细胞凋亡的几种检测方法样本Word格式.docx
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3、酶联免疫吸附法（ELISA）核小体测定
凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。
核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成,可由ELISA法检测。
检测步骤
1、将凋亡细胞裂解后高速离心,其上清液中含有核小体;
2、在微定量板上吸附组蛋白体’
3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘
4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’
4、加酶的底物,测光吸收制。
用途
该法敏感性高,可检测5*100/ml个凋亡细胞。
可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。
该法不需要特殊仪器,适合基层工作,可是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。
3、
流式细胞仪定量分析
细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性也增加,可是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。
利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。
应用价值
流式细胞仪检测具有以下特点:
1）、检测的细胞数量大,因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确
2）、能够做许多相关性分析
3）、结合被检测细胞的DNA含量的分析,可确定凋亡的细胞所处的细胞周期
（1）检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法
细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性液增加,但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间,利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。
利用Hoechs-PI染色法,正常细胞对染料有抗拒性,荧光染色很浅,凋亡细胞主要摄取Hoecha染料,呈现强蓝色荧光,而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI）而呈强的红色荧光。
（2）DNA片断原位标记法
凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下,用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（DUTP）和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）相反应与凋亡细胞裂解后3•的羟基（－OH）端结合,经显色反应后检测DNA裂解点的技术。
DNA片段原位标记法有二种:
1、原位缺口转移（insitunick-translation,ISNT）技术,它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3•－OH端
2、原位缺口末端标记技术（insituendlabellingtechnique,ISEL）,即TUNEL法,它是利用TdT将标记的DUPT接到3•-OH端。
研究证明,TUNEL法的敏感性远高于ISNT,特别对早期凋亡的检测,TUNEL更为合适。
（3）检测细胞膜成分变化的AnnexinV联合PI法
原理:
在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）迁移至细胞膜外测。
磷脂结合蛋白V（AnnexinV）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白,它于PS具有高度的结合力。
因此,AnnexinV能够作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。
故利用对PS有高度亲和力的AnnexinV,将AnnexinV标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC）,同时结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测,且对PI高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。
结果判断:
正常活细胞AnnexinV、PI均低染;
凋亡细胞AnnexinV高染、PI低染;
坏死细胞AnnexinV/PI均高染。
应用价值:
细胞发生凋亡时,膜上的PS外露早于DNA断裂发生,因此Annexin
V联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。
又Annexin
V联合PI染色不需固定细胞,可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。
因此,Annexin
V联合PI法更加省时,结果更为可靠,是当前最为理想的检测细胞凋亡的方法。
方法及步骤
A.
直接标记抗体（FITC标记抗体）:
（1）
收集1×
