治疗性单抗与抗体产业关键技术刘伯宁Word文档格式.docx

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限多克隆抗体在临床上的应用并不多见上世纪七十为治疗性蛋的药用疗效，B，2012，年代利用小鼠淋巴杂交瘤细胞可以获得抗单个抗截止年底欧美市场已有总计三十余种治疗“”，

（1）。

单克隆抗体原决定簇的后者较多克隆抗体特异性性抗体上市销售见图以上抗体药物已经在免疫［1］［2］、，，。

、高均一性好成本低廉为抗体技术的临床应用带来性疾病等治疗领域取得巨大成功而从抗癌症［6］。

突破，体药物的研发线来看已经有三百余种单抗药物进入［3］，Gentech上世纪八十年代美国公司申请了关于。

（20%）临床研究阶段抗体药物研制的成功率远远“”———“Cabillypatent”，［4］重组抗体制备的首个专利专利（11%）。

，高于传统小分子化学药所以抗体药物已DNA，、DNA［5］即利用重组技术将抗体重链轻链同时导，。

并且未来仍将是制药行业发展的主要方向经成为，入宿主细胞后者合成并分泌具有生物活性的单克隆1抗体技术与抗体药物的发展进程。

，治疗性抗体的生产真正进入到产业化阶此后抗体。

，段另外基因工程抗体能够在基因水平对抗体分子1．1抗体技术的发展进程、，，，进行切割拼接组装赋予抗体分子新的生物活性较，1888Emile抗体在临床上的治疗性应用始于年“”“”。

多克隆抗体杂交瘤单抗更具应用前景01-11：

2013-01-31：

2013-修回日期收稿日期1．2抗体药物的发展进程*“973”（2012CB724502）国家计划资助项目：

liuboning801@gmail．com＊＊电子信箱1986，“”年采用杂交瘤技术生产的鼠源单抗

1332013，33（5）：

刘伯宁治疗性单抗与抗体产业关键技术TM（muromonab）。

OKT3成为上市的首个治疗性单抗但抗体药物在上市的首个十年间临床应用并不广泛，（）。

是由于鼠源单抗严重的免疫原性人抗鼠抗问题1（201212）图抗体技术与抗体药物发展历程数据截止至年月Fig．1Thedevelopmentprogressofantibodytechnologyandantibodydrug（DatecurrentasDecember2012）Mouseantibody：

-omab；

chimericantibody：

-ximab；

humanizedantibody：

-zumab；

Humanantibody：

-umab；

Fusionprotein：

-ceptTMTMTM，“”Fab，Fc：

HuMAb-Mouse、KM-Mouse、XenoMouse、嵌合抗体此后技术保留鼠源采用人源如Fc，。

TM段替代鼠源端部分减轻了鼠源抗体的免疫原性，，VelocImmune等在小鼠体内转入了人的抗体基因“CDR”移植技术又可将可变区的部分序列更换为人源［8］，，2006簇经抗原免疫后也产生全人源抗体如年上，，进一步的减轻嵌合抗体的免疫原性采用此技术序列Panitumumab。

，“”，市的此外近年来出现兔单抗技术“”（humanized的抗体药物称之为人源化抗体TMRabMAb，、，如较传统鼠源抗体亲和力强特异性高也antibody）。

，由于成功的降低了重组抗体的免疫原性［9］。

是成为抗体药物设计的一种选择从目前以上市抗上世纪九十年代末上市的诸多嵌合抗体和人源化抗，人源化抗体及全人源抗体已经成为抗体的结构分析，。

体得以在临床上广泛应用［10］

（1）。

体药物的主流图“”“”66%，嵌合抗体人源化抗体的人源程度可达：

，目前抗体药物开发的最新趋势体现在一是在原“”。

90%～95%，人源抗体可达但仍不是真正意义上的“”，，抗体工程利用技术提高单抗药有药物靶点基础上“”（、体外展示技术噬菌体上世纪八十年代发展起来的［11］

（2）；

，、物的疗效图二是构建抗体免疫连接物抗体、），酵母菌核糖体展示等通过构建大容量人源抗体文、，。

：

2007片段双特性抗体或新型结构的抗体药物如［7］，，2002库可实现全人源抗体的体外筛选如年上市TMSolirisEculizumab，FcIG2/4年上市的其端为的嵌合Adalimumab。

