为可靠。

遗传标记是指在遗传分析上用作标记的基因，也称为标记基因。

在重组实验中多用于测定重组型和双亲型。

作为标记基因，其功能不一定研究得很清楚但应突变性状是明确的，所以容易测定。

对于微生物虽多用与生化性状有关的基因，但对高等生物则多用与形态性状有关的基因。

也有用着丝粒作为遗传标记的。

在微生物遗传学中遗传标记还区分为选择性标记（或称选择性基因）和非选择性标记（或称选择性基因）二类。

聚丙烯酰胺凝胶电泳

作用：

用于分离蛋白质和寡糖核苷酸。

作用原理:

聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。

它有两种形式：

非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；

非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。

聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamidegelelectrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。

聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。

催化聚合的常用方法有两种：

化学聚合法和光聚合法。

化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。

在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。

不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。

浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。

分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HCl。

电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。

2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

三：

仪器、材料及试剂

仪器：

垂直电泳槽、电泳仪、离心机、冰箱、移液管、洗耳球、烧杯、电炉、烘箱、移液枪、手套、口罩、石棉网、滴管

材料：

不同品系植物叶（幼叶）

试剂：

盐酸（1mol/L）、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、Tris（三羟甲基氨基甲烷）、TEMED（四甲基已二胺）、过硫酸铵、甘氨酸、蒸馏水、50%蔗糖溶液、溴酚蓝溶液、醋酸、3%双氧水、联苯胺。

四：

步骤

1.安装夹心式垂直板电泳槽

图1

1.样品槽模板2.长玻璃板1.导线接头2.下贮槽3.凹形橡胶框

4.样品槽模板5.固定螺丝6.上贮槽7.冷凝系统

（1）装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。

（2）将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。

（3）将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。

（4）将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。

（5）竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂（糖）。

其目的是封住空隙，凝固后的琼脂（糖）中应避免有气泡。

2.制作聚丙烯酰胺凝胶

聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的配制

A液：

1mol/LHCL48.0ml、tris36.4g、加水至100ml.调至PH=8.3左右备用；

B液：

丙烯酰胺28.0g、甲叉双丙烯酰胺0.735g加水至100ml；

C液：

（混合时候现用现配）过硫酸铵1.4%（参考浓度1.4%-8%）；

配胶时以A:

B：

C：

蒸馏水=1:

2:

0.4:

4.6进行配制

在配制完成以后以5μl/50ml的浓度加入TEMED，混匀，立即进行灌胶（从实验效果来看，一般C液以及TEMED浓度越高，凝胶速度越快，一定要把握好时间）。

电极缓冲液配制：

Tris30.0g、甘氨酸14.4g，加水至1000ml。

调至PH=8.3、使用时稀释10倍。

样品的制作：

采集新鲜的植物嫩叶，洗净后加少量水研磨，过滤出滤液，放入离心机中以3500转/分钟的转速离心15分钟，取上清液，混入等体积的50%的蔗糖溶液，电泳前可以在冰箱中保存（不可放置过久，以免使酶失活）。

4.电泳：

将胶模装好，去胶条后，装入电泳槽中，检查是否漏液后，倒入电泳缓冲液（不要留出气泡），胶模内侧的液面没过矮板但不可超过高板（矮板在内），灌胶完成以后插上样品梳，等待凝胶形成（若在一定时间内不能形成凝胶可以放入30℃左右烘箱进行烘烤）。

5.上样：

在凝胶形成以后，将样品梳拔出，用移液枪点加样品，加样量为5～10μl，加样后在样品中再加入等量溴酚蓝。

6.电泳:

连接直流稳压电源，矮板连负极，打开电源开关。

调节电流，以80V电压进行30分钟，在意40V电泳约8小时；

7.取胶:

关闭电源，取下凝胶模。

用剪刀轻轻撬起胶模的下方一侧，一个玻璃板即可取下，用刀片轻轻将胶的两侧划一下，掀起胶的一角，慢向前推同时注水，靠水流压力和润滑作用，将玻璃板与胶分开。

一次不行，可从另一端再操作或两端同时操作（取胶时可以用手沾一些水，比较容易拿取胶块）。

8.染色：

将胶块放入染色液中漂洗一段时间，待胶块显影后取出；

9.选择比较组分胶柱中、着色最深的酶带或特殊酶带（即该组分特有酶带），计算酶带的相对迁移率Rf值

五．数据处理及结果

女贞叶酶带迁移距离：

6.7cm

溴酚蓝指示剂迁移距离：

10.2cm

Rf=6.7cm/10.2cm=0.657

六．思考与讨论

1.配胶缓冲液系统对电泳的影响？

答：

在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；

而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。

在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；

而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。

由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。

当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。

　　所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。

2.“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？

主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。

　　处理办法：

待其充分凝固再作后续实验。

3.“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？

主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。

可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

4.为什么带出现拖尾现象？

主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

加样前离心；

选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；

电泳缓冲液时间过长，重新配制；

降低凝胶浓度。

5.为什么带出现纹理现象？

主要是样品不溶性颗粒引起的。

加适量样品促溶剂。

七．注意事项

（1）安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免缓冲液渗漏。

（2）用琼脂（糖）封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。

（3）样品中应含一定浓度的蔗糖溶液，目的是用以防止样品因对流而被稀释。

（4）加样时样品不能超出凹形样品槽。

加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除；

（5）由于丙稀酰胺是神经毒，在制胶过程中需要戴手套，凝胶聚合后则不再有毒性。

八．作业

1.比较说明不同电泳类型的异同点？

（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳

电泳支持介质分类

第一类：

纸、醋酸纤维素膜

分离原理：

基于蛋白质的电荷密度

分辨率：

较低

第二类：

淀粉、琼脂糖、

聚丙烯酰胺（分辨率高，机械强度好）

分子筛效应

较高

（二）琼脂糖凝胶电泳

（三）转移电泳

（四）双向电泳

2.在生物化学上，除了电泳外，还有哪些方法可以分离蛋白质和核酸？

：

（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法

1、蛋白质的盐析

中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；

当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4）有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。

盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。

由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。

影响盐析的因素有：

（1）温度：

除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。

一般温度低蛋白质溶介度降低。

但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。

（2）pH值：

大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。

（3）蛋白质浓度：

蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。

因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。

蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。

其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；

0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；

另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。

硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。

蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。

此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。

2、等电点沉淀法

蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。

3、低温有机溶剂沉淀法

用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。

（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法

1、透析与超滤

透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。

超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。

2、凝胶过滤法

也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。

柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex

ged）和琼脂糖凝胶（agarosegel）。

（三）根据蛋白质带电性质进行分离

蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。

1、电泳法

各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。

值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。

2、离子交换层析法

离子交换剂有阳离子交换剂（如：

羧甲基纤维素；

CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；

DEAE?

FONT

FACE="

宋体"

LANG="

ZH-CN"

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纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。

（详见层析技术章）

（四）根据配体特异性的分离方法－亲和