106个细胞,800rpm离心5min,4℃以上冷PBS洗一次。
（2）
用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟,800rpm离心5min去上清。
加2mlPBS重悬洗涤细胞,800rpm离心5min。
（3）
用1ml含5%人血清的PBS重悬细胞,冰上孵育10min,800rpm离心5min去上清。
加入200ul含0.5%BSA和饱和剂量的荧光标记抗体（5×
105个细胞/20ul抗体）的PBS,避光冰上放置30min,离心弃上清。
加入200ul1%多聚甲醛固定,待测即可。
（4）
用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10000个细胞。
B.未标记抗体间接免疫荧光标记法:
（1）收集2×
106个细胞,用冷的PBS2ml洗涤细胞一次,800rpm离心5min。
（2）用2ml4%多聚甲醛室温固定细胞40min,800rpm离心5min;
2mlPBS重悬细胞,800rpm离心5min;
（3）用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞,冰上放置10min,800rpm离心5min。
（4）加入饱和剂量未标记抗体,冰上放置40min,800rpm离心5min,用2ml冷的PBS重悬细胞,800rpm离心5min,洗去未结合一抗,重复一次。
（5）加入荧光标记（FITC）标记的二抗,冰上避光放置40min后,800rpm离心5min,去上清,PBS洗涤两次。
（6）加入0.5ml1%多聚甲醛重悬细胞;
固定待测。
（7）流式细胞仪检测荧光值,每管计数10000个细胞。
C.细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品（PI染色）的制备:
（1）待测样本制成单细胞悬液,然后200g离心5分钟,弃上清。
（2）用4℃预冷的70%冷乙醇固定,4℃保存,至少固定18小时。
（3）调整细胞浓度为106细胞/毫升,取1毫升细胞悬液,用PBS洗三次,细胞重悬于1毫升PI染液中,37℃孵育30分钟即可进行流式分析。
（4）PI染液终浓度为50微克/毫升,RNaseA终浓度为20微克/毫升。
培养细胞染色体显示法
（1）
传代培养细胞染色体显示法
培养细胞—加秋水仙素—采集分裂细胞—离心—低渗处理—预固定—固定—重复固定—制片—染色和封片
1．培养细胞:
取处于指数生长期、用较大瓶皿培养的、80％～90％汇合单层培养细胞。
2．加秋水仙素:
使用最终浓度为0.02～0.8微克/毫升营养液,温箱继续培养6～10小时;
或用低温封闭法:
把培养细胞置于4℃条件下6～12小时后,再于37℃温箱继续培养6～10小时处理（加秋水仙素）。
3．采集分裂细胞:
可利用分裂中期细胞体变圆与底物附着不牢特点,此时手持培养瓶,左右重复横向水平摇动,令培养液在培养细胞表面重复冲刷。
应用此法可使90％的中期分裂细胞从瓶壁脱落,注意勿用力过猛,以防多量非分裂细胞脱落影响观察。
4．离心:
收集培养液,1000转/分钟离心5～10分钟。
5．低渗处理:
吸除上清液、加入预温至37℃的0.075MKCl溶液,在温箱中静置20～30分钟。
6．预固定:
向悬液中加新鲜1:
3醋酸、甲醇固定液1ml,用吸管吹打调匀,此措施能起到先使细胞表面轻微固定,可防止固定后细胞粘连成块。
7．固定:
离心,同4,吸除上清液,加新鲜固定剂5～10ml;
加固定剂时要用一手微斜持离心管,另手用吸管吸取固定剂,把固定剂逐滴滴在离心管壁上,使之慢慢流入离心管中,然后轻轻吹打均匀,置15～20分钟。
8．重复7,末次离心后,小心吸除大部分上清,据悬液中细胞密度大小,余下固定液0.5～1ml。
9．制片:
用滴片法制片,按如下步骤:
彻底洗净载物片,勿留任何油脂,置冰箱中储备备用。
滴片前现从冰箱中取出冷载物片1片,在载物片表面出现细微水气时,立即向片的一侧滴2～3滴细胞悬液,滴片时的距离能保持半米高度才好。
滴片后置室温中令其自然干燥,或用吹风机热风吹干亦可。
如此制备好的标本可置盒中备用或立即进行染色观察。
10．染色和封片:
一般常见Giemsa染色:
取干液Giemsa1份加pH6.8磷酸缓冲液9份混合,染色10分钟后,水洗、晾干、可直接观察。
如标本需要保存或做长时间观察,可过二甲苯两次后,用中性树胶封片后,再过二甲苯,然后封片亦可。
（2）人末梢血微量全血培养染色体显示法
1．培养液准备:
取15ml培养瓶数个,每瓶内分别充入5ml培养液（pH7.2）,内含:
1640培养液（含10％～15％小牛血清）,PHA0.1ml,青霉素100单位和链霉素100微克/毫升培养液
2．抽血针管准备:
取2～5ml针管一支,在消毒后的无菌操作台或无菌操作箱中安装好注射器,无菌抽肝素（100U/mlBBS）少许湿润针管,如动作迅速不用肝素亦可。
3．采血:
用棉签75％酒精给患者或献血者的皮肤消毒两次,缚止血带,静脉取血1～2ml。
无菌操作迅速向每一瓶培养中加血0.4～0.5ml,如系外出采血,安装针管及分装血液两步骤亦可在无菌条件略差的环境内操作,但动作要迅速,以减少污染;
在采血量不多或不应抽血的情况下,亦可在耳垂、手指肚（无名指）用刺血针采血。
4．培养和加秋水仙素:
37℃温箱中培养到60～72小时之间,此时细胞分裂相最多,向每培养瓶内加秋水仙素,最终浓度0.02～0.08微克/毫升营养液,再培养4～6小时。
5．低渗:
1000转/分钟离心10分钟,吸除上清液,加入预温过的0.075MKCl溶液10ml,置温箱中低渗处理15～20分钟。
6．其余步骤与处理传代细胞法相同。
（3）羊水细胞培养
1.抽取羊水:
无菌抽取羊水10-20ml,立即注入无菌离心管
2.离心分离:
1000转/分离心10分钟,弃去上清,留0.5ml.