“”，的本世纪初兴起的的转基因鼠技术［12］TM；

2009“”Removab，体年上市的三特异性抗体可变

134ChinaBiotechnologyVol．33No．52013中国生物工程杂志［1］［14］CD30。

区可同时结合肿瘤靶点和受体将成为世界上销售量最大的药物品种，，在国际制药行业一方面传统制药公司通过兼并，：

Centocor，建立其在抗体药物上的产品线如强生收购Genentech；

Immunex、等另一方面大型药企通罗氏收购，以保持其在单抗药过组建自己的抗体药物研发平台“。

SeattleGenetics抗物开发上的技术优势如重点发展［15］”。

GSKBoehringerIngelheim体免疫连接物和通过［16］“”，。

建立双特异性抗体药物研发平台并购，、随着抗体原研药物相关专利的到期欧盟美国开EMEA。

201011，也出台始考虑审批抗体仿制药年月《》，20122FDA生物仿制药的草案年月也颁布了了《》，“生物仿制药指导原则草案生物两者均开始建立以”，相似度为核心的生物仿制药审批流程这些都为抗体2图抗体工程技术在抗体药物研发中的应用。

，仿制药的审批铺平道路而在政策相对宽松的亚洲ApplicationofantibodyengineeringFig．2、、。

Dr．我国印度韩国均已有抗体仿制药上市印度technologyinantibodydrugR＆DTMTMRituxanReddyReditux售价仅为原研药物成公司的［17］。

本的十分之一我国市场上也出现仿制药益赛2国内外抗体药物产业现状TMTMTMEnbrel。

、普与原研药物竞争的局面强克2．1国际上抗体产业现状2．2我国抗体产业发展现状2009年美国市场上的抗体药物成为生物技术药物，我国的抗体药物产业尚处起步阶段近十年间国。

，销售额最大的类别此后数年抗体药物的销售额均、、、内先后涌现出后中信国健百泰生物成都弘康上海6%～8%。

2010保持在的增长率年美国市场的单抗药。

，许多赛金等多家专门从事单抗药物生产的企业同时185，物销售额为亿美元世界范围内单抗药物销售额、、、传统制药企业如哈药海正华药先声等也开始涉足抗400，约是整个生物制药市场份额总计已达多亿美元。

，体药物领域特别是近两年服务抗体药物开发的［13］36%。

，的在已上市的单抗药物中销售额排名前五CRO/CMO、、公司如药明康德义翘神州中美奥达等开始82%，为整个抗体药物市场贡献着的市位的单抗品种。

出现标志着新兴的抗体产业在我国已初现雏形“Big5”。

，抗体药物的品种上有所谓之说场份额因此，，，但是无论从上市品种还是从行业产能技术水trastuzumab、adalimumab、infliximab，：

bevacizumab、即，平等方面分析我国的抗体产业的发展尚处于起步阶rituximab。

，2014adalimumabbevacizumab据预测年和。

（1）。

段目前我国的上市抗体品种中表［14］1表我国上市抗体药物品种分析Table1TheanalysisofapprovedtherapeuticantibodyinChina商品名类型主要适应症开发厂家备注靶点HAb18G/CD147CD147利卡汀鼠源肝癌成都华神自主靶点唯美生嵌合实体瘤上海美恩核蛋白（Infliximab）J＆J20122915TNF类克嵌合银屑病年全球销量百万美元（Adalimumab）Abbott20129753TNF修美乐人源类风湿年全球销量百万美元EtanerceptTNF强克融合蛋白类风湿上海赛金仿EtanerceptTNF益赛普融合蛋白类风湿中信国健仿（Cetuximab）MerckGaA20122581EGFR爱必妥嵌合直肠癌年全球销量百万美元/EGFR泰欣生人源化鼻咽癌百泰生物同靶点已有嵌合人源抗体（Daclizumab）200526CD25赛尼哌人源化免疫抑制罗氏年全球销量百万美元DaclizumabCD25健尼哌人源化免疫抑制中信国健仿（Rituximab）20126731CD20美罗华嵌合淋巴瘤罗氏年全球销量百万美元（bevacizumab）20126291VEGF安维汀人源化直肠癌罗氏年全球销量百万美元（trastuzumab）20125990HER2赫赛汀人源化乳腺癌罗氏年全球销量百万美元（Basiliximab）CD25201247舒莱免疫抑制诺华年全球销量百万美元嵌合AnnualsaledateofantibodydrugcitedfromMedTRACKdatebase

