changing遗传工程Word格式文档下载.docx
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内切酶和甲基化酶不在一起
识别位点
二分非对称序列
4-6bp短序列，大多数为回文结构
5-7bp非对称序列
切割位点
距离识别位点至少1000bp，无特异性
在识别位点中或靠近识别位点
在识别位点下游24-26bp处
限制反应与甲基化反应
互斥
分开的反应
同时竞争
限制作用是否需要ATP
需要
不需要
9.Klenow酶的生物活性：
①5’→3’的DNA聚合活性，使DNA链在模板的指导下延伸②3’→5’的核酸外切酶活性，其主要功能是识别并切除错配的碱基，保证DNA复制的准确性③无5’→3’的核酸外切酶活性④无核酸内切酶活性
10.Klenow酶的副反应即催化活性：
①修复由限制性核酸内切酶造成的3’凹端，使之成为平头末端②以含有同位素的脱氧核苷酸为底物，对DNA片段进行标记③用于催化cDNA第二链的合成④用于双脱氧末端终止法测定DNA的序列
11.受体细胞的类型及其特点：
①限制缺陷型：
打破细菌转化的种属特异性，提高任何来源的DNA分子的转化效率。
②重组缺陷型：
具有依赖于ATP的双链DNA外切酶和单链DNA内切酶双重活性，用于以外源基因克隆、扩增以及表达为目的的基因工程实验。
③转化亲和型：
利用遗传诱变技术改变受体细胞壁的通透性，提高转化效率④遗传互补型：
具有与外源基因表达产物活性互补的遗传特征⑤感染寄生缺陷型：
对其他生物具有感染和寄生效应，将重组DNA分子导入后，极有可能随着受体菌的感染寄生作用，进入生物体，并广泛传播。
12.以植物为例，常用的转基因方法（14种）①细胞融合②微细胞介导的基因转移③染色体介导的基因转移④脂质体介导的基因转移⑤磷酸钙沉淀介导基因转移⑥原生质体融合术⑦显微注射法⑧电脉冲介导的基因转移⑨重组DNA病毒感染⑩重组RNA病毒感染⑪直接转化法⑫接合转移法⑬超声波法⑭基因枪法每种方法要懂得基因转移大概的原理，不能单纯只知道名字。
13.大肠杆菌作为转基因受体的特点：
⑴优点：
①全基因组测序，共有4405个可读框②基因克隆表达系统成熟完善③繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定④被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。
⑵缺点：
①缺乏对真核生物蛋白质的复性功能②缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统③内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白④细胞周质内含有种类繁多的内毒素
14.作为一个真核生物表达系统，酵母的优势：
①全基因测序，基因表达调控机制比较清楚，遗传操作简单；
②具有原核细菌无法比拟的真核生物蛋白翻译后修饰加工系统；
③不含有特异性的病毒，不产生毒素；
④大规模发酵工艺简单，成本低廉；
⑤能将外源基因表达产物分泌至培养基中；
⑥酵母是最简单的真核生物（划线部分为：
酵母与大肠杆菌之间的比较）
15.异源蛋白形成包含体的主要原因：
表达速度过快造成细菌细胞内瞬时间蛋白浓度过高肽段或氨基酸之间在分子力的作用下不能构成正确的结构，培养温度不合适，异源蛋白中个别氨基酸序列不能在寄主细胞中正确表达不能构成正确的结构，寄主本身某些蛋白缺失，e.g.热休克蛋白。
膜蛋白。
16.包含体的优、缺点：
①能简化外援基因表达产物的分离操作②能在一定程度上保持表达产物的结构稳定⑵缺点：
丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作。
体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%。
17.信号肽的识别蛋白（大肠杆菌，真菌信号台如何与表达载体结合运输表达）;
信号肽合成出来，马上就被核糖体蛋白上的信号肽识别颗粒（SRP）特异性的结合，这一结合可以被SRP的受体捕获，并将正在进行翻译的核糖体固定在膜内侧。
SRP是一个由蛋白与RNA组成的复合物。
18.包含体复性操作的方法包括：