3.培养:
加培养液4ml（含小牛血清1ml）,用NaHCO3调PH至6.8,置37度培养,在温箱培养7-10天,可见大量成纤维细胞或上皮样细胞生长;
加秋水仙素0.02-0.8微克每毫升营养液,作用10-12小时。
4.其余步骤与传代细胞染色体制备方法相同。
一般染色体制片程序
1、
取对数生长期细胞一个T75或T25瓶。
2、
将培养基换成10mlDMEM（H）+10%FBS+0.1ug/ml秋水仙素的培养基,处理1~2小时。
3、
将细胞培养液倒掉,马上加入3~4ml0.1%胰蛋白酶,并立即摇晃0.5~1min。
当在显微镜下看到分裂相细胞脱壁后,马上加入终止液终止消化,并将分裂相细胞收集在一个15ml的离心管中,并在1200r/min离心4min。
4、
将上清液倒掉,剩余50ul左右的液在管中,并轻微震动,使细胞沉淀重新悬浮。
5、
加入10ml的低渗液（0.075MKCL）,第一毫升要逐滴加入,并边加边摇晃。
6、
37℃水浴中低渗30min。
7、
再加入1ml冰冷的固定液（甲醇:
乙酸=3:
1的混合液）,并马上摇匀,离心,1000r/min、10min。
8、
同步骤4。
9、
加入10ml冰冷的固定液,第一毫升要逐滴加入,边加边摇晃。
10、
室温下固定30min,然后离心,1000r/min、10min。
11、
12、
13、
室温下固定15min,然后离心,1000r/min、10min。
14、
重复步骤11~13一次。
15、
将离心后的上清液倒掉,并加入50~100ul的新鲜固定液重悬细胞。
16、
滴片（玻片要求是湿冷的干净的,滴片高度要大于30cm。
玻片倾斜角度15~30度左右）
17、
镜检。
（六）细胞的冷冻保存与复苏（慢冻速溶）
•
当细胞冷到零度以下,能够产生以下变化:
细胞器脱水,细胞中可溶性物质浓度升高,并在细胞内形成冰晶。
•
如果缓慢冷冻,可使细胞逐步脱水,细胞内不致产生大的冰晶;
相反．结晶就大,大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。
复苏过程应快融,目的是防止小冰晶形成大冰晶,即冰晶的重结晶。
在细胞冻存时加入保护剂,能大大提高冻存效果。
常见的低温保护剂是DMSO,它是一种渗透性保护剂,可迅速透入细胞,提高胞膜对水的通透性,降低冰点,延缓冻结过程,能使细胞内水分在冻结前透出细胞外,在胞外形成冰晶,减少胞内冰晶,从而减少冰晶对细胞的损伤。
细胞冻存方法
（1）、冷冻前一日提前更换半量或全量培养基,观察细胞生长情形。
（2）、配制冷冻保存溶液（使用前配制）:
将DMSO加入新鲜培养基中,最后浓度为5-10％,混合
均匀,置于室温下待用。
（预先配制冻存液:
含20%血清培养基,10%DMSO加基础培养基）
（3）、按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物,制备单细胞悬液,并计算细胞总数;
（4）、将细胞悬液以800～1000r/min离心5min,去上清夜;
（5）、向细胞沉淀物中加入冷冻保护液,轻轻吹打混匀,使细胞密度达1×
106～1×
107个/ml;
（6）、按每管1～1.5ml的量分装于冻存管内,拧紧管盖;
（7）、再冻存管上做好标记,包括细胞代号及冻存日期。
冷冻保存方法1:
冷冻管置于4oC40分钟→-20oC30分钟→-80oC16～18小时（或隔夜）→液氮槽vaporphase长期储存。
注意点:
（1）
细胞在-20度冰箱不能超过1h,以免冰晶过大破坏细胞,可跳过-20直接到-80,这样细胞活率低点。
（2）
DMSO稀释时会放出大量热,不可直接加到细胞液中要提前配制。
（3）
DMSO必须时细胞培养级别的,新买的本身是无菌的,第一次开瓶后立即少量分装于无菌瓶中,4度保存,避免重复冻容产生有毒物质。
细胞复苏（要点动作要快,轻）
（1）、调配370C～400C的温水,或将恒温水浴箱的温度调节至370C～400C;
（2）、从液氮中取出冻存管,立即投入370C～400C温水中迅速晃动,直至冻存液完全溶解;
（3）、将细胞冻存悬液转移到离心管内,加入约5ml培养液,轻轻吹打混匀;
（4）、将细胞悬液经800～1000r/min离心5min,弃上清夜;
（5）、向细胞沉淀内加入完全培养液,轻轻吹打混匀,将细胞悬液转移到培养瓶内,补足培养液进行培养。
（1）注意安全,以防冷冻管爆炸,带手套用镊子将冷冻管取出,不可用手。
（2）解冻时,液面不可超过冻存管面,以防污染。
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