1352013，33（5）：

刘伯宁治疗性单抗与抗体产业关键技术，，、国外进口单抗占据多数我国市场上唯一全人源组细胞筛选过程中易出现目的基因拷贝丢失克隆间“Big（Adalimumab）（Abbott），”、“，“抗体为国外公司进口上述双差异性差等问题为此可采用了弱化筛选基因［26-27］”。

，5”；

筛选基因等多种改良策略此外已经出现多单抗药物在国内均已上市我国自主研发的六种抗、、，，“”，以鼠源嵌合人源化为主多集中在少数靶点体药物能够克服载体随机整合时种商品化载体功能元件EGFR，CD25）。

（TNF、“”，：

等这就意味着相同临床适应上位置效应的如强迫目的基因表达的侧翼元件TMTMTM。

，，UCOEs，MARs；

“STAR将面临国内外不同厂家的品种竞争症上等用于目的基因定点整TM”FlpIn，，合的‐技术以及源自逆转录病毒的新型载更为重要的是治疗性抗体作为大剂量重组蛋白［28-29］TMGPEx。

，体等往往需要药物一个年销售额过亿美元的单抗药物“”“”，。

克隆筛选有限稀释法在环节传统的正在被年产百公斤级重组蛋白的产能做支撑行业的技术水TMclonePix，。

流式细胞仪自动分选或高通量筛选设备如平与产能规模将直接影响上市抗体的成本与盈利我［30］TMTM，CelloCellCelector。

，，所代替此外工程细胞系的国抗体行业普遍存在着细胞系表达水平低培养规模［18-20］，，、。

“筛选策略也由单一以表达水平为依据也开始转向综纯化能力不够等技术问题小以上诸多产业［31-32］［33］、、”，合评价细胞的生长能力等生产能力产物质量化关键技术限制了我国抗体产业的产能规模制约了。

（2）。

多方面因素行业的发展进程见图3．2细胞大规模培养工艺开发3抗体产业关键技术，目前国际上重组抗体的制备主要采用动物细胞［27］（，3～5g/L500最高可达培养工艺其容积产率一般可达目前国际上抗体药物的生产成本一般控制在［34］）。

13g/L/g。

，大型制药企业的培养规模超过二十万升美元以下为此相应的产业化技术水平要达到以Genentech250000L：

Amgen200000L，：

＞20pcd（pg/cell/day），公司如公司下指标细胞系表达能力大规模［21］，1g/L，501～5g/L，等国内重组抗体生产水平低于流加培养规下游纯化能力在培养工艺抗体表达水平在［21-22］3000L（），。

～100kg/batch，70%模不超过中信国健灌注培养规模不超过纯化收率在以上［18-19］（500L）。

3．1工程细胞系的构建““”“，无动物细胞用培养基逐渐由无血清培养基或生长能够正确表达重组抗体的细胞系还需具备［35］“””。

，、”，化学明确培养基动物来源培养基转向在培养能力强表达水平高遗传稳定性等特性才能成为具［23］、“，“”“”。

培养基混基优化策略上除了传统的组分滴定有产业化价值的工程细胞系国内目前抗体表［36］”、“”，“”，（＜1g/L），消耗成分分析化学计量法合外目前更多其根本原因在于细胞系生达水平普遍偏低［37］“”（＜20pcd）。

的倾向于综合上述方法优点的理性培养基优化产能力的不足［38］“”。

，系统培养优化和，“”此外借助迷你反应器在宿主细胞的选择上除了少数鼠源抗体仍由TMTMTMTM（BioLector，SimCell，Micro-24，ambr），等可实现sp2/0），（NS0，生产外骨髓瘤细胞绝大多数抗体药物均［39］。