①一步稀释法，蛋白复性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大②分段稀释法，逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生③试剂添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+④蛋白修饰法，氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚⑤产物隔离法，将变性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞⑥分子伴侣法，GroELL、GroES、DnaK，固定化，共表达
19.二硫键错配造成的危害：
二硫键错配会使得多肽链中的巯基严重的集聚。
20.二硫键如何恢复：
⑴化学氧化法：
需要电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形成是随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠⑵二硫键交换法需要还原型和氧化型谷胱甘肽，二硫键形成相对特异，因此适用性较广，重折叠效果好。
21.泛素依赖型蛋白降解：
在泛素依赖型的蛋白质降解途径中，这个蛋白因子的C端Leu-Arg-Gly-Gly序列首次与各种靶蛋白的游离氨基基团形成共价结合物，这些结合物在泛素激活酶E1、泛素运载酶E2以及泛素连接酶E3的作用下依照一定路线降解为短小肽段直至氨基酸。
（P160）
22.泛素在蛋白质降解中的作用：
①以分泌的形式表达重组异源蛋白，异源蛋白在与泛素形成共价结合物之前，迅速被转位到分泌器中，即可有效避免降解作用；
②将外源基因的表达置于一个可诱导的启动子控制之下，由于异源蛋白质在短期内集中表达，分子数占绝对优势的表达产物便能逃脱泛素的束缚，从而减少由降解效应带来的损失；
③使用泛素生物合成缺陷的突变株作为外源基因表达的受体细胞。
23.线状质粒结构特点：
（主要是两端）缺少经典的启动子结构，因此质粒上的基因转录需要自身编码的RNA聚合酶，可读框上游都没有酵母核RNA聚合酶的识别位点，但在转录起始位点上游14bp处含有一个ACT（A/T）AATATATGA的保守序列（UCS），这是质粒编码的RNA聚合酶的专一性识别结合位点，但这种质粒来源的RNA聚合酶基因的表达仍需使用宿主细胞的转录系统。
24.用于酵母的显性筛选标记常见于哪个宿主？
蛋白质
基因
类型
说明
氨基糖苷磷酸转移酶
Aph（Tn601）
抗氨基糖苷G418
氯霉素乙酰转移酶
CAT（Tn9）
抗氯霉素
在不可发酵的碳源上生长，ADC1启动子
二氢叶酸还原酶
Dhfr
减少氨甲蝶呤和磺胺的抑制
异-1-细胞色素c启动子
未定性
Ble
抗草霉素
异-1-细胞色素c启动子、LEU2启动子
铜离子螯合物
CUP1
抗铜离子
自身启动子
转化酶
SUC2
蔗糖的作用
AOX1启动子、XPR2启动子
乙酰乳酸合成酶
ILV2r
抗硫酰脲除草剂
EPSP合成酶
AroP
抗草甘膦
ADH1启动子、CYC1终止子
25.蛋白质分泌过程：
①新合成的分泌型蛋白质在翻译过程中进入内质网膜腔②新生肽链的N端与信号肽识别颗粒（SRP）形成复合物，抑制肽链的延长③SRP复合物与内质网膜外表面的SRP受体特异性结合④新合成的多肽链在N端信号肽的作用下穿过内质网膜，进入内腔，同时被信号肽酶专一性切除信号肽⑤新生肽链的合成重新进行。
⑥在内质网内腔中的寡聚多糖核装配⑦进入高尔基体的分泌性蛋白在其寡聚多糖核上进行外链的延伸反应，最终形成全糖基化的分泌型蛋白质。
⑧分泌蛋白在胞芽集中，通过膜融合作用转入至分泌型泡囊中⑨泡囊将蛋白质运输至细胞膜内侧，在GTP结合蛋白复合物的作用下，与细胞膜发生融合，将蛋白质释放到细胞周质中。
26.将外源基因导入动物细胞的方法：
装基因的动物受体细胞系统、动物细胞物理转化法（磷酸钙共沉淀法、电击法、脂质体包埋法、DNA显微注射法）、动物病毒转染法、工程胚胎干细胞法、体细胞转基因克隆法。
27.腺病毒结构（重点）：
为线型双链DNA病毒，无包膜，呈二十面体，共有93个成员，分两个属：
哺乳动物腺病毒属和禽腺病毒属。
目前已鉴定的人腺病毒有6个亚属，其中常用来构建载体的腺病毒主要为C亚属的2型（Ad2）和5型病毒（Ad5）。
腺病毒感染人体细胞时呈裂解型，不会致癌；
对啮齿目动物细胞来说，绝大多数的腺病毒成员均能致癌。
28.腺病毒作为转化载体的特点（重点）：
基因组重排率低，安全性能好，宿主范围广，重组病毒的效价高，外源基因在载体上容易高效表达。
缺陷：
重组的外源基因不能持久表达，而且病毒蛋白对体液和T淋巴细胞具有免疫原性。
29.猴肿瘤病毒SV40与腺病毒的差异（重点）：
SV40为双链环状DNA病毒，它衍生出的载体在使用时受到许多限制：
只能转染猴细胞，外源基因的装载量较小，而且基因组常常发生重排和缺失的现象。
30.反转录病毒特点：
①是一种整合型的单链RNA病毒，一般携带两个拷贝的单链RNA基因组，其上包括6个区域，从5’端依此为：
5’长末端重复序列（5’-LTR，含转录起始信号）；
②Ψ+区，非编码区，病毒颗粒包装的信号序列；
③gag基因，病毒内壳蛋白编码序列；
④pol基因，反转录酶及整合酶结构基因；
⑤env基因，病毒颗粒外层包装蛋白编码序列；
⑥3’长末端重复序列（3’-LTR，含poly（A）化信号序列）。
31.利用反义基因抑制细胞基因表达（原理）：
①从细胞中分离靶基因的mRNA并以此为模板，由细菌RNA聚合酶体外合成其互补RNA链，然后将之注射到细胞中。
②根据靶基因序列，设计并体外合成一小段单链DNA，它与靶基因mRNA5’端的翻译起始区互补并抑制其翻译。
③将靶基因的部分序列反向克隆在一个强启动子的下游，构成反义子结构，并以此作为转基因，转化动物受体细胞。
反义子利用其转录产物的互补作用特异性阻断靶基因mRNA的翻译，产生靶基因缺陷型和相关功能丧失型的转基因动物模型。
32.RNA干扰：
指内源性或外源性双链RNA（dsRNA）介导的细胞内mRNA发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型的缺失现象。
33.干扰RNA阻断特定基因表达的特点：
为实现对特定靶基因表达的阻断，体外构建能够表达特定siRNA的重组分子，导入细胞内使其转录出相应的siRNA，然后由细胞内的上述固有编辑途径实现对基因表达的干扰作用。
34.动物细胞高效表达异源蛋白的基本方法（？
）：
增加异源基因在寄主细胞内的含量，利用高表达载体DHFR-MTX高效表达系统和GS-MSX高效表达系统，降低寄主对异源蛋白的降解速度。
35.GS-MSX高效表达系统原理：
谷氨酰胺合成酶（GS）能解除甲硫氨酸亚砜（MSX）对动物细胞的毒害作用。
先将带有GS编码基因的载体转入培养的哺乳动物细胞中，由于只有多拷贝的GS编码基因才能抗MSX，所以在转染过程中不必使用GS缺陷型的受体细胞。
在正常的MSX浓度下就能筛选到含有高拷贝外源基因的转染细胞，这是GS--MSX系统比DHFR-MTX系统优越之处。
36.DHFR-MTX高效表达系统氨甲喋呤（MTX）是动物细胞中的关键代谢酶二氢叶酸还原酶（DHFR）的特异性抑制剂，细胞培养物经氨甲喋呤处理后，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfr基因均得以扩增。
这些抗性细胞正是通过增加相关基因的拷贝数、提高关键代谢酶的表达水平，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。
更重要的是，扩增的区哺乳动物细胞内的基因扩增现象域远远大于dhfr基因本身，即与dhfr基因相邻的DNA区域同时被扩增
37.Ti质粒：
P225-228229图（重点）
38.Ti质粒介导的二元整合转化系统特点：
①含有vir区段的T-DNA②含有带有外源基因的，可以同时在农杆菌和大肠杆菌中增殖的T-DNA③两质粒含有同源区段④上述两个质粒在根瘤农杆菌中发生重组，最终外源基因转入植物细胞中。
39.Ti质粒介导的整合转化程序的特点：
该程序构建的转基因植株再生效率高，外源基因在转入并整合到植物基因组中后，通常不发生重大的修饰改变，使用这种方法所转入的外源基因一般拷贝数较低，大多为单拷贝转移。
40.途径工程研究的重点是
（1）增加代谢途径中限速步骤酶编码基因的拷贝数。
（2）强化以启动子为主的关键基因的表达系统。
（3）提高目标途径激活因子的合成速率。
（4）灭活目标途径抑制因子的编码基因。
（5）阻断与目标途径相竞争的代谢途径。
41.应用转基因技术安全性问题：
基因工程安全隐患1.对环境的影响：
重新组合一种在自然见尚未发现的的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。
2.新型病毒的出现：
制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。
3.癌症扩散：
将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。
4.人造生物扩散：
新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。
42.你认为的基因工程技术的应用领域有哪些（发挥题）（看看应用）基因工程技术已广泛应用于医、农、牧、渔等产业，甚至与环境保护也有密切的关系。