高通量实验设计CrucellCHO。

，公司开发的人视网由细胞生产近年来TM，流加培养模式是目前重组抗体生产的主流方式PER．C6，膜细胞系借助病毒载体能够实现重组抗体TM。

；

MerckGlycoFi，其配套反应器多为搅拌罐和气升罐近年来兴起的一的高表达公司开发的酵母具备了抗TMTM［23］waveHycloneS．U．B、。

等多用于扩增种次性反应器体的特异性糖基化修饰能力。

“子细胞或制备小规模样品流加培养存在营养物质消宿主细胞的遗传改造主要集中在借助于细胞工、，，”。

耗代谢废物积累以及产品质量不稳定等问题因此程技术提高细胞的生长能力和表达水平如通过导、2，bcl-xl），（bcl-其工艺优化集中在基础培养基流加培养基以及流加使宿主细胞具有更入抗凋亡蛋白基因［40-42］［24］。

“”策略上强的生长能力通过构建自分泌细胞表达生长因，、，；

灌注培养模式下细胞密度蛋白产量可较流加模子使宿主细胞更适合无血清培养通过过度表达二硫［43-44］。

ERp57），（Bip/GRP78，式提高数倍但是该工艺需使用细胞截留需特殊键异构酶及相关分子伴侣提高［25］（、、、。

装置如旋转滤器倾斜沉降装置超声截留装置宿主细胞对异源蛋白的折叠分泌能力等［45］“”），。

业内在细胞构建中多使用的基因共扩增体系等这就限制了其工艺的可操作性和放大性灌注，GS/CHOK1，：

DHFR/CHODG44，降低灌培养工艺的优化策略为通过优化培养基组分如在基于此原理的重

136ChinaBiotechnologyVol．33No．52013中国生物工程杂志［46］，（）、“”（）。

流速度提高产物容积收率上海抗体药物研制国家重点实验室石家庄等pH、、，“细胞培养工艺中的物理条件如温度渗透压国家级重点实验室行业内部业内也自发形成抗体产［47］、、”。

、，等营养成分等均会重组抗体的质量如聚体糖基业联盟等组织市场需求的驱动产业政策的扶持［48］［49-50］，。

，化电荷变异等影响因此建立用于上市抗体。

都为我国抗体产业发展提供了良好的机遇一旦在上，“生产的细胞培养工艺需要事先对其进行充分的定性，我国的抗体产业必将十述产业关键技术上取得突破［51-52］，”。

研究以确定各工艺参数的控制范围！

年之内有一个跨跃式的发展3．3、大剂量重组蛋白纯化质控参考文献（＞10000L）、随着产业上游培养规模抗体产率（＞5g/L）。

的提高下游纯化纯化环节的处理能力成为［1］ChanAC，CarterPJ．Therapeuticantibodiesforautoimmunity2010，10（5）：

301-316．andinflammation．NatRevImmunol，“”。

，瓶颈另外限制产能的纯化环节介质的成本占据［2］WeinerLM，SuranaR，WangS．Monoclonalantibodies：

70%。

、成本上的压抗体药物的生产成本的以上规模Versatileplatformsforcancerimmunotherapy．NatRevImmunol，：

力使得业内普遍认为未来下游纯化将是制约抗体行2010，10（5）：

317-327．［53］。

业扩大产能的主要因素［3］ReichertJM．Whicharetheantibodiestowatchin2013？

MAbs，，，目前业内普遍采用一条抗体纯化生产线与数个2013，5

（1）：

1-4．。

、发酵罐配套的设计方案细胞收液通常采用微滤离［4］KozlowskiS，SwannP．Currentandfutureissuesinthe“”，“”、固液分离亲和色谱心深层过滤等方法实现通过manufacturinganddevelopmentofmonoclonalantibodies．Adv（proteinA，proteinG）。

“捕获抗体然后再使用精制色DrugDelivRev，2006，58（5-6）：

707-722．［5］AnZ．Monoclonalantibodies-aprovenandrapidlyexpanding（、”、）阴离子交换色谱谱阳离子交换色谱疏水色谱等therapeuticmodalityforhumandiseases．ProteinCell，2010，1、DNA、。