研究成果最显著的是基因工程药物，转基因植物的研究也取得了喜人的成果。
1、在医药业的应用
（1）转基因细菌生产激素类药物
（2）转基因细菌生产抗生素：
（3）转基因微生物生产疫苗：
2.在工业原料生产上的应用
（1）转基因微生物生产高分子多聚物
（2）转基因微生物与环境净化和废料再生
名解：
1.基因工程：
以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物现代方法为手段将一段目的DNA引入寄主，从而在基因水平改造一个生物的技术学科。
2.Cos质粒：
在λ噬菌体线性双链DNA分子的两端，各有一个12碱基组成的互补单链，成为Cos末端。
Cos质粒是人工构建的含有λDNA的Cos位点和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。
3.限制性核酸内切酶：
存在于任何一种原核细菌中，它能在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。
4.酶单位的定义：
一个国际通用酶单位指在25℃、最适条件下，1min内能引起1μmol底物发生反应的酶量。
以U表示。
5.启动子（Promoters）：
DNA分子上结合RNA聚合酶并形成转录起始复合物的区域。
6.终止子（terminator）：
促进转录终止的DNA序列，在RNA水平上通过转录出的终止子序列形成柄-loop结构而起作用。
又可分为依赖于ρ的终止子和不依赖于ρ的终止子两类。
7.多克隆位点（MCSmulti-clonesite）：
DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点，能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。
8.密码子（code）：
信使RNA链上决定一个氨基酸的相邻的三个碱基称为一个密码子，又称三联体密码。
9.SD序列：
位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’UAAGGAGG3’,即SD序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16SrRNA3’端区域3’AUUCCUCC5’与之专业结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译。
10.包含体：
在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构。
11.信号肽：
在原核细菌中分泌型蛋白的N端存在15-30个左右的氨基酸序列，位于前段的多为机型氨基酸，中后部皆为连续排列的疏水氨基酸，对蛋白质的运输起决定作用。
12.信号肽的识别蛋白（大肠杆菌，真菌信号台如何与表达载体结合运输表达）;
13.泛素：
是一种高度保守并分布广泛的真核生物多肽，由76个氨基酸残基组成。
14.ARS：
酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb就有一个ARS元件。
酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标记基因。
15.CEN:
酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列
16.TEL：
线性染色体两端的特殊序列，这种序列广泛分布在原生动物、真菌、植物和哺乳动物的染色体中，并且在序列组成上十分相似，富含G，且由短的基本序列随机串联重复而成。
17.转基因：
是指在DNA操作过程中整合到动植物受体细胞染色体上的外源基因。
18.转基因生物制品（GMO/TO）：
含有转基因并为其遗传修饰了的动植物发育个体。
19.RNA干扰：
20.第三代基因工程：
为途径工程，是一门利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络和信号转导网络，并通过DNA重组技术合理设计和遗传修饰之，进而完成细胞特性改造的应用性学科。
21.基因组工程：
（第四代基因工程）是指整个基因组或染色体的转移。
填空or选择
1.第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达
经典基因工程。
第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变
蛋白质工程。
第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构
途径工程
。
第四代基因工程基因组或染色体的转移
基因组工程
2.基因工程诞生：
1973年，美，斯坦福大学，Cohen和Boyer等建出含四环素和链霉素两个抗性基因的重组质粒分子，导入大肠杆菌，表达，赋予抗性。
3.基因工程成熟：
1978年，美Genentech公司开发出利用重组大肠杆菌合成胰岛素的先进生产工艺，揭开基因工程产业化的序幕。
4.基因工程的基本过程：
①获取目的基因②重组体的制备③重组体的转换④重组体筛选和鉴定⑤外源基因在宿主细胞中的表达。
5.质粒基本特性：
1自助复制性2可扩增性3可转移性4不相容性（具有相同或相似复制子结构及调控模式的两种不同的质粒不能稳定存在于同一受体细胞内的特性。
）
6.λ噬菌体是双链线性DNA分子；
M13噬菌体是单链噬菌体DNA载体；
黏粒载体（cosmid）是一种噬菌体-质粒杂合载体。
（选择）
7.基因工程操作中，最常用的限制性核酸内切酶酶是Ⅱ类限制性核酸内切酶。
8.T4-DNA连接酶的来源：
T4-DNA连接酶有T4噬菌体基因编码，商品化的T4-DNA连接酶均由大肠杆菌基因工程菌生产。
9.Klenow酶的来源：
实际上是大肠杆菌的=DNA聚合酶ⅠC端的大片段，由Klenow通过枯草杆菌蛋白酶位点特异性降解的方法从DNA聚合酶Ⅰ中制备。
10.起始密码子是AUG；
终止密码子：
UAA，UAG，UGA
11.确定启动子三种方法：
①鸟枪法克隆：
pK01②酶保护法分离：
质粒，RNA聚合酶，限制性内切酶③滤膜结合法分离：
硝酸纤维素膜。
12.常用于基因工程寄主的酵母菌突变株有：
提高重组异源蛋白产率的突变宿主；
抑制超糖基化作用的突变宿主；
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主；
内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主。
13.酵母载体系统的结构：
由野生型质粒和宿主染色体DNA上的自主复制子结构（ARS）、中心粒序列（CEN）、端粒序列（TEL）以及用于转化子筛选鉴定的功能基因构建而成。
14.端粒的作用：
线性染色体避免因为复制造成两端缺失。
造成致死突变。
15.酵母启动子的可调控表达系统：
温度控制表达系统、超诱导表达系统、严紧控制表达系统。
（搞清P171-173）
16.酵母菌的蛋白修饰分泌系统：
（P177-178）大多数蛋白质的运输路线：
内质网膜→高尔基体→泡囊→细胞表面。
17.最早的转基因细胞系是什么？
中国仓鼠卵巢细胞（CHO）将外源基因导入动物细胞的方法：
18.重复区域意义：
防止线性DNA在复制过程中的丢失。
19.研究基因功能的基本方法：
删除、回复、突变
20.动物细胞高效表达异源蛋白的基本方法（？
21.植物细胞的直接转化方法：
植物细胞的物理直接导入法、植物细胞的化学直接导入法、植物细胞的生物直接导入法。
22.高等植物的基因表达系统（4个）：
外源基因的四环素诱导系统、外源基因的乙醇诱导系统（重点看一下）、外源基因的类固醇诱导系统、外源基因的地塞米松诱导和四环素抑制系统。
23.利用植物转基因技术研究基因的表达与调控：
利用报告基因展示高等植物基因表达与调控的信息谱、利用病毒载体探查植物基因重排、利用转座元件克隆植物基因、利用T-DNA构建植物遗传突变株。
24.第三代基因工程的途径：
靶点设计、基因操作、效果分析。
实验（实验报告20分，综述15分，考试10分）
1.常用的植物培养基MS，B5,N6,NicherWhite
2.培养基为植物生长提供5类元素，无极营养物，碳源，维生素，邮寄附加物，生长调节物质
3.生长调节物质包括，生长素，细胞分裂素，赤霉素
4.列举灭菌的方法：
高压蒸汽灭菌法，煮沸法，巴氏消毒法，超高温杀菌，辐射杀菌法，滤过除菌法，化学消毒灭菌法（酚类，醇类，重金属盐类，氧化剂）
5.植物全能性是指？
在合适的无菌培养条件下，成熟细胞可以通过脱分化而最终形成一个完成植株。
6.愈伤组织是指？
原指植物体受伤时产生于伤口周围的组织。
现多指切取植物体的一部分，置于含有生长素和细胞分裂素的培养液中培养，诱导产生的无定形的组织团块。
7.要大致知道每次试验的目的及大致的步骤是什么？
我们做了愈伤组织的诱导，利用农杆菌构建转基因烟草。
2.
版权申明
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