进一步去除宿主蛋白宿主色谱配基等杂质此（4）：

319-330．FDA，要求整个纯化过程中需配有至少两步病毒灭外［6］．．，刘伯宁诺贝尔医学奖与免疫学的百年渊源自然杂志［54］。

活步骤2012，34（4）：

167-171．TMTMMabSelect，（ProsepvA，目前使用的亲和色谱LiuBN．TheNobelPrizehighlightsinimmunologichistoryfroaTM），15～50g/L。

MabCapture其抗体捕获能力通常在由2012，34（4）：

167-171．century，ChineseJournalofNature，“”，。

柱色谱于不能无限制放大其产能放大存在限制［7］BradburyAR，SidhuS，DubelS，etal．Beyondnatural“”，Q（新兴的一次性膜色谱技术如膜色谱技术如antibodies：

Thepowerofinvitrodisplaytechnologies．Nat［55］TM）10～36kg/L，SingSepQ处理能力可达具有潜在Biotechnol，2011，29（3）：

245-254．［8］NiJ．Newtechnologiesforthegenerationofhumanmonoclonal。

的应用价值antibody．TrendsinBio/PharmaceuticalIndustry，2009，5（3）：

，抗体分子在整个制备工艺中存在多种降解途径3-12．：

、、、如裂解二硫键错配甲硫氨酸氧化谷氨酸焦谷氨酸［9］FengL，WangX，JinH．Rabbitmonoclonalantibody：

Potential、、，化天冬酰胺脱乙酰化天冬氨酸异构化等上述降解applicationincancertherapy．AmJTranslRes，2011，3（3）：

、、、途径会导致重组抗体在分子量纯度等电点糖基化269-274．“”，异质性并最终影响抗体药物的临床疗等方面出现［10］NelsonAL，DhimoleaE，ReichertJM．Developmenttrendsfor［56］。

，效因此抗体药物的质控需根据临床疗效确定其humanmonoclonalantibodytherapeutics．NatRevDrugDiscov，（criticalqualityattribute），并据此确定抗关键质量属性2010，9（10）：

767-774．［11］BeckA，WurchT，BaillyC，etal．Strategiesandchallengesfor、。

体药物的工艺过程质量标准thenextgenerationoftherapeuticantibodies．NatRevImmunol，4结语2010，10（5）：

345-352．［12］RotherRP，RollinsSA，MojcikCF，etal．Discoveryand2011。

我国于年已经成为世界第三大医药市场developmentofthecomplementinhibitoreculizumabforthe。

国内对于抗体药物的市场需求巨大生物制药产业也treatmentofparoxysmalnocturnalhemoglobinuria．Nature。

因此被列为我国十二五期间的战略性新兴产业基于biotechnology，2007，25（11）：

1256-1264．抗体抗体的生物制药产业将是未来国家培育的重点行［13］AggarwalS．What＇sfuelingthebiotechengine-2010to2011．Nat。

，“”业近年来国家先后建立抗体药物国家工程中心Biotechnol，2011，29（12）：

1083-1089．

1372013，33（5）：

刘伯宁治疗性单抗与抗体产业关键技术［14］Datamonitor．Monoclonalantibodies2012reprot．2011．［31］LegmannR，BenoitB，FedechkoRW，etal．Astrategyforclone［15］HughesB．Antibody-drugconjugatesforcancer：

Poisedtoselectionunderdifferentproductionconditions．Biotechnologydeliver？

NatRevDrugDiscov，2010，9（9）：

665-667．progress，2011，27（3）：

757-765．［16］HolmesD．Buybuybispecificantibodies．NatRevDrugDiscov，［32］PorterAJ，DicksonAJ，RacherAJ．Strategiesforselecting2011，10（11）：

798-800．recombinantchocelllinesforcgmpmanufacturing：

Realizingthe［17］ScolnikPA．Mabs：

Abusinessperspective．MAbs，2009，1potentialinbioreactors．Biotechnologyprogress，2010，26（5）：

（2）：

179-184．1446-1454．［18］，．［33］vanBerkelPH，GerritsenJ，PerdokG，etal．N-linked陈志南杨向民基于抗体等重组蛋白表达产品的哺乳动物2009，4（5）：

325-．，glycosylationisanimportantparameterforoptimalselectionofcell细胞大规模发酵技术中国医药生物技术328．linesproducingbiopharmaceuticalhumanigg．Biotechnol